流通池法測(cè)定消糜栓5種成分溶出度的研究

韓 煦 ，皮佳鑫 ，張 瀛 ，王舒雅 ，張 兵 ，李 雯 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193）

隨著新型栓劑的不斷涌現(xiàn)，有關(guān)于栓劑溶出度的研究也越來(lái)越受到人們的重視，溶出度在一定程度上反映了有效成分從制劑中溶出的程度，栓劑中主藥的粒度、基質(zhì)的比例等均是栓劑溶出速率的重要影響因素，因此栓劑的溶出度對(duì)于栓劑的處方設(shè)計(jì)、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面均具有重要意義[1]。國(guó)內(nèi)對(duì)于傳統(tǒng)栓劑的體外溶出度測(cè)定研究主要應(yīng)用《中華人民共和國(guó)藥典》收載的溶出度測(cè)定法槳法、籃法、小杯法[2]，然而傳統(tǒng)的溶出方法在測(cè)定栓劑溶出度方面存在許多問題，例如樣品漂浮問題、無(wú)法真實(shí)模擬腔道給藥環(huán)境等[3-4]。

流通池法是一種針對(duì)傳統(tǒng)溶出度測(cè)定方法不足建立起來(lái)的新型溶出度測(cè)定方法：其克服了傳統(tǒng)溶出度測(cè)定法方法因缺乏下沉條件所引起的偏差、在測(cè)試過程中可以改變pH條件、能夠通過溶媒的不同流動(dòng)方式真實(shí)模擬體內(nèi)的環(huán)境[5-6]。流通池法具體分為開環(huán)式和閉環(huán)式兩種，開環(huán)式流通池可以保證大量新鮮的溶出介質(zhì)不斷接觸被測(cè)樣品，所以非常適用于一些大劑量、難溶性藥物溶出度的測(cè)定；閉環(huán)式流通池是將樣品固定在特定的樣品架上，通過恒流泵入小劑量的溶出介質(zhì)，使介質(zhì)與樣品不斷接觸，適用于緩控釋制劑、植入劑、貼劑、栓劑、脂質(zhì)體等的溶出度測(cè)定[7-9]。近年來(lái)流通池法越來(lái)越廣泛成為一些新劑型藥物溶出度的測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)外許多研究相繼報(bào)道了流通池法測(cè)定溶出度可以更好的獲得體內(nèi)外相關(guān)性[10-12]，這對(duì)于通過考察藥物體外釋放特征，預(yù)測(cè)在體內(nèi)的作用特征，從而指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有至關(guān)重要的作用。

消糜栓是一種在腔道內(nèi)起局部作用，用于治療女性陰道炎的的藥物，含有苦參、黃柏、紫草、兒茶、人參莖葉總皂苷、枯礬、冰片等主要成分，具有起效快，生物利用度高等特點(diǎn)，臨床上已被應(yīng)用廣泛[13]，但相關(guān)質(zhì)量研究較為匱乏。筆者在前期建立了改良小杯法測(cè)定消糜栓的溶出度實(shí)驗(yàn)方法，并測(cè)定了苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿5種指標(biāo)成分。筆者進(jìn)一步應(yīng)用流通池法進(jìn)行中藥栓劑消糜栓5種指標(biāo)成分的溶出度研究，以考察流通池法對(duì)于消糜栓溶出度測(cè)定的適應(yīng)性，評(píng)價(jià)不同溶出介質(zhì)、不同流速下消糜栓中指標(biāo)成分的溶出度特性。

