維生素E和/或檸檬酸添加劑對軍曹魚稚幼魚ACO和PPARα基因、抗氧化酶活力和多不飽和脂肪酸代謝的影響

■丁兆坤 黃金華 李偉峰 許友卿

（廣西大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)研究所廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖和營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

軍曹魚是一種生長快、養(yǎng)殖發(fā)展迅猛的優(yōu)良海水魚[1-4]。然而，為了開發(fā)適宜的人工配合飼料，還需要進(jìn)一步研究軍曹魚的營養(yǎng)生理學(xué)[5-8]。

維生素E是軍曹魚和其他魚類必不可少的微量營養(yǎng)物質(zhì)[9-10]，具有重要的生理生化功能[11-14]。日糧添加維生素E還可以防止魚體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維護(hù)魚體氧化穩(wěn)定性，降低魚的氧化應(yīng)激，提高魚的免疫力和抗病力，促進(jìn)魚生長性能和存活率[15-18]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是機(jī)體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)代謝和基因表達(dá)的一種基因[19-20]。維生素E是PPARα的一種激動劑，對PPARα的表達(dá)有重要影響[7，21-22]。

檸檬酸(CA)能夠提高魚[23-27]和蝦[28]的生長性能、飼料利用率和存活率。檸檬酸是一種有機(jī)酸，具有多種營養(yǎng)生理功能，是一種環(huán)境友好型的飼料添加劑[28-30]。檸檬酸是一種優(yōu)秀的抗氧化劑，能夠有效清除體內(nèi)外超氧離子和脂質(zhì)過氧化物，減輕動物的氧化應(yīng)激[31-32]。檸檬酸也是一種優(yōu)秀的抗氧化協(xié)同劑，能夠有效促進(jìn)抗氧化酶的活力[32-33]。檸檬酸可以通過檸檬酸循環(huán)促進(jìn)機(jī)體代謝和順烏頭酸酶(ACO)基因的表達(dá)[34]。順烏頭酸酶(ACO)是機(jī)體內(nèi)檸檬酸循環(huán)中催化檸檬酸和異檸檬酸相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[34]。

在日糧中聯(lián)合添加維生素E和檸檬酸可能對動物的生理生化過程起協(xié)同作用[33]。然而，日糧中聯(lián)合添加維生素E和檸檬酸對軍曹魚稚幼魚的影響還未見報道。本文研究不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑對軍曹魚稚幼魚主要組織/器官的ACO和PPARα基因表達(dá)、抗氧化酶活力和多不飽和脂肪酸代謝的影響，同時討論其機(jī)制，為開發(fā)適合軍曹魚稚幼魚配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要飼料原料

維生素E購于美國Sigma-Aldrich公司，是從植物油中提取而得的(±)-α-生育酚，V型，1 000 IU/g(Sigma T3634)。北太平洋白魚粉(蛋白質(zhì)＞65%)和魚油，購于美國海鮮公司。其他原料均是人類食品級，購于國內(nèi)不同生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚的馴化和養(yǎng)殖

從湛江流沙海水魚種苗場購進(jìn)2 000尾軍曹魚稚魚，魚齡為22 d，體重約2.5 g，體長約3.68 cm。先按照Ding等[7]的方法在廣西防城港市北部灣海濱室內(nèi)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)馴化2周。馴化結(jié)束后，挑選大小一致，體長(8.02±0.32)cm、體重(7.32±0.26)g的健壯稚魚420尾隨機(jī)分成7組，每組3個平行，共21桶(每桶容積為400 L)，每桶20尾魚，用與馴化相同的養(yǎng)殖系統(tǒng)和海水(過濾、充氣的海水，水溫26.0～32.0℃，鹽度27～30 g/l，pH值7.8～8.0，溶氧量≥6 mg/l)養(yǎng)殖。按照Ding等[7]方法飼養(yǎng)和處理魚。每天定時在8:00和17:00投喂兩次，分別用7種(組)飼料投喂魚。這7種(組)飼料分別是：對照組(D0)，只含基礎(chǔ)飼料，不添加VE和CA；實(shí)驗(yàn)飼料D1～D6組，在每千克干的基礎(chǔ)飼料中分別添加VE 100、0、100、75、50、25 IU和CA 0、12、12、6、3、1.5 g(見表1)。

