白僵菌和綠僵菌不同菌株對馬尾松毛蟲的致病力

蔡守平，何學(xué)友，曾麗瓊，蘇文晶，陳文玉，陳世勇

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院、福建省森林培育與林產(chǎn)品加工利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012； 2.泉州市森林病蟲防治檢疫站，福建 泉州 362000；3.泉州森林公園管理處，福建 泉州 362000； 4.泉州臺(tái)商投資區(qū)科技經(jīng)濟(jì)發(fā)展局，福建 泉州 362100)

馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)是我國南方松林中的歷史性害蟲，僅福建省每年發(fā)生面積達(dá)數(shù)萬公頃，造成了重大損失[1]。自20世紀(jì)50年代在福建、廣東等省開始應(yīng)用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)防治馬尾松毛蟲，70年代在南方各省廣泛應(yīng)用，數(shù)十年來白僵菌成為了馬尾松毛蟲防治的主要手段，在松林的防災(zāi)減災(zāi)中發(fā)揮了重要的作用[2-3]。前人篩選出對松毛蟲具有高致病力的優(yōu)良白僵菌菌株，為馬尾松毛蟲的高效防治提供了基礎(chǔ)[4-7]，也有學(xué)者嘗試將金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)應(yīng)用于防治馬尾松毛蟲，并取得了一定的成效[8-9]。然而，不同的白僵菌和綠僵菌菌株對靶標(biāo)害蟲的致病力存在著顯著的差異[4，10-11]，同時(shí)菌株在長期的傳代培養(yǎng)中也會(huì)出現(xiàn)菌株退化、致病力下降等問題[12-14]。因此，不斷篩選高致病力和定向培育優(yōu)良菌株是白僵菌和綠僵菌應(yīng)用中重要內(nèi)容之一，也是保持和提高白僵菌和綠僵菌對靶標(biāo)害蟲防治效果的重要手段[14]。本文比較了不同來源的白僵菌和綠僵菌菌株對4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲的致病力，旨在對馬尾松毛蟲的生產(chǎn)性防治提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

供試的馬尾松毛蟲4～5齡幼蟲于2015年4月上旬采集于福建省泉州臺(tái)商投資區(qū)張坂鎮(zhèn)，試蟲采回后放入養(yǎng)蟲籠中以新鮮馬尾松針葉飼養(yǎng)1 d后，選取健康的幼蟲用于生物測定。

1.2 供試菌株

供試菌株為4株金龜子綠僵菌和7株球孢白僵菌，除MaV275、Ma4556綠僵菌菌株由英國同行贈(zèng)送外，其他菌株均由福建省林科院森保所研究人員從福建福州、安溪等地林間采集、分離、保存。所有菌株均保存于福建省林科院。供試菌株信息見表1。

1.3 不同菌株菌落生長速度及產(chǎn)孢量的測定

不同菌株的生長速度測定參考蔡守平等[11]的方法，以中心接種的方式將不同菌株接種于PPDA平板培養(yǎng)基中心，然后置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用十字交叉法每5 d測量1次菌株直徑(以縱橫直徑的平均值作為菌落直徑)，15 d后待菌落產(chǎn)孢充分后以打孔器在菌落上取一定面積的菌落，使用0.03%的吐溫-80溶液進(jìn)行稀釋，最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并換算成單位面積的產(chǎn)孢量。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，產(chǎn)孢量測定每個(gè)菌落取3個(gè)菌落塊，共重復(fù)9次。

表1 供試菌株及來源

1.4 不同菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力比較

從各菌株的菌落表面刮取分生孢子置于無菌水中，加入少量吐溫-80溶液充分振蕩，通過梯度稀釋的方法，配制成5×107孢子·mL-1的孢子懸浮液，用于接種準(zhǔn)備好的馬尾松毛蟲幼蟲。接種時(shí)，將養(yǎng)蟲籠中的馬尾松毛蟲用鑷子小心取出，在孢懸液中浸漬5 s，然后單頭放置于表面消毒過的養(yǎng)蟲盒中，并以新鮮馬尾松針葉飼養(yǎng)，將接種后24 h內(nèi)死亡的幼蟲剔除，每菌株最終接種數(shù)量見表3(因孢子懸浮液配制偏少，球孢白僵菌BbAX-02菌株接種20頭)，接種后在22～27 ℃的室溫條件下飼養(yǎng)，隔天換針葉，統(tǒng)計(jì)死亡情況，蟲死后進(jìn)行保濕培養(yǎng)觀察各菌株感染情況。用無菌水接種作為對照。生物測定試驗(yàn)于2015年4月在福建省林科院森保所實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

菌株菌落生長和產(chǎn)孢量數(shù)據(jù)使用SPSS軟件分析，多重比較使用Ducan′s法，生物測定數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，時(shí)間—死亡率機(jī)率值分析法建立致病力回歸方程，估算致死中時(shí)(LT50)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的菌落生長與產(chǎn)孢情況比較

