動(dòng)植物蛋白比恒定的飼料中發(fā)酵豆粕對(duì)刺參生產(chǎn)性能、消化酶和非特異性免疫的影響

■ 包鵬云 叢玉婷 李曉宇 徐永平

(1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；3.動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧大連116620)

刺參屬于“海產(chǎn)八珍”之一，含有豐富的多糖、皂苷及膠原蛋白等多種生物活性物質(zhì)和礦物質(zhì)元素，具有藥食同補(bǔ)功能，對(duì)提高人體免疫力，抵抗各種疾病和應(yīng)激具有非常顯著的功效，頗受廣大消費(fèi)者的認(rèn)可，成為最受歡迎的海產(chǎn)品之一。通過(guò)最近15年的發(fā)展，刺參養(yǎng)殖業(yè)已處于平穩(wěn)發(fā)展階段，養(yǎng)殖技術(shù)日趨成熟，市場(chǎng)供需處于較為平衡的狀態(tài)。2015年，刺參全國(guó)總產(chǎn)量達(dá)到20.58萬(wàn)噸[1]，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值約300多億元，刺參已經(jīng)成為我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中單一品種，產(chǎn)值和經(jīng)濟(jì)效益最高的品種。刺參產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為北方沿海地區(qū)第一大漁業(yè)產(chǎn)業(yè)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)漁業(yè)增效、漁民增收，促進(jìn)北方沿海地區(qū)新農(nóng)村建設(shè)和漁業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

刺參屬于低等的棘皮動(dòng)物，是底棲的，腐屑食性，雜食性偏植物性的海洋經(jīng)濟(jì)類(lèi)養(yǎng)殖動(dòng)物。其索餌空間狹小，活動(dòng)距離短，不能像魚(yú)、蝦等游泳動(dòng)物一樣自由活動(dòng)和選擇最適的生存環(huán)境和優(yōu)質(zhì)餌料，優(yōu)質(zhì)天然餌料的獲取是刺參生長(zhǎng)非常重要的限制性因素之一。隨著刺參大規(guī)模池塘養(yǎng)殖和海上浮筏網(wǎng)籠養(yǎng)殖的開(kāi)展，天然餌料已不能滿足刺參規(guī)?；B(yǎng)殖的實(shí)際需要，人工配合飼料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用成為刺參營(yíng)養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)研究的熱點(diǎn)。

決定刺參健康、生長(zhǎng)和產(chǎn)品品質(zhì)的主要營(yíng)養(yǎng)成分是飼料中的蛋白質(zhì)，飼料中所需的動(dòng)物蛋白源的價(jià)格遠(yuǎn)高于植物蛋白源的價(jià)格，又因刺參的食性決定了其所攝食的配合飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)濃度較低，動(dòng)物蛋白源又必不可少，為了控制刺參飼料成本，實(shí)現(xiàn)刺參飼料的營(yíng)養(yǎng)平衡、環(huán)保與高效利用，本試驗(yàn)在前期研究確定飼料中動(dòng)植物蛋白比為1∶3時(shí)，刺參有最佳生長(zhǎng)效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究飼料中發(fā)酵豆粕添加量對(duì)刺參生產(chǎn)性能和消化酶、免疫酶活性的影響，以期為動(dòng)植物蛋白源魚(yú)粉、發(fā)酵豆粕、豆粕等在刺參配合飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料配制

刺參配合飼料按等氮等脂原則設(shè)計(jì)和配制，生產(chǎn)魚(yú)粉含量為6.5%，動(dòng)植物蛋白比為1∶3的6種配合飼料（D0為對(duì)照組，D4%、D8%、D12%、D16%、D20%五個(gè)試驗(yàn)組飼料是用發(fā)酵豆粕按4%、8%、12%、16%和20%的比例取代日糧中豆粕）。其中以魚(yú)粉、大豆粕、發(fā)酵豆粕、玉米蛋白粉為動(dòng)植物蛋白源，以馬尾藻粉和α-淀粉為碳水化合物，以魚(yú)油為脂肪源。所有飼料原料用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后95%以上過(guò)200目篩網(wǎng)，而后試驗(yàn)用制粒機(jī)制成直徑5 mm的硬顆粒飼料，45℃風(fēng)干后裝于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