基礎(chǔ)飼料是在我們前期的試驗(yàn)[3-4，7]基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，如表1所示，由白魚粉、豆粕、酪蛋白、大豆磷脂、魚油、混合維生素(不含VE)、混合礦物質(zhì)和α-淀粉組成，其蛋白質(zhì)和脂肪的含量分別約為47%和11%。維生素E的添加量參考了其他學(xué)者的研究結(jié)果和我們的前期試驗(yàn)[4，7，9-10，17，35]。據(jù)報道，維生素 E(α-tocopherol或者DL-all-rac-α-tocopherol)在對照組日糧中的含量為25.70 IU/kg干飼料(1.1 IU DL-all-rac-α-tocopherol相等于1 mg)[36]，已經(jīng)基本滿足軍曹魚稚幼魚生存的需求，因?yàn)槠胀B(yǎng)魚的VE需求在6.25～200.0 mg生育酚乙酸酯/kg干飼料(1 IU生育酚乙酸酯相等于1 mg)[36]范圍之內(nèi)[9-10]。檸檬酸的添加量參考了Sarker等[37]的研究，他們稱在以部分植物蛋白質(zhì)為蛋白源的魚類日糧中，高效的檸檬酸添加水平應(yīng)不超過10.0 g/kg干飼料。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料的基礎(chǔ)成分及營養(yǎng)水平

這個實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考了 Cheng等[38]、Pohlenz等[39]和Ding等[7]的方法，設(shè)計(jì)不僅考察了單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)對軍曹魚稚幼魚的影響，又考察了聯(lián)合添加VE和CA(D3～D6組)對魚的影響。

按照Ding等[7]方法，采用丸狀日糧投喂魚，即按照表1的飼料成分、數(shù)量、比例和分組進(jìn)行，在室溫下制成丸狀日糧，在60℃下烘干，于4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆?。在投喂之前，取出在室溫下解凍待用。日總投喂量約為當(dāng)時魚體濕重的5%并要求達(dá)到明顯的飽感。實(shí)驗(yàn)歷時12周。

1.3 取樣和化學(xué)分析

于第12周末，每個養(yǎng)殖桶隨機(jī)取6尾魚解剖取組織/器官樣品。取樣前，魚禁食24 h。按照Ding等[7]的方法采樣和保存所取得的魚肝、肌肉、腦、心臟、腎和血清樣品。

按Xu等[40]的方法，用氣相色譜儀(GC，Agilent 6890 N，Agilent Company，USA)測定魚組織/器官中的脂肪酸含量。分別按照McCord等[41]、Aebi[42]和Noguchi等[43]的方法，測定魚組織/器官中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力。用南京建成生物公司生產(chǎn)的谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒，按照使用說明書，測定魚組織/器官中的GST活力。

分別按照Peng等[16]和Weikle[44]的方法，用高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1200，Agilent Company，USA)測定飼料中VE和CA含量。

用德國產(chǎn)梅特勒pH計(jì)測定飼料pH值。采用AOAC(1995)[45]標(biāo)準(zhǔn)方法測定飼料中的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分和水分含量。

1.4 魚組織器官中順烏頭酸酶(ACO)基因序列的測定

軍曹魚的ACO基因序列還未見報道。我們從NCBI（the National Center for Biotechnology Informa-tion)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索到從斑馬魚(Danio rerio)克隆獲得的ACO基因的保守序列(NM_198908)，以其作為模板合成軍曹魚稚幼魚的首條cDNA。選擇特定正向引物5′CTAGTGCTGGGGCTAAATATGG 3′和 反 向 引 物 5′TGACATTGGGACACTTCAACTC 3′來擴(kuò)增cDNA片段。按Ding等[7]的方法，測定軍曹魚ACO基因序列。

