脈沖激光刺激聽神經(jīng)機制的研究進展

張建張開銀邱建新余紹宸姚昆*

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院（阜陽236000）

2阜陽師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院（阜陽236000）

聾病在世界范圍內(nèi)發(fā)生率較高，可由遺傳、感染、藥物及免疫等多種因素引起，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有3.6億人患有聽力障礙，給社會和家庭帶來了沉重負擔[1]。對于輕度-中度聽力下降患者，可通過佩戴助聽器改善聽力，但對于重度和極重度感音神經(jīng)性聾患者，目前只能通過電子耳蝸植入獲得聽力。電子耳蝸通過植入電極，使用一定幅度電流脈沖刺激耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neurons,SGNs)，產(chǎn)生聽覺，是目前重度及極重度聽力下降患者的主要治療方式，幫助患者提高安靜環(huán)境下言語識別能力。但由于電子耳蝸的電流擴散效應(yīng)明顯，且其電極數(shù)目少和空間選擇性低，影響了患者的言語識別能力進一步提高[2,3]，人們早就發(fā)現(xiàn)許多耳蝸植入患者在噪音環(huán)境下言語識別能力改善有限，且不能欣賞音樂[4]。

激光刺激聽神經(jīng)是一種依賴脈沖紅外激光能夠可逆性地刺激并引發(fā)動作電位的新型聲電轉(zhuǎn)化方法，具有空間選擇性高、沒有刺激偽跡等優(yōu)點[5]，已逐步成為近年來國內(nèi)外研究重點。已在包括聽神經(jīng)、視神經(jīng)和坐骨神經(jīng)等[6-9]多種神經(jīng)刺激實驗中得到證實。其中Richter等[10]和Lenarz等[11,12]曾用脈沖激光分別刺激沙鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和骨螺旋板，記錄激光刺激產(chǎn)生的耳蝸復(fù)合動作電位（OCAP)和聽性腦干反應(yīng)（OABR），結(jié)果均表明脈沖激光能夠觸發(fā)神經(jīng)沖動。在空間選擇性研究方面，Richter實驗室曾分別采用免疫組織化學(xué)染色法[5]、光音掩蔽法[13]和下丘測量法[13,14]，證實了脈沖激光誘發(fā)聽神經(jīng)沖動具有良好的空間選擇性。

1 激光刺激聽神經(jīng)引起神經(jīng)沖動的機制

目前認為首先是由于激光輻射引起局部溫度瞬間升高[15-18]。具體過程較為復(fù)雜，一些學(xué)者主張光聲效應(yīng)，認為激光輻射組織產(chǎn)生壓力波，刺激耳蝸毛細胞產(chǎn)生神經(jīng)沖動[19-21]，在Thompson AC等[22]的研究中，作者分別采用光刺激、聲刺激和電刺激研究三種刺激方式在正常、急性致聾（打開蝸窗和前庭窗，通過圓窗及前庭窗輕輕吸入新霉素(10 mg∕ml-1)，使蝸頂區(qū)暴露于新霉素，至少重復(fù)三次，以確保徹底的耳毒素暴露。）和慢性致聾（實驗前4周，在氣體麻醉下，聯(lián)合使用呋塞米(130 mg∕kg）靜脈注射和卡那霉素(420 mg∕kg）皮下注射，測定動物聽力，以聽閾提高50分貝作為極重度聾的標準。)豚鼠中引起的聽性腦干反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，在兩種致聾模型豚鼠致聾前將光纖插入豚鼠耳蝸中，即使光纖方向不朝向螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（SGNs)，可引出與聲刺激相似的波形圖；但在致聾后，即使光纖方向朝向SGNs，仍不能引出光刺激腦干誘發(fā)電位（oABR)。而此時若使用電極刺激致聾后豚鼠耳蝸，卻可引出電刺激腦干誘發(fā)電位（eABR)，作者認為，激光刺激產(chǎn)生聽覺沖動需要有功能的毛細胞參與，激光輻射引起組織產(chǎn)生壓力波震動毛細胞，產(chǎn)生神經(jīng)沖動。Rettenmaier A[23]等采用膜片鉗技術(shù)，分別對離體Sprague-Dawley大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、轉(zhuǎn)染CLC-4通道蛋白的HEK 293細胞和未轉(zhuǎn)染的HEK 293細胞（對照組）進行了單細胞記錄，結(jié)果表明，激光刺激導(dǎo)致細胞產(chǎn)生內(nèi)向電流，這些電流大小與激光脈沖能量成線性關(guān)系，導(dǎo)致細胞去極化。但這種去極化效應(yīng)很小，在波長為1450 nm的25μJ脈沖能量照射下，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的去極化效應(yīng)最大僅為(1.2±0.9)mV，不足以引起動作電位。Xia[24]等通過研究證實激光刺激可以在耳蝸內(nèi)可以產(chǎn)生壓力波，當脈沖激光能量為17μJ/pulse刺激耳蝸時，外耳道壓力為43.5dB(re 20 uPa)，計算出相應(yīng)的內(nèi)耳壓力約為78.5dB(re 20 uPa)；在能量為164μJ∕pulse脈沖激光下，耳道內(nèi)壓力平均為63 dB(re 20 uPa)，內(nèi)耳壓力為98 dB(re 20 uPa)，而且，壓力值大小與光束路徑是否朝向螺旋神經(jīng)節(jié)細胞無關(guān)。

