牙鲆飼料中異亮氨酸與纈氨酸的交互作用對消化酶和部分免疫酶的影響

■王 旭 周 婧 薛曉強 劉 霞 陳明康 于海霞 姜志強 韓雨哲

(大連海洋大學農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室遼寧省北方魚類應用生物學與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬鰈形目、鲆科、牙鲆屬，是我國北方一種名貴的經(jīng)濟魚類。許多研究表明魚類的生長性能、飼料利用與飼料氨基酸的水平存在著密切的聯(lián)系[1]。異亮氨酸與纈氨酸是水產(chǎn)動物體內不能合成必須從日糧中獲得的氨基酸即必需氨基酸（EAA），均屬于支鏈氨基酸（BCAA），具有調節(jié)蛋白質代謝，增強免疫力等重要生理功能[2]。目前對牙鲆關于支鏈氨基酸的研究多集中在對某一特定氨基酸需求量的研究[3]，關于氨基酸間交互作用對牙鲆消化酶和免疫酶的研究僅見近兩年報道[4]。本文就飼料中添加異亮氨酸和纈氨酸產(chǎn)生的交互作用對牙鲆消化酶和免疫相關酶活力的影響進行研究，為研制牙鲆營養(yǎng)平衡的人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料以酪蛋白、明膠、魚粉、混合氨基酸（包被材料為卡拉膠、羧甲基纖維素、ɑ-淀粉，分別占飼料2.5%、4.4%、14.8%）為主要蛋白源，魚油、大豆卵磷脂為主要脂肪源制成基礎飼料。設2個Ile水平（分別占干物質的0%和2%），并將其分別與3個Val水平(分別占干物質的0%、0.83%和2.27%)交互制成6種試驗飼料分別為：低水平的Ile與低水平的Val(LI-LV組)、中水平的Val（LI-MV組）、高水平的Val（LI-HV組）相組合，高水平的Ile與低水平的Val（HI-LV組)、中水平的Val（HI-MV組）、高水平的Val（HI-HV組）相組合。在飼料中添加晶體氨基酸混合物的最適氨基酸比例[5-6]，以全魚蛋白氨基酸組成為參考，并參考已知牙鲆的氨基酸的需求[6-7]的研究而配制（見表1）。由于晶體氨基酸易溶于水，為了防止浸出損失，將晶體氨基酸進行預包被[7]。將包被氨基酸與其他飼料原料攪拌均勻后，用小型飼料制粒機（常州品正干燥設備有限公司）將飼料制成兩種規(guī)格（粒徑為1.4 mm和3.5 mm）的飼料，飼料在40℃烘箱下烘至水分為18%并儲存至-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩；A飼料配方見表2，試驗飼料的營養(yǎng)成分含量及氨基酸組成見表3。

表1 CAA混合物的含量（g/100 g，干重）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗用魚購自大連天正實業(yè)有限公司，魚苗先在大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點試驗室水槽（1 000 L）中暫養(yǎng)2周以適應試驗室環(huán)境，馴化期間投喂對照組飼料。暫養(yǎng)結束后挑選體格健壯、外觀正常、大小均一的試驗魚進行分組。每個水槽放入初始體重為(3.57±0.05)g的試驗魚20尾。一共6個處理，每個處理做3個平行，共需要18個水槽。將試驗魚放入200 L的藍色圓槽中進行飼養(yǎng)，本試驗為流水養(yǎng)殖，水流速為0.9 L/min，自然海水經(jīng)沙濾后使用。每天上午8點和下午5點進行兩次投喂，投喂至表觀飽食。每次投喂后1 h收集殘餌并同時清理糞便，每天對試驗魚進行12 h光照12 h黑暗處理。24 h連續(xù)充氣，每天測定水溫（n=60）、pH值和鹽度，試驗期間水溫為(24.3±0.8)℃，pH值和鹽度為分別為(7.8±0.2)和(31.9±0.2)，試驗周期為60 d。

表2 基礎飼料配方（%干物質）

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結束后，禁食24 h。每桶魚隨機選取8尾魚，分別稱取每條魚的體重，在冰浴上用消毒過的解剖工具進行解剖，分別取魚的肝臟和中腸置于離心管后放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存。用于測定肝臟組織免疫酶和抗氧化酶及腸道消化酶的測定。

