同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中T-2和HT-2毒素含量

■蔡小明

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州350002）

T-2、HT-2毒素是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一類霉菌毒素，廣泛分布于自然界，主要存在于大麥、小麥、燕麥、玉米等谷物及其飼料制品，是一類常見(jiàn)的污染田間作物和庫(kù)存谷物的毒素，也是目前報(bào)道的A類單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的真菌毒素，動(dòng)物長(zhǎng)期服用后易導(dǎo)致嚴(yán)重疾病甚至死亡[1-3]。歐盟在2006年就要求對(duì)T-2、HT-2毒素危害信息的收集、研究及檢測(cè)方法開發(fā)，并建議對(duì)T-2、HT-2毒素的污染情況進(jìn)行監(jiān)控。2017年8月歐盟食品安全局（ESFA）發(fā)布了T-2毒素與HT-2毒素的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)，最大暴露量介于 0.12～0.16 μg/kg體重每天與2.37～2.58 μg/kg體重每天[4]。

目前，T-2、HT-2毒素檢測(cè)方法研究主要針對(duì)的是食品類產(chǎn)品，而對(duì)飼料方面的研究較少。T-2、HT-2毒素測(cè)定方法主要有酶聯(lián)法、液相法、氣質(zhì)法及液質(zhì)法[5-8]，酶聯(lián)法檢測(cè)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，液相法及氣質(zhì)法檢測(cè)需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生，步驟繁瑣且衍生劑毒性較大，相比之下液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有更簡(jiǎn)便、靈敏度更高的優(yōu)勢(shì)被廣泛用于T-2、HT-2毒素檢測(cè)。

本研究旨在采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立飼料中T-2、HT-2毒素的檢測(cè)方法，為飼料中T-2、HT-2毒素的監(jiān)管和企業(yè)的自檢提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

Agilent 6490高效液相色譜儀配串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；BT 224 S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；DS-8510 DTH超聲波振蕩器（上海生析超聲儀器有限公司）；XH-B旋渦混均器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；0.2 μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜（美國(guó)ASC）。

T-2、HT-2毒素及其內(nèi)標(biāo)，購(gòu)于奧地利Romer公司；免疫親和柱（T-2/HT-2 Star? R美國(guó)Romer）；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；其余試劑均為色譜純。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：HSS T-3（1.7 μm，2.1 mm í100 mm）；流動(dòng)相：10 mmol/l乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈梯度；流速0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量2 μl。

流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序（%）

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式（SEI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；脫溶劑氣溫度：200℃；脫溶劑氣流速15 L/min;鞘氣溫度300℃；鞘氣流速 12 L/min；毛細(xì)管電壓：3.5 KV；T-2和HT-2毒素及其內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子及碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 T-2、HT-2毒素質(zhì)譜測(cè)定條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 混合儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確移取T-2、HT-2毒素液體標(biāo)準(zhǔn)品（濃度均為 100 μg/ml）1.0 ml乙腈定容至 100 ml，配制成濃度為1.00 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱中。

1.3.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

分別吸取一定量的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液并加入內(nèi)標(biāo)，添加樣品空白提取液，氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相稀釋成濃度為1.0～200 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用新配。

1.4 樣品前處理

稱取5.00 g（精確至0.01 g）均勻樣品，置于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 μl內(nèi)標(biāo)和20.0 ml 80%乙腈，振搖混勻，置于超聲波振蕩器中提取30 min，于4℃12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。

移取4.0 ml上清液，用40 ml PBS緩沖液稀釋后，過(guò)免疫親和柱，控制流速1～2 ml/min，用10 ml PBS緩沖液淋洗小柱，真空抽干，用5.0 ml甲醇以1～2 ml/min流速洗脫并收集，置于40℃水浴中氮吹近干，再用20%乙腈水溶液定容到1.0 ml，混勻，用0.2 μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)，采用正離子模式，T-2毒素母離子（m/z）為489.3，HT-2毒素母離子（m/z）為447.1，優(yōu)化相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)選擇T-2毒素的定量/定性離子（m/z）對(duì)為：387.1/245.2，HT-2毒素的定量/定性離子（m/z）對(duì)為：345/284.9。試驗(yàn)表明，流動(dòng)相中加入甲酸可以增強(qiáng)目標(biāo)物的離子化效率，而加入乙酸銨可以改善目標(biāo)物的峰形，最終確定以乙腈-10 mmol/l乙酸銨（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，總離子流圖如圖1。

圖1 T-2、HT-2毒素的總離子流圖

2.2 提取溶劑的選擇

采用加標(biāo)回收方式對(duì)比了不同乙腈水比例溶液（體積比100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50）對(duì)T-2、HT-2毒素回收率的影響，平行試驗(yàn)三次。結(jié)果表明：隨著提取液中水含量的升高，T-2、HT-2毒素的回收率也隨之增大，當(dāng)提取溶劑中水含量達(dá)到20%（乙腈水80∶20）時(shí)，T-2、HT-2毒素回收率在81.1%～95%之間，當(dāng)水的含量超過(guò)20%時(shí)，回收率基本不變，且提取液中明顯渾濁。因此，選擇乙腈水體積比80∶20作為提取溶劑。

2.3 線性范圍和檢測(cè)限

在1.0～200.0 ng/ml范圍內(nèi)配制六個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，見(jiàn)表3，T-2、HT-2毒素線性關(guān)系較好（R2＞0.999）。以3倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD）、10倍信噪比計(jì)算定量限(LOQ)，T-2、HT-2毒素的檢出限均為1.0 μg/kg，定量限均為3.0 μg/kg，滿足痕量分析要求。

表3 線性方程、線性參數(shù)及線性范圍

2.4 精密度與準(zhǔn)確度

以陰性飼料樣品作為基質(zhì)，進(jìn)行10、50、200 μg/kg三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種水平平行試驗(yàn)6次（n=6），結(jié)果見(jiàn)表4，T-2、HT-2毒素平均回收率在81.5%～105.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～2.8%之間，滿足方法學(xué)要求。

表4 T-2、HT-2毒素回收率與精密度（n=6）

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)購(gòu)買市售16份不同類型飼料測(cè)定其T-2、HT-2毒素含量，有四份樣品飼料檢出T-2含量在21～218 μg/kg，其中一份樣品同時(shí)檢出HT-2毒素含量為42 μg/kg，說(shuō)明所建立方法適用于飼料中T-2、HT-2毒素的檢測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了飼料中T-2毒素和HT-2毒素含量的同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜的測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好，適用于飼料中T-2、HT-2毒素的檢測(cè)。