甘草酸二銨改善Con A致小鼠肝損傷的作用研究

仲金秋,曹玉珠,徐宏江,吳媛媛,張婷婷,李曉曼,陳文星,2,王愛云,2*,陸 茵,2*

1南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室；2南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心； 3中國藥理學(xué)與毒理學(xué)研究所 正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，南京210023

肝損傷是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，當(dāng)損傷程度超過其代償能力時，則出現(xiàn)臨床和生化的特征性改變；肝損傷的長期存在往往能夠?qū)е赂卫w維化、肝硬化、甚至肝癌的發(fā)生，因此防治肝損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一[1]。

甘草酸二銨(Diammonium glycyrrhizinate,DG)是由甘草根中提取的成分，在我國應(yīng)用于治療肝炎已有數(shù)千年的歷史。因其較甘草酸(Glycyrrhizin,GL)穩(wěn)定性更好、溶解度更高且生物活性更強(qiáng)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床[2]。甘草酸二銨具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗生物氧化、膜保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用，并且具有類固醇類激素的作用等；口服攝入后，甘草酸二銨代謝為甘草酸，然后在腸道菌群的作用下水解成甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)：18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid,18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic acid,18β-GA)，由腸道吸收。研究表明，18α-GA在肝臟和十二指腸中的濃度明顯高于18β-GA，是保肝和抗炎作用中的主要有效成分[3]。

甘草酸二銨廣泛應(yīng)用于臨床肝病治療，但目前對于其保肝機(jī)制研究報道并不多。本研究首次采用Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型研究甘草酸二銨的保肝作用，并利用分子生物學(xué)手段探索其可能的作用機(jī)制，為其在臨床的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠60 只，18～20 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0006，動物合格證號：2010002607994。

SPF級雄性WISTAR大鼠20 只，180～220 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，動物合格證號：NO.201613691。

1.2 藥物

甘草酸二銨腸溶膠囊(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司)；水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠)；雙環(huán)醇片(北京協(xié)和藥廠)；刀豆蛋白(sigma)；雙環(huán)醇(中檢所)；18α-GA(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，TQ0813-s03)；水飛薊賓(上海源葉生物科技有限公司)；18β-GA(≥98%)和苦參堿(≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(IFCC法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(IFCC法)(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因編碼蛋白(BCL-2)、BCL2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)、多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、γ-干擾素(IFN-γ)抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、羊抗兔IgG(H+L)-HRP抗體(巴傲得生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、環(huán)氧合酶-1(COX-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)抗體(Abcam公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)(萬類生物科技有限公司)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)(美國Affinity Biosciences公司)。

1.4 儀器

臺式冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司，Allegra 30R)；石蠟包埋儀(德國LEICA公司，EG 1150H+C)；石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司，RM2245)；全自動生化分析儀(HITACHI，日立7020)；體視熒光顯微鏡(德國 LEICA 公司，M205FA)；恒溫培養(yǎng)箱(上海篤特科學(xué)儀器有限公司，HWP-9162)；凝膠電泳儀(來自美國Bio-Rad，Mini Protean 3 Cell)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，ChemiDocTMXRS+)。

2 實驗方法

2.1 小鼠模型的給藥與制備

實驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 天后，稱重，隨機(jī)分為5 組，每組12 只，分別為空白組(Control)，模型組(Con A)，甘草酸二銨組(DG)，水飛薊素對照組(Silymarin)，雙環(huán)醇對照組(Bicyclol)。甘草酸二銨、水飛薊素和雙環(huán)醇的臨床給藥劑量，分別為450、280和75 mg/d，按體表面積折算的等效劑量比值(小鼠臨床等效劑量=臨床日用藥量(0.0026/0.02)計算藥物的臨床等效劑量，分別為58.5、36.4、9.75 mg/kg。各治療組小鼠分別灌胃給藥，給藥體積為0.1 mL/10 g；空白組和模型組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥7 天，并稱重。

第8 天，小鼠稱重，實驗組按尾靜脈單次注射Con A 30 mg/kg的藥物劑量，給藥體積為0.05 mL/10 g(Con A溶解于無菌生理鹽水中，濃度為6 mg/mL)；空白組采用同體積生理鹽水處理。其后所有小鼠禁食不禁水。

2.2 小鼠處理

造模8 h后，小鼠眼眶后靜脈叢采血，每只小鼠收集血液1～1.5 mL，于室溫靜置1 h后，4 ℃過夜。全血離心(2 500 rpm，10 min，4 ℃)后取上層血清保存待用。解剖小鼠，分離肝、脾、胸腺后立即用生理鹽水沖洗并稱重。計算動物的各臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)×100。每只小鼠取肝臟同一葉浸泡于4%多聚甲醛中固定過夜，后用于組織病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)分析。剩余部分肝臟放入-80 ℃冰箱冷凍保存，用于Western blot分析。

