超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留量

□ 李垚辛 南充市食品藥品檢驗(yàn)所

1 引言

硝基咪唑類藥物是一類應(yīng)用廣泛的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的化合物，常用藥物主要有甲硝唑、地美硝唑和洛硝噠唑等。此類藥物能殺滅和預(yù)防厭氧菌及病原蟲，可用于治療與預(yù)防家禽的滴蟲病、球蟲病、豬密螺旋體性痢疾及動(dòng)物的各種厭氧菌感染[1]。由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環(huán)類化合物存在細(xì)胞誘變性，因此具有潛在的動(dòng)物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，其藥物殘留對(duì)動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成了直接威脅，故被許多國(guó)家列為違禁藥物[2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告明確規(guī)定，甲硝唑和地美硝唑允許用作治療藥物，但不得在動(dòng)物性食品中檢出；洛硝達(dá)唑禁止使用且不得在動(dòng)物性食品中檢出[3]。羥基甲硝唑（MNZOH）是甲硝唑（Metronidazole）的代謝產(chǎn)物，羥甲基甲硝咪唑（HMMNI）是地美硝唑（Dimetridazole）和洛硝達(dá)唑（Ronidazole）的代謝產(chǎn)物。建立以上兩種硝基咪唑代謝物的分析方法對(duì)于防控動(dòng)物源性食品安全風(fēng)險(xiǎn)，監(jiān)測(cè)硝基咪唑類藥物使用及殘留情況具有重要意義。

目前，關(guān)于硝基咪唑類藥物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[4]、高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[9-12]等。雖然我國(guó)制定了一些相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，但大部分方法的檢測(cè)限相對(duì)較高，且主要針對(duì)硝基咪唑類原藥，對(duì)于其代謝物的檢測(cè)研究較少。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，分別對(duì)液相條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了雞肉中羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的檢測(cè)方法，以期為實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)和監(jiān)管硝基咪唑類藥物在食品中的濫用提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1290液相色譜、6420三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；ML203/02分析天平(0.001g)，上海Mettler Toledo公司；XS205DU分析天平(0.01mg)，上海Mettler Toledo公司；固相萃取小柱（HYPERSEP RETAIN-CX，60mg/3mL），美國(guó) Thermo公司；均質(zhì)機(jī)，中國(guó)?？乒?；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

試劑：甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨(色譜純)，美國(guó)Thermo公司；羥基甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr公司；羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)WITEGA公司；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

產(chǎn)品：市售雞肉。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品前處理

稱取均質(zhì)試樣5g（精確到0.01g）置于50mL離心管中，加入5mL飽和氯化鈉溶液和15mL乙腈，均質(zhì)提取1min，4000r/min離心5min。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至100mL雞心瓶中，再用15mL乙腈重復(fù)提取殘?jiān)鼉纱?。合并上清液至同一雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5mL0.1%甲酸水溶液和5mL正己烷，混勻離心后，棄去正己烷層，待凈化。

Retain-CX固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水、3mL0.1%甲酸水活化，將待凈化液以1～2mL/min的速度過柱，用3mL0.1%甲酸水、3mL甲醇淋洗小柱，最后用3mL5%氨水甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液于40℃氮?dú)庀麓蹈?，?mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)^0.22μm濾膜，待上機(jī)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取6份空白樣品，按最終定容濃度5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，余下按樣品處理步驟制備基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.2.3 儀器條件

2.2.3.1 液相條件

安 捷 倫ZORBAX Eclipse Plus C18色 譜 柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：40℃；洗脫程序：30%B（0～0.5min），30%～90%B（0.5～3min），90%B（3～7min）。

表2 2種化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限LOD和定量限LOQ

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：10L/min；霧化氣壓力：40psi；毛細(xì)管電壓：4000V；目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍、檢出限和定量限

將基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y建立線性回歸方程，結(jié)果表明，羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑濃度在5～100ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997。

用標(biāo)準(zhǔn)系列第1點(diǎn)測(cè)得信噪比，結(jié)果見圖1、圖2。以信噪比(S/N)=3時(shí)的含量定為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)=10時(shí)的含量定為方法的定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。

圖1 羥基甲硝唑的信噪比

圖2 羥甲基甲硝咪唑的信噪比

表3 雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑在不同添加水平下的回收率和RSD(n=6)

3.2 回收率與精密度

稱取空白樣品，添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行，得到回收率和精密度，結(jié)果見表3。羥基甲硝唑的回收率為76.0%～109.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.6%～14.5%；羥甲基甲硝咪唑的回收率為78.2%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～9.0%。

3.3 實(shí)際樣品分析

采購(gòu)了不同地點(diǎn)的10份市售雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑這兩種硝基咪唑類代謝物。

4 結(jié)論

本文采用乙腈提取，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，建立了雞肉中羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑殘留的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，適用于實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)，也為硝基咪唑類藥物監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。