蛙源抗菌肽MagaininⅡ?qū)π笄莩Ｒ姴≡志钚耘c體外穩(wěn)定性測定

■徐欣欣 施平偉 張海文，2*

（1.海南大學熱帶農(nóng)林學院，海南?？?70228；2.海南大學熱帶動物繁育與營養(yǎng)學實驗室，海南?？?70228）

抗生素（Antibiotic）是微生物產(chǎn)生的一種生物活性物質(zhì)，常常作為藥物用于人類和動物的疾病預(yù)防、疾病治療和生長促進[1]。在養(yǎng)殖過程中，獸用抗生素常被添加到動物日糧中，以達到提高動物生長速度和飼喂效率[2]，抗生素能夠起到抑制或殺滅病原菌的作用。目前在我國養(yǎng)殖業(yè)普遍存在濫用抗生素的情況，由此導(dǎo)致的藥物殘留、耐藥性以及環(huán)境污染等問題亟待解決，尋找能夠替代抗生素的物質(zhì)十分重要?？咕模ˋntimicrobial Peptides，AMPs），是由生物體特定基因編碼產(chǎn)生的，能夠?qū)Σ≡⑸锏娜肭制鸬椒烙饔玫囊活愋》肿与腫3]?？咕淖钤绫话l(fā)現(xiàn)是在1974年，瑞典科學家Boman等在惜古比天蠶體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的物質(zhì)[4]，并于1981年進一步試驗后，將其命名為天蠶素（cecropins）[5]，之后科學家便紛紛對抗菌肽進行研究?？咕腗againinⅡ是由Zasloff等在非洲爪蟾(Xenopus laevis)皮膚中發(fā)現(xiàn)的[6]。本試驗通過研究抗菌肽MagaininⅡ?qū)π笄莩Ｒ姴≡目咕钚?，以此為基礎(chǔ)評價其體外不同理化條件下的穩(wěn)定性，探索其在實際生產(chǎn)中的用途，為MagaininⅡ在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛙源抗菌肽MagaininⅡ（由上海吉爾生化公司合成，純度達95%以上）；阿莫西林（江西省科達動物藥業(yè)有限公司）、土霉素（購自山西兆益生物有限公司）、慶大霉素（德潤通生物科技有限公司）。

表皮葡萄球菌ATCC 12228、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌 ATCC 25922、大腸桿菌O157∶H7、大腸桿菌K12、腸炎沙門氏菌CMCC 50041、銅綠假單胞菌ATCC 27853、鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50013和豬霍亂沙門氏菌CMCC 50020（購自中國普通微生物菌種保藏中心）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的準備

將菌株劃線接種于MH瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，至長出單菌落；挑取單菌落接種于3 ml新鮮MH液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速250 r/min、37℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h；轉(zhuǎn)接30 μl上述過夜培養(yǎng)的菌懸液于3 ml新鮮MH液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速250 r/min、37 ℃ 培養(yǎng)2～5 h，分光光度計測定OD600=0.5～0.6；轉(zhuǎn)接10 μl此菌懸液至10 ml新鮮MH液體培養(yǎng)基中，渦旋混勻，此時菌懸液中的細菌數(shù)需在5×105～1×106CFU/ml。

1.2.2 抗菌肽稀釋液及抗生素稀釋液的準備

用無菌96孔平板按規(guī)格進行抗菌物質(zhì)梯度稀釋，稀釋梯度分別為Magainin Ⅱ：2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/ml共13個濃度；慶大霉素：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 μg/ml共9個濃度；阿莫西林：2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 μg/ml共 16個濃度；土霉素 ：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 μg/ml共9個濃度。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）的測定

采用微量肉湯稀釋法測定抗菌肽MagaininⅡ以及阿莫西林、土霉素和慶大霉素三種抗生素的MIC和MBC，即按照抗菌物質(zhì)濃度梯度向無菌96孔板中加入90 μl菌懸液與10 μl抗菌物質(zhì)并混合，即抗菌物質(zhì)稀釋液再被稀釋10倍濃度，陽性對照孔只加入菌懸液不加入抗菌物質(zhì)，陰性對照空只加入100 μl MH液體培養(yǎng)基，37℃ 靜置培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察孔板各孔底部，沒有細菌沉淀產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對應(yīng)的最小濃度就是MagaininⅡ以及各抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。