光熱效應(yīng)主張者認為激光輻射導(dǎo)致神經(jīng)組織局部溫度升高，引起神經(jīng)組織表面發(fā)生一系列變化，產(chǎn)生動作電位（AP)。瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道（TRP）的激活是引發(fā)AP的重要環(huán)節(jié)，免疫組化染色檢查發(fā)現(xiàn)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞表達TRPV-1和TRPV-4兩種離子通道[25,26]。Albet[26]等采用不同類型的離子通道阻斷劑，用細胞膜片鉗技術(shù)記錄了視神經(jīng)和前庭神經(jīng)細胞在1875毫秒脈沖激光刺激下的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TRPV-4離子通道是響應(yīng)激光刺激的主要通道。當激光輻照細胞時，光子被吸收在聽覺神經(jīng)組織內(nèi)引起局部溫度升高，進而觸發(fā)了TRPV-4離子通道，使Ca2+內(nèi)流，引起細胞膜去極化，激活鈉離子通道，誘發(fā)鈉離子動作電位，產(chǎn)生神經(jīng)沖動，國內(nèi)也有研究與此相符[27]。Suh,Eul[28]采用基因敲除方法制造出缺乏TRPV-1通道小鼠模型進行實驗，發(fā)現(xiàn)，當激光照射該類小鼠耳蝸時，不能引起聽神經(jīng)沖動?？梢姡琓RPV通道介導(dǎo)聽神經(jīng)紅外激光誘發(fā)神經(jīng)沖動反應(yīng)。

此外，Beier HT[29]等使用原代海馬神經(jīng)元進行實驗，采用YO-PRO-1和PI熒光標記的方法，發(fā)現(xiàn)激光輻射神經(jīng)元時，破壞了細胞膜的穩(wěn)定性，在細胞膜表面形成納米孔道，允許鈣離子內(nèi)流，激活磷脂酰肌醇（PIP2）通路，而PIP 2是M型KCNQ鉀通道活性的中心決定因子[30]，這些通道負責維持神經(jīng)元的靜息膜電位，阻斷后可引起持續(xù)的膜去極化。Young[31]等在聽覺正常、聽力受損和聽力嚴重受損的豚鼠中進行了掩蔽實驗。在正常聽力動物中，激光反應(yīng)可以被聲刺激所掩蔽，隨著豚鼠聲刺激閾值升高，聲刺激對光刺激掩蔽效應(yīng)逐漸減弱。在聽力受損的豚鼠中聲刺激閾值顯著提高，而光刺激閾值保持不變。通過光-聲掩蔽實驗，作者認為激光輻射引起神經(jīng)沖動是激光與神經(jīng)直接作用的效果，而不是光熱效應(yīng)。