1.4 樣品測定指標與方法

準確稱取組織樣品，在4℃冰箱緩溶，肝臟按質量體積比1∶9（w/v）的比例加入0.9%的生理鹽水，腸道的質量體積比為1∶4(w/v)加入生理鹽水制成組織勻漿。在10 ml的勻漿器中研磨成勻漿液，勻漿液以2 500 r/min離心10 min，取上清液保存在-80℃冰箱備用。肝臟抗氧化酶：總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）；肝臟免疫酶：堿性磷酸酶（AKP）；腸道消化酶：蛋白酶（protease）、淀粉酶（amylase）、脂肪酶（lipase）均使用南京建成生物有限公司試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示，使用SPSS19.0軟件進行雙因素方差分析，得到異亮氨酸與纈氨酸的交互作用的顯著性（即2個水平的異亮氨酸×3個水平的纈氨酸），若交互作用顯著則進行單因素（One-way ANOVA）方差分析，并采用Tukey進行多重比較法對數(shù)據(jù)進行處理，顯著水平為P＜0.05。

表3 試驗飼料的營養(yǎng)成分含量及氨基酸組成

2 結果

2.1 飼料中異亮氨酸與纈氨酸不同水平的添加量對

牙鲆肝臟抗氧化酶和免疫酶活力的影響(見表4)

由表4可知，總抗氧化（T-AOC）與超氧化物歧化酶（SOD）對不同水平的異亮氨酸與纈氨酸有極顯著的交互作用（P＜0.01），T-AOC與SOD的酶活力在低異亮氨酸水平時均隨纈氨酸水平的升高而降低，而在高異亮氨酸水平時T-AOC酶活力隨纈氨酸水平的增高先降低而后升高，最高酶活力為LI-LV組顯著高于除LI-MV組外其他組，SOD則隨纈氨酸水平的升高而升高且HI-HV組的酶活力最高。而過氧化氫酶（CAT）在低異亮氨基酸組隨著纈氨酸增高先升高而后降低，即LI-MV組活力最高且顯著高于其他組，在高異亮氨基酸組則相反。

表4 飼料中不同水平的異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆肝臟抗氧化酶和免疫相關活力的影響

堿性磷酸酶（AKP）對不同水平的異亮氨酸與纈氨酸有交互作用（P＜0.05），低異亮氨酸水平時隨纈氨酸的增高先降低而后升高，在高異亮氨酸水平時則逐漸升高。

2.2 飼料中異亮氨酸與纈氨酸不同水平的添加量對牙鲆消化酶活力的影響(見表5)

表5 飼料中異亮氨酸與纈氨酸不同水平的添加量對牙鲆腸道消化酶活力的影響（U/mg prot.）

試驗結果表明，異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆腸道消化酶活力有極顯著交互作用（P＜0.01）。在低異亮氨酸水平時腸道蛋白酶，隨纈氨酸的升高呈現(xiàn)出先增高而后降低的趨勢，在LI-MV水平時酶活力達到最高值，且顯著高于其他組。淀粉酶在HI-LV組活力最高，隨纈氨酸水平的增高反而會降低酶活力。脂肪酶在高異亮氨酸水平與低纈氨酸水平交互時其酶活最低，而后隨纈氨酸水平的增高脂肪酶活力則是逐漸增高，且在高水平異亮氨酸與高水平纈氨酸交互時脂肪酶活力最高。

3 討論

3.1 飼料中不同水平的異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆肝臟抗氧化酶和免疫酶活力的影響

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)在生物機體免受損傷方面發(fā)揮重要作用，是生物機體內主要清除機體自由基的抗氧化酶，從而維持細胞和機體正常的生理活動[3]。本試驗結果表明異亮氨酸與纈氨酸有顯著的交互作用，且顯著影響牙鲆肝臟T-AOC、SOD和CAT的活力。抗氧化酶在低異亮氨酸水平時隨纈氨酸含量的增高抗氧化酶活力反而會降低（除CAT的LI-MV組外），這表明在低異亮氨酸水平時纈氨酸對抗氧化酶頡頏作用。在高異亮氨酸水平時SOD活力與纈氨酸水平成正相關，其HI-HV組活力最高。這表明不同水平的Ile與Val對牙鲆抗氧化酶活力有明顯的交互作用，且適宜水平異亮氨酸與纈氨酸可顯著提高牙鲆肝臟抗氧化酶活性等非特異性免疫功能。這與異亮氨酸在吉富羅非魚與建鯉等水產(chǎn)動物研究結果相似[8-9]。這可能由于Ile水平能夠改善Leu（生酮氨基酸）與Ile（生糖兼生酮氨基酸）、Val（生糖氨基酸）3種支鏈氨基酸的平衡關系，當異亮氨酸不足時，打破支鏈氨基酸間的平衡，限制了同為支鏈氨基酸的纈氨酸的利用，進而影響牙鲆體內酶的代謝，使SOD酶活力降低。相反在高異亮氨酸水平時隨纈氨酸水平的增高使機體內的支鏈氨基酸逐漸達到平衡，進而促進蛋白質合成和抑制其分解的效果，并在一定程度上提高機體免疫力及SOD酶活力。

