沙蔥總黃酮體外抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的研究

■薩茹麗 楊 斌 玉 梅 王翠芳 敖長金*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010031）

沙蔥為百合科蔥屬植物，又稱為蒙古韭菜(allium mongolicum regel)、胡穆利(蒙語)[1]等，沙蔥屬于多年生長的鱗莖草本植物，其根莖，鱗莖柱形且粗短，簇生?；~的形狀為細線形?；ㄇo的形狀為圓柱形直立?；ㄊ怯啥鄠€小花聚集在一起，呈現(xiàn)為傘形，花的顏色一般呈鮮淡紫色或者紫紅色。沙蔥的開花期為每年的6～8月。因其外貌特征極像幼蔥，因此被稱之為沙蔥。沙蔥的適應(yīng)力、抗旱以及抗寒能力特別強。廣泛生長在海拔較高的砂壤戈壁、干旱沙漠及戈壁荒漠等干旱的地區(qū)。在我國主要分布于內(nèi)蒙古西北部、遼寧(西部)、陜西(北部)、甘肅、青海(北部)、新疆(東北部)和寧夏（北部）等地區(qū)，國外則分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、東西伯利亞以及蒙古西南部等干旱荒漠地區(qū)。沙蔥的葉子、嫩莖和花苞都是可以食用的野生蔬菜，具有辛辣味，然而沙蔥的辛辣味道要比其他蔥韭更鮮更濃，具極高營養(yǎng)價值和藥用價值，享有“沙原佳蔬”、“大漠野菜”、“菜中靈芝”[2]等美譽。張宇宏[3]研究指出沙蔥可提高肉羊血清中堿性磷酸酶（ALP）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）以及T3和T4的水平。哈斯其木格[4]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加沙蔥提取物能夠顯著提高肉仔雞的生產(chǎn)性能、血清總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活力，并且能夠顯著提高肉仔雞免疫能力。趙春艷[5]證明沙蔥中黃酮類化合物能提高試驗小鼠機體總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量，降低機體丙二醛（MDA）的含量?？妬喚闧6]報道沙蔥異黃酮能夠?qū)υ囼炐∈笱迮c肝臟中GSH-Px活性、T-SOD活性、CAT活性、T-AOC能力產(chǎn)生一定的促進作用，降低MDA含量，提高機體抗氧化能力與免疫力。薩茹麗等[7]研究指出沙蔥中各個部位中的提取物都有一定的體外抗氧化與抗菌的作用，其中沙蔥葉中提取物的總黃酮含量是最高的，并且其體外抗氧化及抗菌活性也是相對其他部位而言較好的，對DPPH自由基的清除率可達到52.2%、對羥基自由基的清除率可達到84.4%、對沙門氏菌的抑制率可達到86.6%。進一步研究認(rèn)為沙蔥總黃酮中35%乙醇洗脫組分的抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性最強，其所含的7-O-5,4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮及3′,4′-環(huán)氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇的活性結(jié)構(gòu)是其抗氧化活性的關(guān)鍵基團[8]。沙蔥作為天然優(yōu)質(zhì)牧草有較高的營養(yǎng)價值以及藥用價值。本試驗通過研究沙蔥總黃酮體外抗氧化、抗菌、抗病毒能力，旨在為后續(xù)沙蔥及沙蔥相關(guān)天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)提供一些幫助和思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

本試驗中所用沙蔥均采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克旗天然牧場。沙蔥總黃酮參照薩茹麗[8]報道的方法由本實驗室自制，-20℃保存?zhèn)溆?，使用前用蒸餾水配制成10 mg/ml的原液。

綿羊偽狂犬病病毒與BHK-21細胞株（用于感染病毒）由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供。

大腸桿菌（ATCC-25922）、綠膿桿菌（ATCC-27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC-25923）、沙門氏菌(ATCC-50096)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)免疫研究室提供。

人肺癌A549細胞株為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室傳代保存株）。

DMEM/low Glucose培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、Hank's液、青鏈霉素母液(PS)均購自GIBCO公司；DMSO購自Sigma公司

MTT(Sigma公司)的制備：5 mg MTT粉溶于1 mol/l的PBS溶液制得5 mg/ml的應(yīng)用液，過濾除菌后在4℃避光保存（一周內(nèi)用完），最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。

環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：20080902）溶液的配制：稱取0.2 g環(huán)磷酰胺后用4 ml生理鹽水溶解，得50 mg/ml環(huán)磷酰胺溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗儀器

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HEPA class 100CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；Synergy H4型全自動多功能酶標(biāo)儀（BIOTEK公司）；AC2-4S1生物安全柜（ESCO公司）；IX71倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；YS100普通光學(xué)顯微鏡（Nikon公司）；離心機（BD公司）；恒溫水浴鍋（上海亞榮儀器廠）；冷凍干燥機（Millipore公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙蔥總黃酮體外抗病毒活性的研究

