基于中草藥活性成分的GSK-3β抑制劑的分子模擬

唐文強(qiáng)，張靜曉，張麗雷

1陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，西安 712046；2湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，恩施 471934； 3陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 712046

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是一種組成型活性蛋白激酶，通過對(duì)100多種底物的磷酸化參與眾多細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[1]。GSK-3通過β-連環(huán)蛋白[2]和c-Myc[3]控制細(xì)胞的增殖，并且通過TNFα，IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)炎癥[4]。因此，GSK-3的過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌癥和炎癥等疾病[5,6]。GSK-3抑制劑的研究最初集中于神經(jīng)性疾病，如阿爾茨海默病的治療，如今GSK-3抑制劑作為抗癌藥物也已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，并開發(fā)了許多GSK-3抑制劑[1,7-9]。

GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，GSK3α主要參與糖原代謝過程，GSK3β主要調(diào)控癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、加速細(xì)胞周期、參與腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移及凋亡過程，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。GSK-3β具有折疊的N端和α螺旋的C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，ATP結(jié)合口袋位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，主要的氨基酸殘基包括Lys85、Aspl33和Vall35等，另外，其活性區(qū)域包括T-loop區(qū)和正調(diào)節(jié)因子Tyr2l6，主要的氨基酸包括Arg96、Argl80和Lys205等。目前研制的GSK-3β抑制劑主要包括蒎酮類、靛玉紅類和馬來酰胺類等多種類型[10]，然而，多數(shù)抑制劑的作用機(jī)理是結(jié)合于GSK-3β的ATP結(jié)合口袋部位，從而不僅阻斷目標(biāo)底物蛋白的磷酸化，同時(shí)阻止了所有底物的磷酸化，導(dǎo)致Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的β連環(huán)蛋白濃度增加，長期使用具有引發(fā)癌癥的危險(xiǎn)[11,12]。如果設(shè)計(jì)作用靶標(biāo)是T-loop區(qū)的抑制劑，可以阻礙底物與T-loop區(qū)的結(jié)合，從而阻斷底物的磷酸化，但不會(huì)影響axin,β-連環(huán)蛋白，因這些蛋白不需要預(yù)磷酸化，可以直接與活性部位結(jié)合[13]。因此，此類藥物不會(huì)擊中Wnt信號(hào)路徑，與ATP的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑相比，減少癌癥發(fā)生的可能性。故識(shí)別與T-loop區(qū)的氨基酸的相互作用是這類抑制劑開發(fā)的可行方法。

課題組前期利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法建立了一個(gè)中藥有效成分篩選的模擬體系，通過ADME篩選，靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證等方法，從多味中草藥中篩選出了與GSK-3β靶點(diǎn)有相互作用的22個(gè)有效成分[14]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)方法研究了這22個(gè)活性成分分別與GSK-3β靶點(diǎn)的ATP結(jié)合口袋和T-loop區(qū)域的結(jié)合方式，揭示其與GSK-3β靶點(diǎn)的相互作用機(jī)理，為中草藥的藥用機(jī)理研究和GSK-3β抑制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的準(zhǔn)備

從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫(RCSB PDB)中獲取GSK-3β的晶體結(jié)構(gòu)模型(PDB ID:5K5N)，除去結(jié)晶水和配體PF-04802367，并補(bǔ)全氫原子，記為GSK-3β，作為分子模擬的GSK-3β蛋白模型。采用該晶體結(jié)構(gòu)的原因是它是迄今為止分辨率最高的GSK-3β蛋白晶體模型。小分子化合物的分子結(jié)構(gòu)從化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.chemspider.com/)中獲取，作為配體的初始構(gòu)象。

