Nod樣受體蛋白3炎性小體在腦缺血再灌注損傷中的研究現(xiàn)狀

丁承程，李國忠

Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是骨髓源性的巨噬細(xì)胞中的固有免疫相關(guān)蛋白復(fù)合物，除了能夠參與介導(dǎo)、調(diào)控多種免疫反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞死亡和組織損傷，還促進(jìn)了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。NLRP3炎性小體的激活是一個多因素參與的過程，目前對于其機(jī)制的研究尚不明確，本文對NLRP3炎性小體與腦缺血再灌注關(guān)系的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 Nod樣受體蛋白3炎性小體

炎性小體是胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，典型組成包括Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）前體[1]。

NLR是一類胞內(nèi)模式識別受體（pattern- recognition receptors，PRRs），由N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和中央的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域組成。其中N端結(jié)構(gòu)域已知有4種：嘌呤結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD）、caspase募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）、桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculoviral IAP repeat，BIR）結(jié)構(gòu)域和酸性反式激活結(jié)構(gòu)域。ASC由PYD和CARD兩部分組成，這兩部分作為雙重接頭蛋白分子，以橋梁的形式將NLRP3及半胱天冬酶原-1連接起來形成炎性小體。每個NLRP3炎性小體有兩個半胱天冬酶原-1，ASC通過調(diào)節(jié)兩個單體的空間構(gòu)象，使之成為有活性的半胱天冬酶-1（p20）和無活性的半胱天冬酶原（p10）兩個亞基。p20能夠剪切白介素前體（pro-IL）-1β和pro-IL-18，引起細(xì)胞凋亡[1]。

2 Nod樣受體蛋白3炎性小體的活化機(jī)制

NLRP3可識別多種激活物，外源性的激活物常見多種細(xì)菌，內(nèi)源性的有尿酸鹽結(jié)晶、ATP、脂質(zhì)體、活性氧（reactive oxygen spieces，ROS）、補(bǔ)體、淀粉樣小體和錯誤折疊的蛋白等[2]。

NLRP3炎性小體在體內(nèi)處于自身抑制狀態(tài)，但是易于被激活。腦缺血再灌注時會發(fā)生自由基損傷、鈣超載、微循環(huán)障礙及白細(xì)胞（主要是中性粒）損傷作用，這些損傷都能夠被NLRP3識別。NLRP3炎性小體的激活機(jī)制還未完全明確，目前認(rèn)為有以下幾種。

2.1 活性氧及線粒體功能紊亂介導(dǎo)活化機(jī)制 ROS可引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在腦缺血再灌注時大量產(chǎn)生ROS。其來源一般有兩種：線粒體和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。線粒體的活性氧（mitochondrial ROS，mROS）作為線粒體的產(chǎn)物能激活NLRP3炎性小體，也是形成成熟IL-1β所需的第二信號[3]。有研究表明，用mROS清除劑二苯基氯化碘（diphenyliodonium chloride，DPI）處理小鼠的巨噬細(xì)胞后，脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3及IL-1β、IL-18表達(dá)量降低，但這一現(xiàn)象只在NLRP3炎性小體啟動的這一過程能夠觀察到[4]。細(xì)胞質(zhì)中NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS最初被認(rèn)為是NLRP3炎性小體活化所需信號，并且有化學(xué)抑制劑的實驗支持這一理論[5]。有研究顯示，人外周血單核細(xì)胞和鼠的巨噬細(xì)胞缺乏有活性的NADPH氧化酶，但是仍能觀察到有NLRP3炎性小體的活化[6]。

用化學(xué)抑制劑擾亂線粒體功能，可觀察到NLRP3炎性小體的激活[7]。然而，化學(xué)抑制劑會產(chǎn)生副產(chǎn)物，尤其在高濃度的時候，所以該機(jī)制尚有爭議。另外，氧化的線粒體的DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，能與NLRP3相互作用，并引起NLRP3下游的活化[8]。