1.5 ACO mRNAs和 PPARα mRNAs的表達(dá)

分別用合成的ACO和PPARα基因首條cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR測定。按照上述ACO基因測序所描述的克隆軍曹魚cDNA的方法，設(shè)計(jì)ACO基因的正向引物和反向引物。

根據(jù)已公布的軍曹魚cDNA(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)來設(shè)計(jì)PPARα基因的正向引物和反向引物。分別為ACO和PPARα設(shè)計(jì)β-肌動蛋白(EU266539)的引物(見表2)。按Ding等[7]的方法進(jìn)行ACO或者PPARα基因的RTQ-PCR測定。用2-ΔΔCT法計(jì)算ACO和PPARα mRNA的相對表達(dá)量[46]。

表2 ACO、PPARα和β-actin基因的RTQ-PCR引物

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著時采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，當(dāng)P＜0.05時，為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 軍曹魚稚幼魚的ACO基因序列

以斑馬魚ACO基因的保守序列為模板，合成軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列是219 bp。該序列如表3所示，未提交到GenBank基因庫。用NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information's Basic Local Alignment Search Tool)，把軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列與斑馬魚(Danio rerio)(NM 198908.1)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(XM 003438531.1)的序列比較，發(fā)現(xiàn)軍曹魚ACO基因的部分DNA保守序列與斑馬魚(Danio rerio)(NM 198908.1)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(XM 003438531.1)的序列相似性分別是86%和90%。

表3 軍曹魚ACO基因部分DNA的保守序列

2.2 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚ACO mRNAs相對表達(dá)量的影響(見圖1)

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs相對表達(dá)量分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯(lián)合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs的相對表達(dá)量，分別顯著高于投喂單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應(yīng)組織/器官ACO mRNAs的相對表達(dá)量(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO mRNAs的相對表達(dá)量最高，分別顯著高于其他組魚ACO mRNAs的表達(dá)量(P＜0.05)。

2.3 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚PPARα mRNAs相對表達(dá)量的影響（見圖2）

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達(dá)量分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯(lián)合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達(dá)量，分別顯著高于投喂單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應(yīng)組織/器官PPARα mRNAs的相對表達(dá)量(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PPARα mRNAs的相對表達(dá)量最高，分別顯著高于其他組魚PPARα mRNAs的表達(dá)量(P＜0.05)。

圖1 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚ACO mRNAs表達(dá)量的影響

圖2 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚PPARα mRNAs表達(dá)量的影響

2.4 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚SOD、CAT、GPx和GST活力的影響(見表4)

由表4可知，用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST活力分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯(lián)合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST活力，分別顯著高于投喂單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚相應(yīng)組織/器官的抗氧化酶活力(P＜0.05)。其中D5組魚肝、肌肉、心臟、腦和腎SOD、CAT、GPx和GST的活力最高，分別顯著高于其他組魚相應(yīng)組織/器官的抗氧化酶活力(P＜0.05)。

表4 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肝、肌肉、心臟、腦、腎和血清的SOD、CAT、GPx和GST(U/mg prot.，但血清為U/ml)活力的影響

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，魚血清SOD、CAT、GPx和GST的活力分別顯著高于對照組（D0）(P＜0.05)。投喂聯(lián)合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)血清CAT和GST的活力，分別顯著高于投喂單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)日糧的魚的血清CAT和GST活力(P＜0.05)。然而，血清SOD、CAT、GPx和 GST的最高活力不同于肝、肌肉、心臟、腦和腎的結(jié)果。D5組魚血清SOD活力最高，顯著高于其他組魚血清SOD活力(P＜0.05)。D4組魚血清CAT活力最高，顯著高于其他組魚血清CAT活力(P＜0.05)。D6組魚血清GPx活力最高，顯著高于D0、D1～D4組魚血清GPx活力(P＜0.05)。D4組魚的血清GST活力最高，顯著高于D0、D1～D3組和D6組魚血清GST活力(P＜0.05)。