2.3 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

稱取50 mg肝組織中于玻璃勻漿器中，加入1 mL RIPA后置于冰上充分研磨，離心取上清液，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白含量測定。蛋白變性后-80 ℃冰箱保存。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔50 μg蛋白上樣。電泳條件為40 mA，120 min，轉(zhuǎn)膜條件為100 V，90 min。一抗BAX、BCL-2、PARP、IFN-γ、GAPDH、COX-2、cleaved Caspase-3、TGF-β1、COX-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的稀釋比例均為1∶1 000。使用凝膠成像儀進(jìn)行成像并利用Photoshop軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

肝臟組織在4%多聚甲醛中固定后，后依次進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片烤片(4 μm)、HE染色。顯微鏡下(200×)觀察組織病理變化并拍照。

2.5 免疫組織化學(xué)

將肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉，cleaved Caspase-3(1∶200)、COX-2(1∶200)或Caspase-1(1∶500)4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下(200×)拍照，每組選取肝組織切片中9個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

2.6 藥物與轉(zhuǎn)氨酶異常大鼠血清共孵育實驗

2.6.1 收集大鼠AST、ALT水平異常的血清

WISTAR大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天。第8 天稱重，復(fù)制Con A誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，方法同2.1。造模8 h后，通過腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，隨后采用腹主動脈取血，分離血清。

2.6.2 藥物與大鼠血清共孵育[4]

配制各藥物濃度為18α-GA(11、22、44、88 μg/mL)、18β-GA(11、22、44、88 μg/mL)；水飛薊賓對照組(7.5、15、30、60 μg/mL)；雙環(huán)醇對照組(2.5、5、10、20 μg/mL)；苦參堿(10 μg/mL)，均用DMSO溶解，pH7.2～7.4。取各濃度藥物1 μL與AST、ALT異常升高的血清200 μL混勻，于37 ℃分別孵育0、2、4、6、8、10、12 h。一式3份。各藥物終濃度如下：18α-GA(55、110、220、440 ng/mL)、18β-GA(55、110、220、440 ng/mL)、水飛薊賓(37.5、75、150、300 ng/mL)、雙環(huán)醇(12.5、25、50、100 ng/mL)、苦參堿(50 ng/mL)。差值計算公式：Normalized(AST)=AST-AST control；Normalized(ALT)=ALT-ALT control。

2.7 血清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測

采用HITACHI 7020全自動生化分析儀，按廠家試劑盒說明書設(shè)置參數(shù)后檢測血清中AST和ALT水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果

3.1 甘草酸二銨對肝損傷小鼠的體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

如表1、表2所示，各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異，但模型組小鼠肝臟、脾臟和胸腺內(nèi)臟指數(shù)較空白組顯著增加(P<0.001或P<0.05)，而且肉眼可見小鼠肝臟、脾臟和胸腺腫大，肝臟外表面充血。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠顯著降低Con A 誘導(dǎo)的小鼠肝臟指數(shù)異常(P<0.05)；36.4 mg/kg水飛薊素對小鼠的臟器指數(shù)沒有影響；9.75 mg/kg雙環(huán)醇能改善刀豆蛋白引起的小鼠脾臟臟器指數(shù)異常(P<0.05)。

3.2 甘草酸二銨對肝損傷小鼠的組織病理學(xué)和血清生化指標(biāo)的影響

凋亡、炎癥是Con A誘導(dǎo)急性肝損傷的重要病理機(jī)制。肝組織HE染色結(jié)果顯示，空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列。模型組肝臟匯管區(qū)正常結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞邊界不清，胞漿呈絮狀，部分細(xì)胞核縮小，炎性細(xì)胞浸潤(圖1A中箭頭所指)。各給藥組肝小葉輪廓較模型組清晰，細(xì)胞形態(tài)相對完整，部分可見輕度病變，肝細(xì)胞索排列整齊，肝組織病理學(xué)形態(tài)得到改善(圖1A)。此外，我們還對空白組、模型組和甘草酸二胺組小鼠肝組織切片進(jìn)行了凋亡蛋白、炎癥介質(zhì)的免疫組化染色。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠下調(diào)肝組織中cleaved caspase-3的水平(圖1B)。同時，模型組小鼠肝組織中Caspase-1和COX-2的表達(dá)升高(P<0.001)。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠降低caspase-1以及COX-2的表達(dá)(P<0.01)(圖1C)。

表1 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of DG on the body weight of

注：與空白組比較沒有差異；與模型組比較沒有差異。
Note:Compared with control group,no significant difference；compared with Model group,no significant difference.