試驗(yàn)刺參，暫養(yǎng)階段的刺參放于室內(nèi)可控溫的水槽中投喂商品飼料,暫養(yǎng)15 d，溫度控制在(12±1)℃,使之逐漸適應(yīng)試驗(yàn)水環(huán)境。暫養(yǎng)結(jié)束后，試驗(yàn)刺參饑餓24 h，稱(chēng)重，挑選個(gè)體大小均勻的健康刺參隨機(jī)分配到18個(gè)水槽(60 cm×40 cm×40 cm)中進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。選取初始體重為(44.47±1.45)g刺參，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行組15頭刺參。正式試驗(yàn)持續(xù)40 d。每天投喂飼料為刺參體重的3%，以后根據(jù)每天各水槽中刺參的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整投喂量，以1～2 h攝食完為準(zhǔn),每天早晚各投喂1次,吸除殘餌和糞便，每天換新鮮海水三分之一。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫控制在12～15 ℃，鹽度28～32，pH值7.8～8.5，溶解氧高于5 mg/l，氨氮不高于 0.2 mg/l，亞硝氮不高于0.1 mg/l。

1.3 稱(chēng)重與酶活性的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，將刺參饑餓24 h以排空其腸道內(nèi)的糞便，用干燥的白毛巾吸干體表水分，稱(chēng)刺參的終末體重；從每個(gè)水槽取5頭刺參，用醫(yī)用注射器抽取體腔液4～5 ml后，將刺參于冰盤(pán)上解剖，用生理鹽水沖洗消化道內(nèi)容物，然后將生理鹽水與消化道內(nèi)含物按10∶1混合，并于冰浴下進(jìn)行勻漿，4℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行消化酶活性的測(cè)定。體腔液也進(jìn)一步在冰浴中用勻漿器勻漿，以便將各種細(xì)胞中的酶釋放出來(lái)，在4℃時(shí)，12 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于離心管中，在-80℃冰箱保存，待測(cè)定各項(xiàng)酶指標(biāo)。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性和總抗氧化能力的測(cè)定均采用試劑盒法（南京建成生物工程研究所）測(cè)定，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

試驗(yàn)飼料和刺參體壁營(yíng)養(yǎng)成分含量采用概率養(yǎng)分分析方法測(cè)定：干物質(zhì)含量采用烘干法測(cè)定，105℃烘干至恒重；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定；粗灰分含量采用高溫灼燒法測(cè)定，在550℃灼燒至恒重[2]。

特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(lnW2-lnW1)/t增重率(%)=100×(W2-W1)/W1體壁系數(shù)(%)=100×FBW/W2

式中：W1——刺參的初始體重（g）；

W2——刺參的末體重（g）；

FBW——刺參的終末體壁重（g）；

t——試驗(yàn)時(shí)間（d）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA),采用Duncan′s法多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，用不同字母進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果

表2 飼料中發(fā)酵豆粕含量對(duì)刺參生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，本試驗(yàn)中對(duì)照組刺參增重率、特定生長(zhǎng)率和終末體壁重均小于發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組，且對(duì)照組的刺參增重率、特定生長(zhǎng)率和終末體壁重與試驗(yàn)組D12%、D16%和D20%比較差異顯著(P＜0.05)，而各組間刺參體壁系數(shù)差異不顯著。刺參增重率、特定生長(zhǎng)率和終末體壁重都是隨著飼料中發(fā)酵豆粕含量的升高而先升高后降低，當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量提高到16%時(shí)，刺參增重率、特定生長(zhǎng)率和終末體壁重達(dá)到最大值，高于對(duì)照組和試驗(yàn)組。結(jié)果表明：當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量提高到16%時(shí)，本試驗(yàn)中刺參各項(xiàng)生產(chǎn)性能指標(biāo)達(dá)到最優(yōu)。

表3飼料中發(fā)酵豆粕含量對(duì)刺參體壁營(yíng)養(yǎng)成分的影響(干物質(zhì))（%）

由表3可知，與對(duì)照組相比，各發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組對(duì)刺參體壁營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分)無(wú)顯著性影響,但各組間刺參體壁營(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白質(zhì)含量存在差異。刺參體壁干物質(zhì)含量在7.80%～8.11%之間；粗蛋白質(zhì)含量在38.16%～43.17%之間，發(fā)酵豆粕16%試驗(yàn)組刺參粗蛋白質(zhì)含量最高，豆粕含量20%的對(duì)照組刺參粗蛋白質(zhì)含量最低；粗脂肪含量在4.19%～4.50%之間；粗灰分含量在30.15%～33.85%之間。