堿性磷酸酶（AKP）是一種通過寡糖磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上的結合蛋白，在生物體可直接參與磷酸基團的轉移和代謝的生理過程，且參與體內的鈣、磷代謝，維持體內適宜的鈣磷比例[10]。根據(jù)本試驗研究結果發(fā)現(xiàn)Ile與Val在一定程度可影響牙鲆肝臟AKP活力，AKP在低異亮氨酸水平時其活力隨纈氨酸水平的增高先降低而后升高，在高異亮氨酸水平時則逐漸升高，且在HI-HV組酶活性最高。說明飼料中不同水平的異亮氨酸和纈氨酸顯著影響牙鲆AKP酶活力，在適宜水平時顯著提高AKP酶活性。這與孫玉軒[8]和武文一[11]在飼料中分別添加不同水平的異亮氨酸和纈氨酸對吉富羅非魚消化酶和免疫酶活力研究結果一致。試驗結果表明異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆肝臟AKP存在顯著交互作用，且高水平的異亮氨酸與高水平的纈氨酸可起協(xié)同增強作用，使牙鲆肝臟AKP酶活性達到最大。當異亮氨酸與纈氨酸在HI-HV水平時使支鏈氨基酸間達到平衡，促進了機體的免疫細胞和體內酶的分泌，從而提高牙鲆機體的免疫力。

3.2 飼料中不同水平的異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆腸道消化酶活力的影響

魚類的生長以及消化能力與腸道消化酶活力關系密切，酶活越高越有助于消化[12]，從而可促進魚類的生長。黃忠等[13]研究表明飼料中適宜水平的異亮氨酸可顯著提高卵形鯧鲹腸淀粉酶和胃蛋白酶的活性；Luo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，適宜的纈氨酸水平可以促進草魚顯著提高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性；王莉蘋[15]發(fā)現(xiàn)亮氨酸與異亮氨酸的交互作用可顯著影響牙鲆腸道消化酶活力。本試驗研究結果發(fā)現(xiàn)異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆腸道消化酶有極顯著交互作用（P＜0.01），在低異亮氨酸水平與高水平的纈氨酸交互作用時可顯著降低腸道消化酶活力。這是因為Ile與Val缺乏或過量造成的飼料氨基酸不平衡從而會顯著抑制牙鲆消化酶的活性。而腸道蛋白酶活力在低異亮氨酸水平時隨纈氨酸水平的增高先增高而后降低且在IL-MV組時酶活力達到最高值，在高異亮氨酸水平時則無組間差異性，這可能是因為當Ile含量過量或不足時，纈氨酸在蛋白質合成中發(fā)揮很重要的功能，適宜的纈氨酸含量能夠影響魚類腸道微生物菌群的平衡，從而提高腸道消化酶的活力[16]。在高異亮氨基酸水平時脂肪酶則隨纈氨酸水平的增高而逐漸增高，其中HI-HV組活力最高（P＜0.05）。這可能是因為高水平的Ile和Val促進了BCAA之間的平衡，BCAA可為谷氨酸及谷酰胺的合成提供氮源和碳源，為促進脂肪酶的分泌[17]，提供了碳源和氮源[18]，但這兩種氨基酸的交互作用對魚類機體內免疫代謝機制的具體影響，仍有待深入研究。

4 結論

①異亮氨酸與纈氨酸對牙鲆體組織消化酶和免疫酶有顯著交互作用，可顯著影響牙鲆腸道消化酶和肝臟免疫相關酶的活性。②在Ile 2%與Val 2.27%交互作用時牙鲆脂肪酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶酶活力均達到最高值。這表明高水平的異亮氨酸（2%）與高水平纈氨酸（2.27%）可起協(xié)同增強作用，提高牙鲆肝臟免疫酶活性和腸道消化酶活性。