1.2 分子對(duì)接

分子對(duì)接采用AutoDock Vina程序[15]進(jìn)行，使用半柔性對(duì)接方法將配體分子與GSK-3β進(jìn)行對(duì)接，其中，GSK-3β被視為一個(gè)剛體，與配體分子所有的可旋轉(zhuǎn)鍵進(jìn)行對(duì)接。結(jié)合位點(diǎn)分別設(shè)定為GSK-3β的ATP結(jié)合口袋和T-loop區(qū)域，口袋大小為20×20×20 ?3的盒子，網(wǎng)格間距為1.0 ?，中心分別為ATP結(jié)合口袋和T-loop區(qū)域的中心。根據(jù)在AutoDock Vina的評(píng)分函數(shù)計(jì)算出的結(jié)合親和能篩選出10個(gè)最有可能的模型。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬采用GROMACS(版本2016.4)程序[16]，將分子對(duì)接得到的復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為MD模擬的初始構(gòu)象，GSK-3β部分采用amber99sb-ildn力場(chǎng)，小分子配體部分采用GAFF力場(chǎng)和AM1-BCC電荷。在復(fù)合物結(jié)構(gòu)的周圍建立可將其完全包圍且延伸8 ?的立方體水模型的周期性結(jié)構(gòu)，并加入5個(gè)Cl-離子，使體系保持電中性，體系原子的總數(shù)目大約為66 000個(gè)。在進(jìn)行MD模擬之前，首先進(jìn)行500步的能量極小化動(dòng)力學(xué)，再進(jìn)行100 ps的限制性動(dòng)力學(xué)，令溶劑弛豫。優(yōu)化結(jié)束后，采取緩慢升溫的方法，將體系溫度在200 ps內(nèi)由0 K緩慢加熱至310 K，之后進(jìn)行20 ns的NPT模擬，時(shí)間步長2 fs。在動(dòng)力學(xué)模擬過程中，運(yùn)用Velocity-rescale方法控制體系溫度，將蛋白和配體作為一組，其他原子作為另外一組，分別進(jìn)行控溫。設(shè)置所有和氫原子相連的鍵被認(rèn)為是不振動(dòng)的，使用PME(particle mesh ewald)方法計(jì)算長程靜電相互作用，范德華相互作用的截?cái)嘀禐?2?。

1.4 結(jié)合自由能的計(jì)算

采用連續(xù)介質(zhì)模型MM-PBSA(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法計(jì)算配體與蛋白復(fù)合物的結(jié)合自由能，此方法采用分子力學(xué)和連續(xù)介質(zhì)模型估算復(fù)合物的結(jié)合自由能。

MM-PBSA方法的計(jì)算方程式：

G=Emm-TSmm+Gsolvatc

Gsolvate=Gpolar+Gnonpolar

式中EMM為氣相內(nèi)能項(xiàng)，TSMM為氣相熵項(xiàng)，Gsolvate為溶劑能量項(xiàng)，Gpolar和Gnonpolar分別為極性項(xiàng)和非極性項(xiàng)。計(jì)算采用g_MMPBSA程序[17]進(jìn)行，非極性項(xiàng)Gnonpolar采用溶劑可及表面(SASA)方法進(jìn)行計(jì)算:

Gnonpolar=γSSASA+β

其中 γ=2.2 kJ·mol-1·nm-2，β=3.84 kJ·mol-1。每個(gè)復(fù)合物采用51個(gè)結(jié)合構(gòu)象，在全部20 ns模擬中，選取最后1 ns為平衡狀態(tài)，即從19 ns開始(包含第19 ns)取樣，間隔為20 ps，選取一個(gè)結(jié)構(gòu)，至20 ns結(jié)束，共51個(gè)構(gòu)象，采用這51個(gè)構(gòu)象的極性和非極性項(xiàng)的平均值作為計(jì)算值。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對(duì)接

首先考察了對(duì)接方法的合理性，對(duì)已知晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:5K5N)[18]中的配體PF-04802367與重新對(duì)接后的PF-04802367的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了疊合，結(jié)果如圖1所示。圖中黑色部分是原始蛋白晶體中配體PF-04802367的結(jié)構(gòu)，白色部分是重新對(duì)接后配體PF-04802367的結(jié)構(gòu)，從圖中可見，對(duì)接后配體的結(jié)構(gòu)與原晶體中的結(jié)構(gòu)基本重合，能夠很好地重現(xiàn)晶體構(gòu)象，表明對(duì)接方案是合理的。

圖1 配體PF-04802367在原晶體中的結(jié)構(gòu)與重新對(duì)接后的結(jié)構(gòu)疊合圖Fig.1 The overlapped structures of ligand PF-04802367 in the crystal and re-docking systems

表1 分子對(duì)接結(jié)果Table 1 The results of molecular docking

將篩選得到的22個(gè)中草藥有效成分作為配體，與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋以及T-loop區(qū)域進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能量的結(jié)果如表1所示。從結(jié)果可見，所有的結(jié)合能量均為負(fù)值，表明所篩選得到的化合物均可以與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋以及T-loop區(qū)域結(jié)合。另外，絕大部分配體結(jié)合于ATP結(jié)合口袋的能量高于結(jié)合于T-loop區(qū)域的能量，表明這些配體傾向于結(jié)合在GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域，從而與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合達(dá)到抑制的目的。