表4 飼料中發(fā)酵豆粕含量對(duì)刺參消化酶活性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，發(fā)酵豆粕顯著性影響胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性(P＜0.05)。試驗(yàn)組中隨著發(fā)酵豆粕含量的提高，胃蛋白酶和胰蛋白酶活性隨之升高，脂肪酶和淀粉酶也有類(lèi)似的變化趨勢(shì)。發(fā)酵豆粕含量為20%時(shí)，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最高，與發(fā)酵豆粕含量16%的試驗(yàn)組差異不顯著,與其他各組比較差異顯著(P＜0.05)。豆粕含量20%對(duì)照組，刺參胃蛋白酶、胰蛋白酶活性最低，與其它各組比較差異顯著。對(duì)照組與發(fā)酵豆粕4%、8%、12%的試驗(yàn)組之間脂肪酶活性差異不顯著，但對(duì)照組脂肪酶活性顯著性(P＜0.05)低于發(fā)酵豆粕含量16%、20%的試驗(yàn)組，發(fā)酵豆粕16%和20%的試驗(yàn)組間脂肪酶活性差異不顯著。

表5 飼料中發(fā)酵豆粕含量對(duì)刺參體液關(guān)鍵酶活性的影響

由表5可知，本試驗(yàn)中除堿性磷酸酶外，對(duì)照組與發(fā)酵豆粕各試驗(yàn)組之間酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力差異顯著（P＜0.05）。隨著發(fā)酵豆粕含量的增加堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力都表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。除過(guò)氧化氫酶外，當(dāng)發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%～20%時(shí)，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力升高后趨于一致，二者之間差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于對(duì)照組和發(fā)酵豆粕4%試驗(yàn)組（P＜0.05）。發(fā)酵豆粕含量達(dá)到20%時(shí)，過(guò)氧化氫酶活性顯著高于其它各試驗(yàn)組。豆粕含量20%的對(duì)照組的酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力顯著低于其它各試驗(yàn)組。

3 討論

蛋白質(zhì)是水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，其在刺參營(yíng)養(yǎng)需要中處于非常重要的地位，飼料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量影響刺參的攝食、生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收等多種生理活動(dòng)。飼料添加發(fā)酵豆粕對(duì)改善飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量有重要作用，可以提供豐富的氨基酸和肽類(lèi)物質(zhì)。刺參屬于雜食性偏植物性的海洋動(dòng)物，飼料中同時(shí)添加動(dòng)物性蛋白源魚(yú)粉和植物蛋白源豆粕、發(fā)酵豆粕或其它植物餅粕等才能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)植物蛋白源優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，達(dá)到飼料氨基酸相對(duì)平衡，促進(jìn)刺參快速生長(zhǎng)的目的。很多試驗(yàn)證明魚(yú)粉含量偏低，對(duì)刺參生長(zhǎng)有抑制作用[3-5]。本試驗(yàn)中各組飼料中動(dòng)植物蛋白比為1∶3，魚(yú)粉含量為6.5%，但隨著飼料中發(fā)酵豆粕含量的升高，魚(yú)粉與發(fā)酵豆粕的相對(duì)比值也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（1.63、0.81、0.54、0.41、0.32），發(fā)酵豆粕添加量的增加也起到替代魚(yú)粉的作用。在本試驗(yàn)中刺參飼料中發(fā)酵豆粕含量對(duì)刺參的生長(zhǎng)性能有一定的影響，當(dāng)飼料發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%時(shí)，刺參的特定生長(zhǎng)率、增重率、體壁質(zhì)量達(dá)到最大值。沈城等（2015）[6]利用發(fā)酵豆粕替代15%魚(yú)粉，中華鱉的增重率和特定生長(zhǎng)率均提高顯著且達(dá)到最大值；楊耐德等（2008）[7]發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉蛋白超過(guò)33.33%，則會(huì)降低凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和飼料利用率；Lou等（2004）[8]在石斑魚(yú)上也發(fā)現(xiàn)用發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉比例超過(guò)7.4%可抑制生長(zhǎng)。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的種類(lèi)不同，其所需要的必需氨基酸模型不同，配制的飼料中動(dòng)植物蛋白源魚(yú)粉和發(fā)酵豆粕的最佳比例也有很大的差別，特別是發(fā)酵豆粕和魚(yú)粉的氨基酸組成差異較大。發(fā)酵豆粕做為優(yōu)質(zhì)植物蛋白源，雖然氨基酸組成相對(duì)平衡，但限制性氨基酸蛋氨酸和賴(lài)氨酸遠(yuǎn)低于魚(yú)粉中的含量，這可能是飼料中發(fā)酵豆粕添加量過(guò)高，魚(yú)粉蛋白相對(duì)含量降低后容易導(dǎo)致飼料利用率降低，影響刺參、魚(yú)蝦等水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的原因。