從沒有細菌生長的孔中吸取10 μl內(nèi)容物滴至MH瓊脂平板培養(yǎng)基，每孔三個重復(fù)，37℃培養(yǎng)18～24 h；以是否生長菌落來判定抗菌物質(zhì)的最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.4 蛙源抗菌肽MagaininⅡ與抗生素殺菌速率的比較

以抗菌物質(zhì)的最小抑菌濃度即1×MIC進行殺菌速率的比較，設(shè)置取樣時間點為抗菌物質(zhì)作用后的0、10、30、50、70、90、120 min。

在離心管中依次加入1 ml菌懸液和抗菌物質(zhì)母液至抗菌物質(zhì)終濃度為1×MIC，設(shè)置空白對照即不加入抗菌物質(zhì)，置于37℃、轉(zhuǎn)速250 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)；在7個取樣時間點，分別取出內(nèi)容物10 μl，用無菌蒸餾水進行10倍系列稀釋，直至稀釋到100倍，待混合完全后滴3×5 μl于MH瓊脂平板培養(yǎng)基，充分擴散吸收后，培養(yǎng)過夜。

取3個重復(fù)總菌落數(shù)在15～100的濃度用于菌落計數(shù)，計算出原始菌懸液中的細菌濃度，以作用時間點為橫坐標，每毫升菌懸液中細菌群落總數(shù)（CFU/ml）為縱坐標，做對數(shù)圖獲得時間殺菌速率曲線。

1.2.5 蛙源抗菌肽MagaininⅡ穩(wěn)定性的測試

1.2.5.1 不同溫度對抗菌肽MagaininⅡ抗菌活性的影響

目前，雖然關(guān)于我國古代圖書收藏與管理等方面的論著頗豐，但筆者認為，古代圖書管理與發(fā)展過程中，尚存仍需進一步考究與厘清的一些史實和問題。通過查閱相關(guān)史料，本文在古代圖書館的產(chǎn)生，古代藏書形式、古代典籍的整理與分類法演變等方面進行了梳理與探討。

對MagaininⅡ進行梯度濃度稀釋，將抗菌肽稀釋液置于50、60、70、80、90 ℃水浴加熱15 min后取出冷卻，測定最小抑菌濃度。

1.2.5.2 胰蛋白酶、胃蛋白酶對抗菌肽MagaininⅡ抗菌活性的影響

對MagaininⅡ進行梯度濃度稀釋，分別將胰蛋白酶凍干粉和胃蛋白酶凍干粉按照1∶250的比例和1∶100的比例加入無菌蒸餾水進行溶解。將不同濃度的抗菌肽稀釋液分別與胰蛋白酶稀釋液和胃蛋白酶稀釋液按照1∶1比例加入離心管，置于37℃水浴加熱1 h后取出，測定最小抑菌濃度。

1.2.5.3 pH值對抗菌肽抗菌活性的影響

對MagaininⅡ進行梯度濃度稀釋，將抗菌肽稀釋液與pH值2和pH值8的PBS緩沖液按照1∶1比例混合，測定最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 MagaininⅡ與不同抗生素的抑菌活性比較(見表1)

表1 MagaininⅡ以及各抗生素對致病菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

由表1可知，抗菌肽MagaininⅡ以及阿莫西林、慶大霉素與土霉素在相同試驗條件下，MagaininⅡ表現(xiàn)出的抗菌活性是最弱的，其對此次試驗用革蘭氏陽性菌均未發(fā)揮抗菌作用，但對幾種革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出一定的抗菌活性，MIC值處于64～256 μg/ml，但對鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50013未起到抑菌作用。三種抗生素中，慶大霉素表現(xiàn)出的抗菌活性最強，其對試驗菌株都具有較強的抑菌作用，其最小抑菌濃度小于試驗所設(shè)置的最小濃度，故并未在試驗中檢測到慶大霉素對這幾種試驗菌的MIC值，一定程度上體現(xiàn)了慶大霉素較強的抑菌活性；其次是阿莫西林，同樣表現(xiàn)出明顯抗菌效果，尤其是對大腸桿菌ATCC 25922和大腸桿菌O157∶H7和三種腸炎沙門氏菌，MIC都介于 0.007 8～0.125 μg/ml；土霉素的抗菌活性最弱。此次試驗中，MagaininⅡ與抗生素的MBC值都介于其MIC的2～5倍，殺菌活性最強的是慶大霉素。