不同綠僵菌、白僵菌菌株的菌落生長與產(chǎn)孢情況見表2。各菌株的菌落直徑間存在顯著差異，菌落直徑較大的是球孢白僵菌BbPT-01、BbTA-01菌株和綠僵菌MaFZ-04、MaV275菌株，培養(yǎng)15 d后菌落直徑均超過6 cm；而菌落直徑較小的為球孢白僵菌BbHA-10、BbHA-01菌株，培養(yǎng)15 d后菌落直徑分別為3.70、2.94 cm。各菌株的產(chǎn)孢量間也存在顯著差異，其中以球孢白僵菌BbAX-04菌株、金龜子綠僵菌MaMXTR-01、Ma4556菌株產(chǎn)孢量較大，超過1.2×108孢子·cm-2；產(chǎn)孢量最小的是綠僵菌MaV275菌株和白僵菌BbFZ-11菌株。分析發(fā)現(xiàn)，各菌株的菌落直徑和產(chǎn)孢量之間的相關(guān)性并不明顯。

表2 不同菌株的菌落直徑及產(chǎn)孢量

2.2 不同白僵菌、綠僵菌菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力比較

圖1 馬尾松毛蟲幼蟲接種不同白僵菌、綠僵菌累積死亡率變化

不同菌株的孢子懸浮液接種4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲后，其累積死亡率變化見圖1。從圖1可知，馬尾松毛蟲幼蟲接種不同菌株后的累積死亡率差異較大。接種白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的累積死亡率較高，死亡速度也快，接種12 d后，馬尾松幼蟲累積死亡率分別達(dá)到100%、90%，遠(yuǎn)比其他菌株高。接種20 d后，除白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株外，其他菌株的累積死亡率最高為66.7%(白僵菌BbTA-01)，最低僅為15%(綠僵菌MaMXTR-01)。

通過時(shí)間—死亡率機(jī)率值分析法建立各菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力回歸方程，結(jié)果見表3。各回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，P值均大于0.05，表明所建立的回歸方程是可信的。根據(jù)回歸方程估算出各菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致死中時(shí)(LT50)，白僵菌中BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50最短，分別為7.25、7.42 d；其次是BbTA-01菌株，為13.02 d。綠僵菌中LT50最短的是Ma4556菌株，LT50為13.67 d；其他菌株LT50均大于15 d，致病力較差。從感染率上來看，也是BbAX-02、BbAX-04菌株最高，分別為95%、90%，比其他菌株高。

表3 不同菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力

3 討論

不同來源白僵菌、綠僵菌的菌株對靶標(biāo)害蟲的致病力存在顯著差異，也就是說存在一定的寄主?；?。因此，在應(yīng)用白僵菌、綠僵菌進(jìn)行生物防治時(shí)，篩選出對靶標(biāo)害蟲致病力強(qiáng)的菌株是重要的基礎(chǔ)工作。本研究中，分離自馬尾松毛蟲幼蟲的白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株對4～5齡馬尾松毛蟲的致死率高，致死速度快，LT50分別為7.25、7.42 d，比其他菌株時(shí)間短，可見這2個(gè)菌株對馬尾松毛蟲的致病力最強(qiáng)，可作為優(yōu)良的生產(chǎn)菌株生產(chǎn)出產(chǎn)品，用于馬尾松毛蟲的林間防治。

蟲齡是影響白僵菌、綠僵菌對靶標(biāo)害蟲致病力的重要因素，一般蟲齡越小致病力越強(qiáng)[16-17]。馬尾松毛蟲一般6齡結(jié)繭化蛹[18]，因采集時(shí)間原因，本研究中使用的試蟲為4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲已屬于大齡幼蟲，從致病力測定結(jié)果來看，僅白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50在7 d左右；其余的菌株均超過10 d，而其中7個(gè)菌株甚至超過了15 d，說明致病力較差。其原因可能是由于菌株本身致病力的差異，也有可能是試蟲的蟲齡較大造成的[16-17]。因?yàn)橄x齡大，其自身的抗性較強(qiáng)[16-17]。王義勛等[7]篩選出的高致病力白僵菌菌株對3齡馬尾松毛蟲幼蟲LT50分別為7.63、7.62、7.88 d，與本研究中篩選出的高致病力菌株的LT50相近，可見本研究中篩選出的優(yōu)良菌株對馬尾松毛蟲幼蟲致病力較高。

雖然本試驗(yàn)篩選出了致病力較高的優(yōu)良菌株，但其快速致死效應(yīng)并不顯著，這也是生物制劑應(yīng)用經(jīng)常被詬病的問題[19-20]。因此，在篩選高致病力菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究白僵菌制劑與高效低毒農(nóng)藥的復(fù)配劑，提高殺蟲速度同時(shí)增加白僵菌的侵染率，達(dá)到增效的目的，是一個(gè)重要的研究方向，不同學(xué)者在這方面已經(jīng)開展了一些有意義的工作[19-20]。