2.5 用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，對魚脂肪酸含量的影響（見表5～表10）

用不同劑量VE和/或CA添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周，顯著影響其多不飽和脂肪酸代謝，魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs分別顯著高于對照組(D0)(P＜0.05)。投喂聯(lián)合添加VE和CA日糧的魚(D3～D6組)肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs，分別顯著高于投喂單獨(dú)添加VE（D1組）或CA(D2組)日糧的魚相應(yīng)組織/器官的PUFAs和n-3 HUFAs(P＜0.05)。其中D5組的魚肝、肌肉、心臟、腦和腎PUFAs和n-3 HUFAs最高，分別顯著高于其他組魚相應(yīng)組織/器官的PUFAs和n-3 HUFAs(P＜0.05)。

不同劑量VE和/或CA添加劑對魚血清中的脂肪酸代謝的影響不同于對魚肝、肌肉、心臟、腦和腎脂肪酸代謝的影響。D4組魚血清的PUFAs和n-3 HUFAs含量最高，顯著高于D0、D1～D3、D5組和D6組魚血清的PUFAs和n-3 HUFAs含量(P＜0.05)。

3 討論

與單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)或?qū)φ战M(D0)比較，用聯(lián)合添加VE和CA(D3～D6組)的日糧投喂軍曹魚稚幼魚12周，顯著提高魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因的表達(dá)量、SOD、CAT、GPx和GST活力以及PUFAs和n-3 HUFAs的含量。這些結(jié)果表明，添加在日糧中的VE和CA能協(xié)同作用，顯著提高軍曹魚稚幼魚ACO和PPARα基因表達(dá)、抗氧化酶活力以及PUFAs和n-3 HUFAs的含量。VE和CA協(xié)同作用的原理可能是：①VE和CA能夠協(xié)同調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)、提高抗氧化酶的活力。研究表明，VE是PPARα基因的激活劑，能夠促進(jìn)PPARα基因的表達(dá)[7，21-22]。VE 能夠顯著提高魚體中的抗氧化酶活力[7，17，47-48]。而

CA給VE提供了一個適宜的酸性環(huán)境，促進(jìn)VE發(fā)揮更好的作用。②VE通過激活脂肪丙烯醛基去飽和并延長之，促進(jìn)PUFAs合成，同時保護(hù)PUFAs免受過氧化。有研究報道，飼料添加VE可顯著提高魚肝和肌肉PUFAs含量而顯著降低SFAs含量[49-50]。③VE和CA都是高效抗氧化劑，它們通過分解和消除軍曹魚代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基，來協(xié)同保護(hù)和促進(jìn)軍曹魚的生理生化過程。VE和CA都能夠通過有效地清除超氧陰離子(·O2-)來協(xié)同抑制和切斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[51-53]。VE提供H原子給脂質(zhì)過氧物自由基(LOO·)生成脂質(zhì)過氧化物L(fēng)OOH，以切斷脂質(zhì)過氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[51]。脂質(zhì)過氧化物L(fēng)OOH是一種氧化性非常強(qiáng)的物質(zhì)，在有金屬離子中介的情況下，進(jìn)一步分解為自由基LOO·、LO·和·OH[33]，而VE不能進(jìn)一步清除LOOH，必須由其他抗氧化劑來清除LOOH[51]。當(dāng)日糧同時添加VE和CA時，CA能夠抑制LOOH生成[33]。盡管CA不是主要的抗氧化劑，但是CA是一個良好的抗氧化劑協(xié)同劑。VE和CA也可能互相再生來擴(kuò)增它們的功能[33]。因此，在日糧中聯(lián)合添加VE和CA能夠協(xié)同提高軍曹魚的ACO和PPARα基因的表達(dá)、抗氧化酶活力、PUFAs和n-3 HUFAs含量。

表5 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肝臟脂肪酸的影響(%)

表6 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚肌肉脂肪酸的影響(%)

表7 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚心臟脂肪酸的影響(%)

表8 不同劑量維生素E和/或檸檬酸添加劑投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚腦脂肪酸的影響(%)