可見，光聲效應(yīng)與光熱效應(yīng)主要區(qū)別點在于激光輻射引起神經(jīng)沖動是否需要毛細胞的參與，因各個實驗室及實驗人員的固有差異，很難做到實驗條件的一致性。在豚鼠致聾模型制作上，多采用耳蝸內(nèi)注入耳毒性藥物的方法致聾，以聲刺激（聲壓級多在80dB以上）不能引出豚鼠聽性腦干誘發(fā)電位為判定標準[32]，但致聾豚鼠模型耳蝸內(nèi)是否有功能性毛細胞殘存，仍不明確。Tan[33]等采用基因工程方法制作出三種致聾小鼠模型：1.Atoh1-CKO型:所有外毛細胞和大部分內(nèi)毛細胞消失，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（SGNs）消失；2.Neurog1 KI型：保留大部分毛細胞，但其靜纖毛未分化，沒有聽力殘存；3.Vglut3-∕-型：有正常數(shù)量的毛細胞和SGNs，但卻沒有正常的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。對于Atoh1-CKO型小鼠，由于缺乏毛細胞和SGNs等耳蝸正常結(jié)構(gòu)，實驗中光、聲刺激均未能引起神經(jīng)沖動。對于Neurog1 KI型小鼠，當使用波長為1860nm，脈寬為100μs，輻射量為12.3μJ∕pulse的激光刺激，光纖朝向小鼠耳蝸頂轉(zhuǎn)時，可以記錄到光致聽性反應(yīng)（oABR)，其波形與正常小鼠在聲刺激條件下產(chǎn)生的聽性反應(yīng)（aABR)相似，幅值達1.8±0.6μV，當光纖朝向耳蝸中轉(zhuǎn)或底轉(zhuǎn)時，oABR記錄值減小甚至無波形引出。對于Vglut3-∕-型小鼠，采用激光刺激時，從耳蝸底轉(zhuǎn)至頂轉(zhuǎn)均可記錄出oABR，誘發(fā)的oABR幅值大于Neurog1 KI型，但小于對照組（正常小鼠）。對這些小鼠進行同步X射線微CT成像發(fā)現(xiàn)，Atoh1-CKO型小鼠耳蝸的任何位置均未見毛細胞，基底膜扁平，Corti器官（OC）和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞缺失。Neurog1 KI型小鼠在耳蝸頂，觀察到毛細胞和OC完整的結(jié)構(gòu)，而從耳蝸的中部至底部位，SGN逐漸消失。Vglut3-∕-型小鼠在耳蝸全程均能看到毛細胞和SGN存在，以及連接毛細胞和腦干神經(jīng)元的神經(jīng)纖維，但其體積較對照組更小，顆粒更多。這些結(jié)果與電生理記錄高度一致，因為光刺激引起的神經(jīng)反應(yīng)與SGN的存在空間上是相關(guān)的。作者認為，激光刺激引起致聾動物產(chǎn)生聽覺反應(yīng)需要靶結(jié)構(gòu)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存在，內(nèi)毛細胞與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元之間的突觸傳遞是不必要的。

激光刺激產(chǎn)生神經(jīng)沖動機制復(fù)雜，也可能是多重因素共同作用的結(jié)果，關(guān)添[34]等通過采用光刺激三維仿真實驗和活體豚鼠實驗，發(fā)現(xiàn)激光刺激既可引起溫度上升，也可引發(fā)光聲效應(yīng)，產(chǎn)生雙極性脈沖聲波，而980nm激光刺激豚鼠產(chǎn)生了2個聽神經(jīng)復(fù)合動作電位，且其幅值不同，前者大于后者，綜合考慮實驗結(jié)果，作者認為脈沖激光刺激聽神經(jīng)可能是光熱效應(yīng)和光聲效應(yīng)的疊加結(jié)果。

2 展望

激光刺激誘發(fā)聽神經(jīng)沖動的研究逐漸深入，但用于研制光學(xué)人工耳蝸仍有許多問題亟待解決。

（1）激光參數(shù)：脈沖激光參數(shù)主要包括波長、頻率、輻射量等，目前研究的激光波長多在1.85μm和1.94μm左右，刺激頻率多在300Hz以下，何種頻率和波長刺激聽神經(jīng)效果最佳，還有待進一步研究。

（2）目前所進行的動物實驗均為單光纖激光刺激耳蝸，有必要開展多光纖植入研究，光纖之間是否會相互影響，還需在動物實驗中進一步證實。

（3）目前研究均為動物實驗，尚未進行有意義的臨床實驗，激光刺激引起動物耳蝸溫度升高，但在人體耳蝸是否會產(chǎn)生類似效果，其安全性和可行性如何，仍需進一步研究。

（4）電子耳蝸技術(shù)成熟，光電聯(lián)合刺激聽神經(jīng)能否具有更好的效果，這可能也是未來研究的重點方向。

（5）光遺傳學(xué)利用藍光照射聽神經(jīng)表達的光敏感通道蛋白（ChR2）（該蛋白通過基因載體轉(zhuǎn)入聽神經(jīng)獲得），理論上可增加聲音編碼的分辨率[35]，也將是未來研究的一個重點。