表2 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠肝臟、脾臟和胸腺臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of DG on the liver,spleen and thymus viscera index of

注：與空白組比較#P<0.05；###P<0.001；與模型組比較*P<0.05。
Note:Compared with control group,#P<0.05;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05.

血清轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測結(jié)果與組織病理學(xué)變化結(jié)果相一致。如表3所示，模型組血清中AST和ALT水平顯著升高(P<0.001)，58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠降低小鼠血清中AST和ALT水平(P<0.001或P<0.01)；36.4 mg/kg水飛薊素也具有降低小鼠血清中AST和ALT的作用(P<0.05或P<0.001)；但是9.75 mg/kg雙環(huán)醇僅能降低小鼠血清中ALT水平(P<0.05)，而對AST沒有影響。

表3 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響Table 3 Effects of DG on the serum ALT,AST levels in mice

注：與空白組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
Note：Compared with control group,###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

圖1 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠的組織病理學(xué)的影響(200x)Fig.1 Effects of DG on histopathology in mice with Con A-induced hepatic injury (200x)注：A：不同治療組的肝組織HE染色；B：小鼠肝組織cleaved-Caspase 3的免疫組化分析；C：小鼠肝組織Caspase-1、COX-2的免疫組化分析；(a) 空白組；(b) 模型組；(c) 甘草酸二銨組；(d) 水飛薊素對照組；(e) 雙環(huán)醇對照組；與空白組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01；***P<0.001。Note：A:Liver tissue sections from the different treatment groups were stained with hematoxylin-eosin;B:Immunohistochemistry analysis of cleaved-Caspase 3 expression in mice liver tissues;C:Immunohistochemistry analysis of Caspase-1,COX-2 expression in mice liver tissues;(a) Control group,(b) Model group;(c) DG treatment group;(d) Silymarin treatment group;(e) Bicyclol treatment group;Compared with control group,###P<0.001;Compared with Model group,**P<0.01;***P<0.001.

3.3 甘草酸二銨體外對血清中的AST、ALT水平的影響

如表4和表5所示，陽性對照藥苦參堿(50 ng/mL)在與血清孵育10 h后，能夠降低血清中的AST水平(P<0.001)。18α-GA、18β-GA和雙環(huán)醇不能直接降低血清中的AST、ALT水平。而水飛薊賓(300 ng/mL)在與血清孵育8 h后，能夠降低血清中的ALT水平(P<0.001)。

表4 18α-GA、18β-GA體外對血清中AST活性的影響Table 4 Serum AST activity from serum-18α-GA,18β-GA incubation assay

注：與DMSO組比較，***P<0.001。
Note：Compared with DMSO group,***P<0.001.

表5 18α-GA、18β-GA體外對血清中ALT活性的影響Table 5 Serum ALT activity from serum-18α-GA,18β-GA incubation assay

續(xù)表5(Continued Tab.5)

ALT Change to control濃度Dose(ng/mL)0 h2 h4 h6 h8 h10 h12 h150-4.50±0.75-1.13±0.72-1.73±0.51-0.87±1.42-4.23±0.852.74±2.931.73±1.97300-4.70±1.18-0.77±2.33-2.17±1.50-1.40±1.90-12.46±5.46???-8.90±4.48???-9.47±9.20???雙環(huán)醇Bicyclol12.5-2.64±0.12-1.80±0.26-1.03±0.150.83±0.35-3.13±0.201.97±1.912.27±1.1025-3.64±1.59-1.63±0.76-1.23±1.57-0.47±1.56-2.46±1.292.64±0.800.23±7.8750-2.77±1.91-3.53±0.32-1.57±1.360.23±2.06-2.00±0.151.90±0.862.43±1.27100-3.10±0.06-3.37±0.55-0.33±0.761.23±1.50-0.90±1.994.54±1.460.63±4.19

注：與DMSO組比較，***P<0.001。
Note：Compared with DMSO group,***P<0.001.

3.4 甘草酸二銨對肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，模型組小鼠肝組織中BAX/BCL-2顯著升高，同時cleaved Caspase-3、cleaved PARP的表達(dá)也顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.001)。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能降低肝組織中cleaved caspase-3、cleaved PARP、BAX/BCL-2表達(dá)水平(P<0.01或P<0.001)。因此推測甘草酸二銨能夠改善Con A致小鼠肝損傷組織的凋亡。

圖2 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠組織中凋亡蛋白的影響Fig.2 Effects of DG on hepatic apoptosis in mice with Con A-induced hepatic injury注：與空白組比較，##P<0.01；###P<0.001；與模型組比較，*P<0.01；***P<0.001。Note：Compared with control group,#P<0.05;##P<0.01;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;***P<0.001.