2.2 MagaininⅡ與不同抗生素的殺菌速率的比較（見圖1）

圖1 MagaininⅡ與抗生素對金黃色葡萄球菌ATCC 25923(A)和大腸桿菌ATCC 25922(B)的時間殺菌曲線

由圖1抗菌肽MagaininⅡ與阿莫西林等幾種抗生素對金黃色葡萄球菌ATCC 25923和大腸桿菌ATCC 25922的時間殺菌曲線可知，這幾種抗菌物質(zhì)在最小抑菌濃度下的殺菌速率均不相同，對金黃色葡萄球菌菌落生長抑制作用最為明顯是土霉素，其在1×MIC下作用10 min，就在本檢測限內(nèi)檢測不到細菌菌落的形成，其次是阿莫西林，需要作用70 min才無細菌菌落形成；而抗菌肽MagaininⅡ表現(xiàn)出不能完全抑制金黃色葡萄球菌菌落的形成，作用50 min后，細菌菌落數(shù)便呈現(xiàn)增長趨勢并保持增長。對大腸桿菌ATCC 25922菌落生長抑制作用最為明顯的是阿莫西林，在最小抑菌濃度下，作用10 min后，就無菌落形成，其次是土霉素，在其作用30 min后，才檢測不到細菌菌落的形成，殺菌速度最慢的是抗菌肽MagaininⅡ，在1×MIC下，殺菌速度小于兩種抗生素，直到作用90 min才不能檢測到細菌菌落的形成。

2.3 MagaininⅡ的體外穩(wěn)定性測試

表2 不同溫度處理的MagaininⅡ?qū)χ虏【淖钚∫志鷿舛龋∕IC）

由表3可知，與未處理組相比，經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后的MagaininⅡ不再對腸炎沙門氏菌CMCC 50041和大腸桿菌K12具有抑菌作用，試驗中沒有檢測到其對這兩種試驗菌的MIC，且處理后的MagaininⅡ依然對革蘭氏陽性菌不發(fā)揮抑制作用。

表3 胰蛋白酶、胃蛋白酶處理的MagaininⅡ?qū)χ虏【淖钚∫志鷿舛龋∕IC）

表4 不同pH值處理的MagaininⅡ?qū)χ虏【淖钚∫志鷿舛龋∕IC）

由表4可知，與未處理組相比，經(jīng)pH值2處理后的MagaininⅡ仍然能夠?qū)Υ竽c桿菌K12和腸炎沙門氏菌CMCC 50041表現(xiàn)出一定程度的抑制作用，但MIC明顯增大，經(jīng)pH值8處理后就檢測不到MagaininⅡ?qū)Υ竽c桿菌K12的MIC，但可以檢測到對腸炎沙門氏菌CMCC 50041的MIC(128 μg/ml)，和未處理組相同的是MagaininⅡ經(jīng)處理后依然對革蘭氏陽性菌不發(fā)揮抑菌作用，在試驗過程中并未檢測到MIC值。

3 討論

抗菌肽是一種具有抗菌活性的小肽類物質(zhì)，它在動物和植物體內(nèi)廣泛存在，并在生物進化中發(fā)揮了作用，是動物的體內(nèi)免疫的有效防御武器[7]?？股厥怯晌⑸镌谏姝h(huán)境中產(chǎn)生的能夠抑制其它微生物的一類物質(zhì)，是目前治療畜禽感染性疾病的常用手段[8]。通過對抗菌肽MagaininⅡ與阿莫西林等幾種抗生素的體外抑菌試驗結(jié)果的比較可以看出，抗生素對試驗菌株的抗菌活性好于MagaininⅡ，在此試驗中，抑菌效果最好的是慶大霉素，其對革蘭氏陽性菌的MIC小于試驗設(shè)置的最小濃度，MagaininⅡ作為抗菌物質(zhì)的效果并不明顯，目前國內(nèi)外對于MagaininⅡ抗菌活性的研究,許多是圍繞其與其他抗菌肽結(jié)合后形成的雜合肽開展，如馮興軍等將牛乳鐵蛋白與爪蟾素二者進行連接，并發(fā)現(xiàn)兩者雜合肽在抑制革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌上都具有明顯的作用[9]。

抗菌肽MagaininⅡ與幾種抗生素的殺菌速率的試驗結(jié)果表明，MagaininⅡ在作用金黃色葡萄球菌時，表現(xiàn)為不能抑制該菌的生長，效果不如抗生素；在作用大腸桿菌時，其作用時間也同樣長于抗生素，需90 min才可達到有效抑制菌群生長的效果。與阿莫西林和土霉素等抑菌效果較好的抗菌物質(zhì)進行比較，抗生素在試驗中抑制菌群生長所需要的時間則明顯少于MagaininⅡ。