2.2 低氧介導(dǎo)激活 腦缺血再灌注損傷伴隨著低氧，造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)及酸堿平衡紊亂。有研究證實，小鼠在腦低氧環(huán)境下能夠增加NLRP3的基因及其蛋白的表達(dá)，并通過限制pro-IL-1β的自噬使其水平升高。腦缺氧早期，海馬和丘腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞中就能觀察到NLRP3，之后發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)[9]。另有研究表明，人前列腺上皮細(xì)胞在低氧環(huán)境下有NLRP3、黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和pro-IL-1β的表達(dá)升高。

2.3 鉀外流介導(dǎo)激活 在經(jīng)典通路及非經(jīng)典通路中鉀離子外流都是NLRP3炎性小體活化的必需條件[10]。大部分NLRP3的激活物，如ATP、尼日利亞菌素和顆粒物質(zhì)都能夠造成鉀離子外流，從而引起NLRP3炎性小體活化。在非細(xì)胞系統(tǒng)中，低濃度的鉀離子也能夠引發(fā)NLRP3炎性小體聚集[11]。鉀離子的外流加速了NLRP3炎性小體的活化。在鉀離子無法外流的情況下，NLRP3炎性小體在巨噬細(xì)胞中發(fā)生活化突變體，且不被細(xì)胞外高鉀離子濃度所影響[12]。這提示了細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度的降低可能誘發(fā)NLRP3炎性小體構(gòu)象的改變。

2.4 溶酶體破裂 微粒物質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)吞作用、損傷溶酶體膜，導(dǎo)致組織蛋白酶B釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活NLRP3炎性小體[13]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的組織蛋白酶B、顆粒物質(zhì)也引起K離子外流，進(jìn)一步激活NLRP3炎性小體[14]。用組織蛋白酶B抑制劑CA-074-Me處理巨噬細(xì)胞能導(dǎo)致NLRP3活化被抑制。但組織蛋白酶B缺陷的巨噬細(xì)胞中NLRP3無法被微粒物質(zhì)激活，而IL-1β并沒有減少，因此推測溶酶體破裂釋放組織蛋白酶B在激活NLRP3炎性小體中僅起到部分作用[15]。

2.5 其他機(jī)制 NLRP3炎性小體的活化多需要鈣離子的參與，一方面是因為鈣離子動員可引起鉀離子外流，另一方面是因為腦缺血再灌注時，鈣超載促進(jìn)線粒體損傷，釋放更多ROS，進(jìn)一步活化NLRP3炎性小體。但是鈣離子對AIM2和NLR家族CARD域蛋白4（NODlike receptor family CARD-containing 4 protein，NLRC4）炎性小體的活化沒有作用[16]。鈣離子螯合劑可抑制IL-1β的分泌[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)鈣池在此過程中起重要作用，使用藥物抑制劑或是shRNA敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子釋放通道，可減弱鈣離子動員及NLRP3炎性小體活化[18]。

3 腦缺血情況下可影響NLRP3炎性小體的藥物

3.1 夾竹桃麻素 NADPH和夾竹桃麻素都能顯著減少腦缺血再灌注損傷引起的NADPH氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）2、NOX4和ROS的增加，顯著抑制核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）磷酸化和降解，NF-κBp65的核定位，還有NF-κB靶基因環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）2的表達(dá)和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)。在大鼠腦梗死模型中，NADPH和夾竹桃麻素都能抑制缺血的大腦皮層NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)，并能減少腦梗死體積，提高梗死后的存活率及神經(jīng)功能的恢復(fù)[19]。

3.2 鳶尾素 鳶尾素是骨骼肌來源的激素，可在不同物種的各種組織中合成，有抗腦缺血性損傷及腦保護(hù)作用。研究表明，神經(jīng)元氧糖剝奪后，鳶尾素及其前體蛋白Ⅲ型纖維蛋白結(jié)構(gòu)域5表達(dá)明顯減少，而氧化應(yīng)激和ROS-NLRP3信號被激活；用鳶尾素或NLRP3抑制劑能夠抑制氧糖剝奪引起的氧化應(yīng)激和炎癥，且鳶尾素的調(diào)節(jié)作用可被NLRP3過表達(dá)抑制。因此，鳶尾素可能通過抑制ROS-NLRP3信號通路減輕氧糖剝奪引起的神經(jīng)元損傷[20]。