3.5 甘草酸二銨對肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響

如圖3所示，模型組小鼠肝組織中Caspase-1、COX-2、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)升高，COX-1表達(dá)下降(P<0.01或P<0.001)。而58.5 mg/kg 甘草酸二銨能夠降低TGF-β1、caspase-1以及COX-2表達(dá)水平，上調(diào)COX-1的表達(dá)，同時降低IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。因此推測甘草酸二銨能夠保護(hù)小鼠免受Con A誘導(dǎo)的肝臟組織炎癥反應(yīng)。

4 討論

Con A經(jīng)尾靜脈單次注射，能夠引起TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β等多種細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致肝臟組織炎性細(xì)胞浸潤，誘發(fā)炎癥和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致急性肝損傷[5,6]。該模型與人類肝炎的發(fā)病機(jī)理及病理學(xué)特征極為相似，能夠很好地模擬臨床自身免疫性肝炎(AIH)、急性病毒性肝炎和藥物中毒引起的肝炎等，因而在保肝藥研究中被廣泛應(yīng)用[7]。水飛薊素、雙環(huán)醇分別為天然和人工合成的常見保肝藥，保肝機(jī)制各不相同，在保肝藥的研究中都常被用作陽性對照藥[8,9]。水飛薊素可以通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動性、從而改善肝功能；還可以中斷肝腸循環(huán)，對抗毒物所致的肝損傷[10,11]。雙環(huán)醇能夠通過清除自由基、抑制氧化應(yīng)激、保護(hù)肝細(xì)胞核DNA免受損傷、減輕線粒體損傷，從而發(fā)揮降低血清轉(zhuǎn)氨酶和抗肝損傷、抗肝纖維化以及抗肝炎病毒的活性[12]。因此，本研究并以這兩種保肝藥作為對照藥，通過復(fù)制Con A肝損傷模型，檢測肝功能、肝臟病理組織和分子生物學(xué)指標(biāo)來綜合評判甘草酸二銨的肝保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

AST、ALT升高是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[5]。本研究表明，甘草酸二銨在保護(hù)小鼠免受Con A所致肝臟病理損傷的同時，可以降低小鼠血清中AST和ALT水平。人體藥代動力學(xué)研究顯示，甘草酸二銨腸溶膠囊口服攝入后，在體內(nèi)被代謝成18α-GA和18β-GA，最高血藥濃度為95.57±43.06 ng/mL[13]。為驗證甘草酸二銨是否會直接降解血清中的AST和ALT，本文以苦參堿為陽性對照藥[4]，進(jìn)行了藥物-轉(zhuǎn)氨酶異常血清共孵育實驗。結(jié)果表明，18α-GA和18β-GA均不能直接降低血清中AST、ALT水平。因此，我們推測甘草酸二銨是通過保護(hù)肝細(xì)胞，減少AST、ALT外溢來發(fā)揮降酶作用的。

圖3 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠組織中炎癥因子水平的影響Fig.3 DG inhibited inflammation in mice with Con A-induced hepatic injury注：與空白組比較，##P<0.01；###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note：Compared with control group,##P<0.01;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;**P<0.01.

BAX與BCL-2是一對互相拮抗的凋亡相關(guān)蛋白，BAX/BCL-2的比值決定凋亡的啟動，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡下游的Caspase-3，而PARP剪切是Caspase-3激活的指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，甘草酸二銨下調(diào)肝損傷小鼠肝臟中BAX/BCL-2的比值，抑制小鼠肝組織中凋亡蛋白PARP、cleaved Caspase-3的表達(dá)，說明甘草酸二銨具有抑制肝細(xì)胞凋亡的作用。在Con A誘導(dǎo)的肝損傷中，Caspase-1可以調(diào)節(jié)pro-IL-1β和pro-IL-18的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖[15]。同時也伴隨TGF-β1表達(dá)失衡和肝細(xì)胞內(nèi)COX-2表達(dá)上調(diào)后前列腺素(PGs)的生成[16,17]。本研究結(jié)果表明，甘草酸二銨能抑制Con A所致小鼠肝組織中Caspase-1、TGF-β1、COX-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等炎性因子的上調(diào)，和COX-1的下調(diào)，顯示其作用機(jī)理與抑制抗炎和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上可見，甘草酸二銨腸溶膠囊能夠改善Con A致小鼠肝損傷，并通過保護(hù)肝細(xì)胞來降低血清AST、ALT水平，其降酶保肝的作用可能與抑制小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡以及炎性細(xì)胞因子的水平相關(guān)。