表9 不同劑量維生素E和/或檸檬酸投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚腎脂肪酸的影響(%)

表10 不同劑量維生素E和/或檸檬酸投喂軍曹魚稚幼魚12周對魚血清脂肪酸的影響(%)

盡管D3、D4組和D6組的日糧也聯(lián)合添加了VE和CA，但是D5組魚的效果最佳，D5組魚的ACO和PPARα基因表達(dá)、抗氧化酶活力，以及PUFAs和n-3 HUFAs含量顯著高于D3、D4組和D6組的魚。這些結(jié)果表明：日糧中聯(lián)合添加較高或較低的VE和CA的添加量(D3、D4組和D6組)的效果都不理想。因此，在日糧中適宜添加VE和CA是有益的。VE和CA的協(xié)同作用是劑量依賴性的，但有一個適宜的范圍。本實(shí)驗(yàn)D5組的VE和CA添加量(VE 50 IU和CA 3 g/kg干飼料)最適宜，因此發(fā)揮了最佳的協(xié)同作用。以前對羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）[54]、鯽魚（Carassius auratusgibelio）[55]和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[28]等的研究也表明，CA的適宜添加量為2.0～3.0 g/kg干飼料。蔡超等[56]也認(rèn)為，在魚飼料中添加CA不宜超過0.5%。

與對照組(D0)比較，單獨(dú)添加VE(D1組)能夠顯著提高軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因表達(dá)量、SOD、CAT、GPx和GST的活力以及PUFAs和n-3 PUFAs的含量。這個結(jié)果與Kim等[57]的試驗(yàn)結(jié)果一致，他們在雄性小鼠日糧中添加VE提高了小鼠肝臟中的PPAR-α基因表達(dá)量。Zhou等[17]、Lu等[48]和Ding等[7]也報道，日糧中添加VE能夠提高抗氧化酶的活力。這是因?yàn)閂E能夠降低氧化應(yīng)激。當(dāng)活性氧自由基過度累積時，PUFAs和抗氧化酶的活力會受到抑制[58]，而VE能夠有效地清除活性氧自由基[51]。

單獨(dú)添加CA(D2組)也能夠顯著提高軍曹魚肝臟、肌肉、心臟、腦和腎ACO和PPARα基因表達(dá)量、SOD、CAT、GPx和GST的活力以及PUFAs和n-3 PUFAs的含量。理由可能是：CA能夠提高抗應(yīng)激能力和抗氧化作用。作為一個高效抗氧化劑，CA能夠有效地清除超氧離子和螯合金屬離子來切斷脂質(zhì)過氧化物自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[59-60]，提高抗氧化能力。CA也是一種優(yōu)秀的抗氧化協(xié)同劑，能夠有效促進(jìn)抗氧化酶的活力[32-33]。Su 等[28]報道，日糧添加CA 2.0～5.0 g/kg干飼料，能夠顯著提高白蝦血清中的SOD活力。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料營養(yǎng)成分顯著影響著軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦、腎和血清的生理生化過程。然而，不同劑量VE和/或CA添加劑對軍曹魚血清中的抗氧化酶的活力、PUFAs含量的影響不同于對軍曹魚肝、肌肉、心臟、腦和腎相應(yīng)參數(shù)的影響。原因是：血清是魚體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不斷發(fā)生變化的一種介質(zhì)，血清酶的含量和功能會隨著許多因素如生理、營養(yǎng)、時間、溫度和其他環(huán)境因素的變化而變化[61]，不像肝、肌肉、心臟、腦和腎那樣相當(dāng)穩(wěn)定[7]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，日糧中添加不同劑量的VE和/或CA添加劑能夠顯著提高軍曹魚稚幼魚的ACO和PPARα基因表達(dá)量、抗氧化酶活力、PUFAs和n-3 HUFAs含量。聯(lián)合添加VE和CA具有協(xié)同作用，顯著高于單獨(dú)添加VE(D1組)或CA(D2組)者。最佳添加量是VE 50 IU和CA 3 g/kg干飼料。