MagaininⅡ穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，在經(jīng)不同溫度的處理后，MagaininⅡ在一定的溫度范圍內(nèi)，能夠保持性質(zhì)穩(wěn)定，并未降解；在高溫環(huán)境中，抗菌活性稍有變?nèi)?，但仍然可以發(fā)揮抑菌作用。經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理的結(jié)果表明，與未經(jīng)處理的MagaininⅡ相比，MagaininⅡ在兩種酶處理后，不再對沙門氏菌CMCC 50041和大腸桿菌K12發(fā)揮抑制作用，說明在胰蛋白酶和胃蛋白酶的處理下，MagaininⅡ變得不穩(wěn)定，性質(zhì)發(fā)生改變且抗菌活性變?nèi)酢６ㄟ^模擬小腸液和胃液的pH值對MagaininⅡ進行不同pH值處理的試驗結(jié)果表明，MagaininⅡ在酸堿度較高的環(huán)境依然能夠在一定程度上發(fā)揮其抗菌活性，但活性有所減弱，說明MagaininⅡ在不同酸堿度的環(huán)境中，能夠保持一定的穩(wěn)定性，發(fā)揮對細菌的抑制作用，且在酸性環(huán)境較堿性環(huán)境性質(zhì)穩(wěn)定。

當今抗生素濫用形勢嚴峻，尋找一種能夠替代抗生素并且安全無污染的新制劑十分重要。有研究發(fā)現(xiàn)，能夠在發(fā)揮抗菌作用的同時不易產(chǎn)生耐藥性的陽離子多肽，具有成為新一代抗菌制劑的潛力[10]，抗菌肽由于具有獨特的性質(zhì)，越來越多的研究者紛紛對其進行研究?？咕腗againinⅡ?qū)毦⒉《镜榷季哂歇毺氐囊种谱饔?，國外許多研究表明，MagaininⅡ不僅對細菌具有抗菌活性，也同樣還具有抗原蟲的活性，Gwadz等研究表明，MagaininⅡ能夠抑制在蚊子宿主體內(nèi)引起瘧疾的寄生蟲的卵囊的發(fā)育[11]，Zasloff則通過對草履蟲（Paramecium caudatum）的試驗，觀察到用MagaininⅡ處理會使得草履蟲本身逐漸開始膨脹隨后導(dǎo)致破裂，Zasloff等認為在一些生物體內(nèi)，MagaininⅡ通過擾亂生物膜功能而發(fā)揮作用[6]。

國內(nèi)外有許多實驗室研究Magainins的特性，將Magainins與其他抗菌物質(zhì)進行連接形成雜合肽，進而針對雜合肽的抗菌活性等展開研究，或就Magainins與其他抗菌物質(zhì)之間的協(xié)同效應(yīng)進行研究，如Glattard等就進行了MagaininⅡ與PGLa混合后的協(xié)同增強效應(yīng)的研究[12]。劉二強等通過研究天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的作用，發(fā)現(xiàn)這種雜合肽不僅能夠抑制該菌DNA、RNA、總蛋白合成的能力，且對細胞能量代謝以及胞內(nèi)酶活性也能發(fā)揮一定的作用[13]。許多研究都表明，將MagaininⅡ與其他抗菌物質(zhì)連接或混合使用的效果會好于單獨使用的效果，在以后的研究中可以充分考慮MagaininⅡ與其他抗菌物質(zhì)協(xié)同效應(yīng)的研究。

4 小結(jié)與展望

MagaininⅡ在此試驗中表現(xiàn)出的對革蘭氏陽性菌抗菌效果不明顯以及在酶處理的情況下性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點，可以在以后的試驗中通過改變其結(jié)構(gòu)或與其他物質(zhì)聯(lián)用實現(xiàn)進一步探索，就現(xiàn)階段而言，抗菌肽的使用還需要大量的評測，目前國內(nèi)外對于其的研究，主要是研究其與其他抗菌物質(zhì)進行連接形成的雜合肽的抑菌活性，以及其在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮的作用。相信在更深入的系統(tǒng)研究后，關(guān)于抗菌肽MagaininⅡ的種種問題與安全性顧慮會得到解決。