3.3 核因子E2相關(guān)因子2相關(guān)藥物 有研究表明核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）在腦缺血再灌注損傷中能通過硫氧還蛋白（thioredoxin-1，Trx1）/硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）抑制NLRP3炎性小體的形成的，從而起到腦保護(hù)作用。TXNIP從Trx1/TXNIP復(fù)合體分離下來，與NLRP3活化密切相關(guān)。在肝損傷和嚴(yán)重的狼瘡性腎炎患者中證實，Nrf2能促進(jìn)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）基因激活，抑制NLRP3炎性小體活化。小鼠大腦中動脈閉塞模型中，叔丁基對苯二酚治療上調(diào)Nrf2之后，TXNIP、NLRP3及caspase-1、IL-18、IL-1β的表達(dá)均明顯減少，而敲除Nrf2和Trx1則相反，在敲除Trx1時還抑制了Nrf2的保護(hù)作用。該研究認(rèn)為，在腦缺血再灌注損傷時Nrf2通過對Trx1/TXNIP復(fù)合體的調(diào)節(jié)抑制NLRP3炎性小體的活化[21]。

在氧糖剝離再灌注模型建立之前用叔丁基對苯二酚或Nrf2 CRISPR質(zhì)粒對BV2細(xì)胞做預(yù)處理，Nrf2活化可抑制NLRP3炎性小體的表達(dá)及下游IL-1β的形成。并且，NLRP3炎性小體的活化對ROS水平很敏感，Nrf2能夠降低ROS的產(chǎn)生。另外，作為一個Nrf2靶向ARE的基因，NADPH醌氧化還原酶參與了NLRP3炎性小體的抑制[22]。這給腦缺血再灌注損傷提供了一個新的治療靶點。

3.4 白藜蘆醇 白藜蘆醇是一種特異的去乙酰化酶沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（silent mating-type information regulator2 homolog 1，Sirt1）激動劑，有研究表明它通過抑制NLRP3炎性小體活化后Sirt1依賴的自噬活動來改善腦缺血再灌注損傷。在大鼠大腦中動脈閉塞模型中，病變側(cè)大腦半球NLRP3、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18表達(dá)上升，并上調(diào)自噬活動。白藜蘆醇可減輕缺血再灌注損傷中NLRP3炎性小體引起的炎癥反應(yīng)，下調(diào)自噬，減小腦梗死體積、減輕腦水腫，提高大鼠的神經(jīng)功能評分。該抑制作用能夠被腦室內(nèi)的注射白藜蘆醇抑制劑3-MA阻斷。轉(zhuǎn)染Sirt1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）能阻斷白藜蘆醇對自噬活動的抑制，并抑制NLRP3炎性小體的活化[23]。

3.5 蘿卜硫素 蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不清楚。用SFN處理大腦中動脈閉塞大鼠，可抑制炎性小體活化及半胱天冬酶-1，IL-1β和IL-18的表達(dá)，減少腦梗死體積，提高神經(jīng)功能評分，減少中性粒細(xì)胞浸潤[24]。

3.6 其他 有研究提示，間歇性禁食、靜脈注射免疫球蛋白、米諾環(huán)素、大黃酚、酪氨酸激酶等均能在腦缺血再灌注中抑制NLRP3炎性小體的活化[25-29]。傘形花內(nèi)酯可通過上調(diào)過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）γ的表達(dá)抑制TXNIP/NLRP3炎性小體[30]。

綜上所述，NLRP3在腦缺血再灌注損傷中是通過形成炎性小體，介導(dǎo)IL-1β等的產(chǎn)生，在固有免疫中起重要作用。很多針對NLRP3炎性小體的藥物也在動物實驗中取得良好的效果。但是由于鼠NLR家族成員與人NLR家族成員不完全相同，NLRP3炎性小體在人體中確切活化機(jī)制仍不明確，人體中NLRP3對炎癥損傷的介導(dǎo)機(jī)制及治療靶點仍需進(jìn)一步研究。

【點睛】Nod樣受體蛋白3炎性小體能夠識別腦缺血再灌注的損傷信號并誘發(fā)炎癥趨化，最終引起腦組織損傷。