1.3.1.1 細胞的復(fù)蘇與傳代

將凍存的BHK-21細胞在水浴鍋快速融化后加入到離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，用培養(yǎng)液沖洗后把細胞液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，搖勻后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長之后用一次性滴管吸出培養(yǎng)液，加入適量PBS溶液沖洗，用胰酶消化后加入新的培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞制成細胞懸液。分裝后放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.1.2 含藥血清的制備

取40只試驗小鼠，隨機分配為5個試驗組，雌雄各一半，每個試驗組中有8只小鼠。連續(xù)6 d給小鼠灌胃給藥。其中，生理鹽水試驗組為對照組給予生理鹽水，利巴韋林組給予75 μg/g利巴韋林，沙蔥總黃酮組給予沙蔥總黃酮110、220、330 μg/g（給藥液劑量按體重計算）。當(dāng)最后一次給藥之后1 h，將所有的試驗小鼠深度麻醉，在無菌條件下進行心臟采血，將采來的血放入離心管后以3 000 r/min離心10 min，將同組血清歸并在一起，把水浴鍋的溫度調(diào)到56℃將血清水浴30 min，用0.22 μm的濾膜過濾除菌之后，對血清進行分裝，在超低溫的冰箱保存，備用。

1.3.1.3 病毒的半數(shù)感染量(TCID50)的測定

細胞在96孔板中長成薄單層后，將原培養(yǎng)液吸取丟棄，用Hank's液沖洗2次。將病毒解凍之后，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度，之后將100 μl/孔的病毒分別接種于細胞上，每個濃度設(shè)置三個重復(fù)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后棄去上清液，再用Hank's液洗2次，加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液 150 μl/孔。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后在倒置顯微鏡下觀察病變(CPE)的情況。

1.3.1.4 沙蔥總黃酮體外抗病毒作用

細胞在96孔板中長成薄單層后，將原有培養(yǎng)液吸取丟棄，后用Hank's液沖洗2次。含藥血清和空白血清分別與10-2.5/0.1 ml量病毒同等體積混合，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育1 h后，分別接種于細胞上，150 μl/孔，每試驗組設(shè)3復(fù)孔，然后在相同條件下繼續(xù)孵育。倒置顯微鏡下待病毒對照孔的CPE達到三至四個加號時使用，MTT法檢測病毒抑制率。

病毒抑制率(%)=[(藥物OD570nm-病毒OD570nm)/(正常OD570nm均值-病毒OD570nm均值)]×100

1.3.2 沙蔥總黃酮體外抗菌活性的研究

1.3.2.1 細菌的復(fù)蘇培養(yǎng)與定植

在超凈工作臺內(nèi)將保存完好的菌株用接種環(huán)劃線接種于制作好的培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，選擇菌落生長較好的培養(yǎng)皿，接種于制備好的培養(yǎng)皿中。37℃培養(yǎng)18 h后，再挑選菌落生長較為典型的培養(yǎng)基，加入5 ml的滅菌后的生理鹽水，輕輕刮起菌苔，制成細菌混懸液。吸取100 μl于比濁管中，通過比濁法配制成后續(xù)試驗所需的1×106個/ml菌液。

1.3.2.2 抑菌試驗

在超凈工作臺中用滅菌棉簽蘸取制備好的細菌培養(yǎng)液均勻涂布于預(yù)備好的培養(yǎng)基上，將滅菌的牛津杯用鑷子垂直放置于涂滿菌液的培養(yǎng)基表面，使其與培養(yǎng)基接觸緊密。每個培養(yǎng)基放置三個牛津杯，分別加入200 μl沙蔥總黃酮溶液、200 μl無菌蒸餾水、200 μl雙抗（青霉素100 IU+鏈霉素100 IU混合液）。無菌蒸餾水為空白對照，雙抗為陽性對照。將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。試驗結(jié)果通過抑菌圈直徑的大小來反映抑菌效果。判定標(biāo)準(zhǔn)：D≤8 mm為不敏感，8 mm＜D≤13 mm為低度敏感，13 mm＜D≤19 mm為中度敏感，D＞19 mm為高度敏感。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑D，試驗重復(fù)三次取平均值。

1.3.2.3 最小抑菌濃度的測定

本次試驗采用試管法進行MIC的測定。準(zhǔn)備若干小試管，蒸餾水洗凈，確保試管洗凈，每管中用移液槍加入1 ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，放入高壓鍋中121℃，滅菌時間為25 min。配制具有濃度梯度的沙蔥總黃酮溶液，分別為5、2.5、1.25、0.625 mg/ml。然后各加入100 μl菌液，最后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。觀察無細菌生長試管所含最低沙蔥總黃酮濃度即為最小抑菌濃度，試驗重復(fù)3次，求取平均值。