其中，蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)和二氫丹參酮I (M17)等成分的結(jié)合能量均高于配體PF-04802367的結(jié)合能量，表明這些化合物有可能獲得更好的抑制活性，并且已經(jīng)有研究表明，蘆丁(M01)[19]、楊酶酮(M16)[20]和二氫丹參酮I (M17)[10]具有良好的抗腫瘤活性，并且對(duì)GSK-3β具有一定的抑制作用，與分子對(duì)接結(jié)果一致。另外，人參皂苷Rb1(M20)在GSK-3β的T-loop區(qū)的結(jié)合能高于在ATP結(jié)合口袋的結(jié)合能，表明人參皂苷Rb1(M20)可能更易結(jié)合于GSK-3β的T-loop區(qū)域，從而達(dá)到抑制作用。

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

圖2 GSK-3β復(fù)合物模型分子動(dòng)力學(xué)模擬期間RMSD值隨時(shí)間的變化Fig.2 The values of RMSD during molecular dynamics simulation of GSK-3β complexes

為了進(jìn)一步研究所篩選得到的配體與GSK-3β的相互作用機(jī)理，選取蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)、二氫丹參酮I(M17)和人參皂苷Rb1(M20)分別結(jié)合于GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域和T-loop區(qū)域的構(gòu)象為初始結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。選取這些成分的原因是蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)、二氫丹參酮I(M17)結(jié)合于GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域的結(jié)合能均大于原晶體結(jié)構(gòu)中配體PF-04802367的結(jié)合能，并且是所篩選配體中結(jié)合能最高的化合物，可能具有較優(yōu)的抑制活性。另外，人參皂苷Rb1(M20)結(jié)合于GSK-3β的T-loop區(qū)域的結(jié)合能高于在ATP結(jié)合口袋區(qū)域的結(jié)合能，可能是可結(jié)合于T-loop區(qū)域的GSK-3β有效抑制劑。

通過分子模擬過程中構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)驗(yàn)證結(jié)構(gòu)是否達(dá)到平衡，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見，經(jīng)過約2 ns的模擬后，構(gòu)象中蛋白和配體的RMSD值上下波動(dòng)范圍均穩(wěn)定在1 ?的范圍之內(nèi)，表明所研究構(gòu)象經(jīng)過平衡后均達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

從最后1ns的運(yùn)動(dòng)軌跡中，取出最低能量結(jié)構(gòu)對(duì)配體與蛋白之間的相互作用進(jìn)行了分析。使用軟件Ligplot +計(jì)算得到蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)、二氫丹參酮I (M17)和人參皂苷Rb1(M20)與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域和T-loop區(qū)域的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

配體和蛋白之間的相互作用主要包括疏水作用和氫鍵作用。蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)、二氫丹參酮I(M17)和人參皂苷Rb1(M20)分別與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸如Val135、Phe67和Asp133等，以及T-loop區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸Leu88、Asp181和Cys218等形成了若干強(qiáng)度不同的疏水作用和氫鍵作用。

表2 小分子配體與GSK-3β殘基間的氫鍵相互作用Table 2 The hydrogen bond interactions between small molecule ligands and GSK-3β residues

氫鍵是維系蛋白質(zhì)與配體分子結(jié)合穩(wěn)定性的重要作用力。分別對(duì)蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)、二氫丹參酮I(M17)和人參皂苷Rb1(M20)與GSK-3β形成的氫鍵進(jìn)行了分析，并對(duì)模擬過程中10 ns至20 ns的運(yùn)動(dòng)軌跡中的氫鍵統(tǒng)計(jì)了存活率。判斷氫鍵采用的幾何依據(jù)為鍵長不大于3.5 ?，鍵角不大于30o。結(jié)果如表2所示。

從結(jié)果可見，形成的氫鍵均為配體中的含氧和含氮基團(tuán)與蛋白的殘基之間的氫鍵，表明配體的含氧和含氮基團(tuán)為形成氫鍵的關(guān)鍵部分。蘆丁(M01)與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域的殘基Asp133和Gln185 形成了3個(gè)主要?dú)滏I，其中兩個(gè)氫鍵的存活率達(dá)到95%以上，是其能夠與GSK-3β的ATP結(jié)合區(qū)域形成穩(wěn)定相互作用的主要原因，另外，蘆丁(M01)與GSK-3β的T-loop區(qū)域的殘基Leu88、Gly202和Glu125形成了4個(gè)主要?dú)滏I，然而其存活率均僅在40%左右，氫鍵的穩(wěn)定性小于在ATP結(jié)合口袋區(qū)域的氫鍵，這也是蘆丁(M01)更傾向于與GSK-3β的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合的原因。楊酶酮(M16)與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域的殘基Val135形成了一個(gè)存活率為65%的氫鍵，相較于與T-loop區(qū)域的殘基Asp181和Asp200形成的存活率分別為20%和5%的兩個(gè)氫鍵更穩(wěn)定，是該化合物更傾向于與GSK-3β的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合的原因。二氫丹參酮I(M17)與GSK-3β的ATP結(jié)合區(qū)域的殘基Lys85形成存活率為35%的氫鍵，相較于與T-loop區(qū)域的殘基Arg96形成的存活率4%左右的三個(gè)氫鍵更加穩(wěn)定，因此，二氫丹參酮I(M17)更傾向結(jié)合于GSK-3β的ATP結(jié)合區(qū)域。