1 儀器與材料

LC-20A島津高效液相色譜儀（日本島津公司），Sotex CE7 Offline流通池溶出儀（瑞士Sotex公司）；BPll0S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；XP205十萬(wàn)分之一天平（Mettler Toledo）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore）；SB-3200D數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。消糜栓（通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：171101），苦參堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110805-200508），兒茶素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110877-201203），表兒茶素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110878-200102），鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212），人參皂苷Re對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110754-201324），其他化學(xué)試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出介質(zhì)中5種成分的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0．05%磷酸水（B），梯度洗脫（0-18 min，5%A→16%A；18-20 min，16%A→24%A；20-41 min，24%A；41-43 min，24%A→85%A；43-48 min，85%A；48-50 min，85%A→5%A；50-60 min，5%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm 和 265 nm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿適量，加甲醇適量溶解，配制成每1 mL含苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷 Re、鹽酸小檗堿分別為 0．3、4．82、3．53、1．31、0．07 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取“2．1．2”配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成系列濃度，按“2．1．1”色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的線性方程分別為Y=20 653X-6 041．3（r=0．999 8），Y=3 762．5X+24 090（r=0．999 6），Y=3 735．8X+18 582（r=0．999 5），Y=2 140．7X+4 162．2（r=0．999 7），Y=45 027X-5 587．9（r=0．999 8），線性范圍分別為 1．02～30．02 μg/mL、15．06～481．96 μg/mL、11．05～353．44 μg/mL、4．10～131．11 μg/mL、0．26～7．2 μg/mL。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2．1．2”配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成一定濃度，在“2．1．1”色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定色譜峰面積，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的 RSD%（n=6）分別為 1．21%，1．44%，1．37%，1．14%，1．79%。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取消糜栓1粒（3 g），制備溶出液，取 30 min 的溶出液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h在“2．1．1”色譜條件下測(cè)定色譜峰面積，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的RSD%（n=6） 分別為 1．90%、0．31%、0．40%、2．89%、2．85%。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取3 g消糜栓空白基質(zhì)，置于溶出杯中，加入200 mL超聲脫氣的蒸餾水，37℃水浴下加熱，攪拌1 h，作為空白基質(zhì)溶液。取“2．1．2”配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液，以空白基質(zhì)溶液稀釋，制成低、中、高3種不同濃度的混合供試品溶液（n=3）；同時(shí)用甲醇溶液稀釋，配制相同濃度的混合對(duì)照品溶液（n=3）。按照“2．1．1”的色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率（n=3），結(jié)果見表1。

2.2 溶出度檢查法 采用流通池閉合系統(tǒng)裝置，每次實(shí)驗(yàn)取消糜栓樣品3粒，置于錐形部裝滿1 mm玻璃珠的流通池內(nèi)，分別以水（超聲脫氣）和醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4．5）200 mL作為溶出介質(zhì)，在流通池內(nèi)以層流方式流動(dòng)，溫度設(shè)定為37℃。分別設(shè)定流速為 4、8 和 16 mL/min，于 15、30、45、60、75、90、105、120、150、180 和 240 min 取樣 2 mL，濾過，按照“2．1．1”的色譜條件測(cè)定峰面積，應(yīng)用外標(biāo)一點(diǎn)法，在203 nm計(jì)算苦參堿、人參皂苷Re的溶出量（mg），在206 nm計(jì)算兒茶素、表兒茶素、鹽酸小檗堿的溶出量（mg）。

在8 mL/min流速下，考察兩種不同溶出介質(zhì)水、醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）對(duì)消糜栓中苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的溶出度測(cè)定的影響，選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：30、120、240 min的溶出量，利用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析。在兩種介質(zhì)中消糜栓的平均溶出量（mg）及t檢驗(yàn)分析的顯著性結(jié)果見表2所示。

表2 兩種溶出介質(zhì)中消糜栓5種成分溶出量及t檢驗(yàn)顯著性分析（±s）

表2 兩種溶出介質(zhì)中消糜栓5種成分溶出量及t檢驗(yàn)顯著性分析（±s）

成分 水中溶出量（mg）苦參堿 1.15±0.10 1.29±0.19 0.330 1.98±0.03 2.48±0.15 0.005 2.24±0.05 2.59±0.11 0.006兒茶素 49.19±2.56 48.03±3.35 0.658 79.19±2.01 83.42±4.13 0.185 88.84±1.18 86.50±2.12 0.171表兒茶素 7.85±0.51 7.63±0.67 0.675 13.07±0.37 13.78±0.63 0.167 13.59±1.09 13.83±0.76 0.774人參皂苷 Re 3.49±0.69 3.01±0.38 0.348 7.53±1.47 6.42±1.24 0.375 8.98±0.35 6.61±0.94 0.015鹽酸小檗堿 0.46±0.06 0.43±0.07 0.594 1.03±0.07 0.82±0.07 0.016 1.05±0.06 0.88±0.06 0.006 n 3 3 3 3 3時(shí)間（min）30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240酸性介質(zhì)中溶出量（mg） P

結(jié)果顯示，兩種溶出介質(zhì)對(duì)于3個(gè)時(shí)間點(diǎn)下消糜栓中兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re的溶出無(wú)顯著影響（P＞0.05），對(duì)于苦參堿、鹽酸小檗堿在30 min無(wú)顯著影響（P＞0.05），在 120 min、240 min 具有顯著影響（P＜0.01）。