刺參的可食部分主要是刺參體壁，其營(yíng)養(yǎng)和保健功能與體壁的質(zhì)量密切相關(guān)。飼料營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)刺參體壁質(zhì)量有一定影響。本試驗(yàn)中飼料中發(fā)酵豆粕的含量對(duì)刺參體壁中粗蛋白質(zhì)有一定影響，當(dāng)飼料中發(fā)酵豆粕含量達(dá)到16%時(shí)，對(duì)刺參體壁蛋白質(zhì)的沉積作用達(dá)到最大值。對(duì)其它常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分）影響不顯著。閆磊等（2017）[9]、程成榮等（2004）[10]和Liang等（2017）[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)在洛氏鱥、雜交羅非魚(yú)和花鱸上證實(shí)了類(lèi)似結(jié)果的存在。但是Luo等（2004）[8]、馮建等（2016）[12]、Lee等（2016）[13]和沈城等（2015）[6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)中華鱉稚鱉、石斑魚(yú)、大黃魚(yú)和許氏平鮋肌肉的粗脂肪、水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量無(wú)顯著影響。呂云云等（2016）[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕對(duì)圓斑星鰈的體成分（干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分）的影響顯著(P＜0.05)。導(dǎo)致以上差異存在的原因可能是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物種類(lèi)、發(fā)酵豆粕質(zhì)量、飼料中其它原料（如魚(yú)粉、豆粕等）添加量等因素綜合作用的結(jié)果。

很多學(xué)者開(kāi)展了發(fā)酵豆粕對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物消化酶活性影響的相關(guān)研究，一般認(rèn)為適量添加發(fā)酵豆粕能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化酶活性，過(guò)量添加則有抑制作用[6，15-17]，但對(duì)少部分水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的蛋白酶的影響不顯著，而對(duì)淀粉酶的影響顯著(P＜0.05)[18]。本試驗(yàn)中發(fā)酵豆粕（4%～20%）試驗(yàn)組與對(duì)照組比較蛋白酶和淀粉酶顯著升高，脂肪酶也有升高趨勢(shì)，但只有發(fā)酵豆粕16%和20%的試驗(yàn)組脂肪酶顯著性高于對(duì)照組。這可能是由于對(duì)照組中豆粕含量高，胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子較多，抑制消化酶活性，而試驗(yàn)組中發(fā)酵豆粕經(jīng)過(guò)酶解和微生物分解，使各種抗?fàn)I養(yǎng)因子顯著性降低或完全去除，并且發(fā)酵豆粕中氨基酸和肽類(lèi)物質(zhì)可做為底物有誘導(dǎo)消化酶分泌和提高消化酶活性的作用。

刺參屬于無(wú)脊椎的海洋棘皮動(dòng)物，不具備脊椎動(dòng)物所特有的免疫組織和器官，主要通過(guò)非特異的細(xì)胞免疫和體液免疫完成對(duì)病原微生物和其它抗原物質(zhì)的免疫防御以及完成對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化物的清除工作，體液免疫反映主要由體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶等多種免疫因子共同決定[19-21]。刺參體腔液中主要免疫或抗氧化酶活性是衡量刺參機(jī)體生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中發(fā)酵豆粕試驗(yàn)組的酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，刺參體腔液中的這些酶類(lèi)在清除機(jī)體氧自由基，防止生物分子損傷方面具有重要作用，是刺參非特異性免疫水平的高低的標(biāo)志。當(dāng)發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉量增加到25%以后，酸性磷酸酶、堿性磷酸酯酶、超氧化物歧化酶活性明顯下降，因此使用發(fā)酵豆粕時(shí)必須保證魚(yú)粉的最適使用量，否則會(huì)對(duì)中華鱉的非特異性免疫產(chǎn)生明顯的影響[22]。彭松等（2015）[23]利用發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉顯著性的提高凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶（SOD）活性，類(lèi)似的試驗(yàn)結(jié)果在許氏平鮋上也被發(fā)現(xiàn)。Song等（2014）[24]證實(shí)過(guò)多添加大豆蛋白水解物降低魚(yú)粉在飼料中的含量則會(huì)使星斑川鰈的超氧化物歧化酶活性與總抗氧化能力降低。由以上現(xiàn)象可以得出在刺參、魚(yú)蝦等飼料中動(dòng)物蛋白源魚(yú)粉適量時(shí)，添加一定量的發(fā)酵豆粕可提高機(jī)體的免疫力和抗氧化能力，但具體機(jī)理和途徑，因水產(chǎn)動(dòng)物的種類(lèi)不同差異較大，有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在動(dòng)植物蛋白比為1∶3的刺參飼料中，發(fā)酵豆粕添加量達(dá)到16%時(shí)，刺參生長(zhǎng)、體壁蛋白質(zhì)含量達(dá)到最佳，消化酶活性、免疫酶活性都得到提高，具有一定的理論研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。