另外，人參皂苷Rb1(M20)與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域的殘基Asn186和Lys183形成兩個(gè)氫鍵，存活率分別為8%和5%，氫鍵并不穩(wěn)定，與T-loop區(qū)域的殘基Lys183、Asp181、Tyr222、Ser219和Ile217形成了6個(gè)氫鍵，存活率分別為17%、5%、8%、11%、16%和28%，盡管存活率不高，但是由于形成氫鍵數(shù)目較多，并且存活率高于與ATP結(jié)合口袋區(qū)域形成的氫鍵，故人參皂苷Rb1(M20)更易結(jié)合于T-loop區(qū)域。

綜上可見，所研究的4個(gè)配體與GSK-3β的殘基形成氫鍵的數(shù)目和穩(wěn)定性，與其和ATP結(jié)合區(qū)域和T-loop區(qū)域的結(jié)合能力具有相同的趨勢(shì)，是影響化合物與GSK-3β結(jié)合能力的重要影響因素。

2.3 結(jié)合自由能分析

由于對(duì)接得到的結(jié)合能量只考慮了分子內(nèi)能和分子間的能量，是較為粗糙的，并且也沒有考慮溶劑對(duì)配體結(jié)合的影響，為了更準(zhǔn)確反應(yīng)配體和蛋白在水溶劑作用下的結(jié)合能量，采用MM-PBSA(Molecular Mechanics-Poisson Bolzmann Surface Area,分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積)方法計(jì)算了配體與GSK-3β的結(jié)合自由能，結(jié)果如表3所示。

將結(jié)合自由能分為范德華力、靜電力、極性溶劑化能和非極性溶劑化能四個(gè)部分。從表3中可見，蘆丁(M01)、楊酶酮(M16)和二氫丹參酮I(M17)在ATP結(jié)合口袋內(nèi)的結(jié)合能量均大于在T-loop區(qū)域的能量，這與前述分子對(duì)接能量分析和分子動(dòng)力學(xué)氫鍵分析的結(jié)果一致，這主要是由于小分子配體與GSK-3β的ATP結(jié)合口袋區(qū)域形成了更為穩(wěn)定的氫鍵的原因，并且從結(jié)合自由能的分解可見，范德華力，靜電力和非極性溶劑化能有利于配體的結(jié)合，而極性溶劑化能對(duì)配體的結(jié)合是不利的。另外，人參皂苷Rb1(M20)與GSK-3β的T-loop區(qū)域的結(jié)合自由能大于ATP結(jié)合口袋區(qū)域的結(jié)合自由能。這表明人參皂苷Rb1(M20)更易結(jié)合于T-loop區(qū)域從而起到抑制作用，與前述結(jié)果一致，研究類似與人參皂苷Rb1(M20)的相關(guān)結(jié)構(gòu)化合物，特別是其與GSK-3β的T-loop區(qū)域形成氫鍵部分的結(jié)構(gòu)，有可能獲得與GSK-3β的T-loop區(qū)域具有相互作用的抑制劑。

表3 配體與GSK-3β相互作用的結(jié)合自由能分析結(jié)果Table 3 Binding free-energy analysis of the interaction between ligands and GSK-3β

3 結(jié)論

以一類中草藥的活性成分為研究對(duì)象，通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，蘆丁、楊酶酮、二氫丹參酮I和人參皂苷Rb1能夠與GSK-3β良好地結(jié)合，其中，蘆丁、楊酶酮、二氫丹參酮I主要結(jié)合于GSK-3β的ATP結(jié)合口袋，人參皂苷Rb1主要結(jié)合于GSK-3β的T-loop區(qū)域。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬獲取了配體與蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定構(gòu)象，通過氫鍵分析發(fā)現(xiàn)，配體和蛋白形成的氫鍵的數(shù)目和存活率是影響抑制能力的主要因素，氫鍵的形成主要取決于配體的含氧和含氮基團(tuán)與蛋白殘基的相互作用?；谌藚⒃碥誖b1的結(jié)構(gòu)，特別是其與GSK-3β的T-loop區(qū)域殘基形成氫鍵部分的結(jié)構(gòu)，通過分子設(shè)計(jì)有望獲得結(jié)合于GSK-3β的T-loop區(qū)域的有效抑制劑。