以水為介質(zhì)時(shí)，在3種不同流速下，根據(jù)消糜栓樣品中主要成分的溶出量（mg）繪制溶出曲線，結(jié)果如圖1-5所示。

由圖1-5的溶出曲線可知，消糜栓5種指標(biāo)成分在流速為4、8和16 mL/min時(shí)溶出行為不同，在4、8 mL/min流速下溶出速率較慢；當(dāng)流速為16 mL/min各成分的溶出速率最快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流速對(duì)于消糜栓中苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的溶出行為具有明顯的影響，且流速越大，溶出速度越快。

圖1 水為介質(zhì)時(shí)不同流速下苦參堿的溶出曲線（n=3）

圖2 水為介質(zhì)時(shí)不同流速下兒茶素的溶出曲線（n=3）

圖3 水為介質(zhì)時(shí)不同流速下表兒茶素的溶出曲線（n=3）

圖4 水為介質(zhì)時(shí)不同流速下人參皂苷Re的溶出曲線（n=3）

圖5 水為介質(zhì)時(shí)不同流速下鹽酸小檗堿的溶出曲線（n=3）

以水為溶出介質(zhì)時(shí)，在不同流速下，選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：30、120、240 min各成分的溶出量，利用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示流速的變化對(duì)于這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)下苦參堿、兒茶素、表兒茶素3種成分有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)于人參皂苷Re和鹽酸小檗堿，在30 min具有顯著影響（P＜0.05），在 120 min及240 min無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

流通池法測(cè)定消糜栓溶出度條件的改變主要有改變流速、改變?nèi)苊搅鲃?dòng)方式，改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)以及改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)體積等方面[14]。根據(jù)前期對(duì)于消糜栓傳統(tǒng)溶出度測(cè)定方法的研究結(jié)果表明，槳法、籃法測(cè)定消糜栓溶出度時(shí)，人參皂苷Re、鹽酸小檗堿在溶劑中的濃度較低，不利于測(cè)定，采用溶出介質(zhì)體積較小的小杯法更能反映消糜栓各指標(biāo)成分的溶出特性，且滿足漏槽條件，在本實(shí)驗(yàn)中流通池法的溶出介質(zhì)體積選用小杯法所用體積200 mL。

流通池法中溶媒的流動(dòng)方式主要有層流和湍流兩種[15-16]。層流方式是在流通池的錐形部放置1 mm的玻璃珠，從而使溶媒介質(zhì)在流通池內(nèi)均勻的流動(dòng)，層流可以使被測(cè)樣品均勻釋放，不易產(chǎn)生突釋；湍流方式即不加入玻璃珠，樣品能夠產(chǎn)生突釋的效果，故此種流動(dòng)方式一般適用于一些難溶性藥物的溶出度測(cè)定。層流方式能夠更加真實(shí)的模擬陰道環(huán)境，在本實(shí)驗(yàn)中采用層流方式。

本文選擇苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿作為評(píng)價(jià)消糜栓溶出度的指標(biāo)性成分能夠客觀真實(shí)的反應(yīng)藥物的溶出性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸小檗堿的溶出量較低，這可能是由于鹽酸小檗堿是一種異喹啉類生物堿，其在水中的溶解度比較小[17]。本實(shí)驗(yàn)中，選擇了 30、120、240 min 3 個(gè)時(shí)間段的溶出量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，主要是因?yàn)?0 min的溶出量能夠具有代表性的反映溶出開始時(shí)的溶出速率，120 min的溶出量則能夠反映溶出趨于完全時(shí)的溶出情況；240 min時(shí)的溶出量則反映了藥物整個(gè)溶出過程的最終溶出量。

表3 3種流速下消糜栓5種成分溶出量的單因素方差分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流速對(duì)于測(cè)定消糜栓5種成分的溶出具有顯著的影響。流速是流通池法中一個(gè)及其重要的參數(shù)，故在每次實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)當(dāng)校正流速以獲得良好的釋放曲線從而評(píng)價(jià)其釋放行為。本實(shí)驗(yàn)中選擇的兩種溶出介質(zhì)水以及醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）對(duì)于苦參堿、鹽酸小檗堿的溶出具有顯著影響，對(duì)于其他3種成分不具有顯著影響，這可能與消糜栓的處方組成、主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有關(guān)[18]。因此在流通池法測(cè)定藥物的溶出度試驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)藥物的處方特點(diǎn)、藥理活性等選擇具體的溶出介質(zhì)。