1.3.2.4 抑菌率的測定

沙蔥總黃酮的體外抑菌率試驗方法參照許穎等[9]報道的方法略加改進。試驗組：用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基以倍比稀釋法將沙蔥總黃酮配成濃度為：100、50、25、12.5 μg/ml。陰性對照組:生理鹽水。在96孔細胞培養(yǎng)板上分別建立大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌模型,每孔加入1×106個/ml的菌液50 μl、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基50 μl，按以上試驗分組加入藥液100 μl，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。上述96孔板培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出在每孔中加入20 μl配好的MTT溶液（避光），震蕩混勻繼續(xù)在37℃避光培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后加入150 μl DMSO，震蕩混勻后于酶標(biāo)儀上檢測其490 nm處的吸光值。

1.3.3 沙蔥總黃酮體外抗腫瘤活性的研究

1.3.3.1 體外細胞培養(yǎng)

A549細胞株為貼壁生長細胞，以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中，使用加有10%胎牛血清的DMEM高糖細胞完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視培養(yǎng)情況2～3 d換液一次，待有80%的細胞貼壁后，按1傳4的比例進行傳代。試驗時選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.3.3.2 MTT法測定沙蔥總黃酮對A549腫瘤細胞增殖抑制率

將細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)5個重復(fù)。沙蔥總黃酮組分別加入1.0 mg/ml沙蔥總黃酮溶液100、50、20 μl，環(huán)磷酰胺組分別加入50 mg/ml環(huán)磷酰胺溶液100、40、20 μl，后用DMEM高糖培養(yǎng)液補齊體積，使每孔最終體積均為200 μl。后37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入20 μl的MTT應(yīng)用液，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)反應(yīng)4 h，后使用平板離心機1 500 r/min、10 min，棄上清留沉淀，加入150 μl DMSO，振蕩15 min，待結(jié)晶完全溶解后490 nm處測定吸光度值，計算細胞生長抑制率（inhibitive rate，IR），IR(%)=(D對照-D試驗)/D對照×100，以上試驗重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗的數(shù)據(jù)使用EXCEL及SAS 9.0軟件進行處理。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥總黃酮體外抗病毒活性的研究

2.1.1 病毒的半數(shù)感染量(TCID50)的測定結(jié)果(見表1)

表1 病毒的半數(shù)感染量(TCID50)的測定結(jié)果

根據(jù)表1中細胞的病變情況，采用Reed-Muench法計算，可知TCID50為10-2.9/0.1 ml，在接種病毒之后，細胞會呈現(xiàn)出不同程度的病變狀態(tài)，并且會跟著稀釋濃度的增長而增長，當(dāng)稀釋比列僅為10-1時，所有試驗孔中細胞均出現(xiàn)了病變狀態(tài)。

2.1.2 沙蔥總黃酮體外抗病毒活性測定結(jié)果（見表2）由表2可知在本次試驗中，病毒對細胞具有較強的病變作用，對照組與病毒組的抑制率均為0%。利巴韋林組抗病毒的能力最好，能夠抑制63.43%的病毒。沙蔥總黃酮組也具有一定的抑制病毒的作用，并且此作用會隨著含藥血清添加濃度的增加而增加，但是無顯著的臨床意義。

表2 沙蔥總黃酮體外抗病毒作用

2.2 沙蔥總黃酮體外抗菌活性的研究

2.2.1 沙蔥總黃酮抑菌圈直徑的測定結(jié)果（見表3）

表3 沙蔥總黃酮抑菌環(huán)直徑的測定

抑菌圈直徑越大表明藥物的抑菌能力越強，因此試驗研究中常常使用抑菌圈直徑大小來表示藥物的抑菌活性強弱。由表3可知，在試驗劑量條件下（沙蔥總黃酮濃度為10 mg/ml）時，沙蔥總黃酮對沙門氏菌抑菌圈直徑為9.5 mm，屬于低度敏感，但顯著高于對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌圈。沙蔥黃酮對大腸桿菌的抑菌圈直徑可達到7.3 mm，而對金黃色葡萄球菌的抑制能力屬于不敏感，對綠膿桿菌無明顯的抑制作用。

2.2.2 沙蔥總黃酮最小抑菌濃度的測定（見表4）

表4 沙蔥總黃酮最小抑菌濃度的測定

沙蔥總黃酮對大腸桿菌的最小抑菌濃度為5.0 mg/ml，對綠膿桿菌無明顯的抑制作用，這一結(jié)果與抑菌圈試驗結(jié)果相對應(yīng)，說明沙蔥總黃酮對大腸桿菌有一定的的抑制作用，在所用劑量范圍內(nèi)對綠膿桿菌無抑制作用。沙蔥總黃酮對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.0 mg/ml，對沙門氏菌的最小抑菌濃度為2.5 mg/ml，這一結(jié)果與抑菌圈試驗結(jié)果相對應(yīng)。

圖1 沙蔥總黃酮抑菌率的測定

2.2.3 沙蔥總黃酮抑菌率的測定（見圖1）MTT檢測抑菌率的試驗結(jié)果顯示，當(dāng)細菌濃度定值為1×106個/ml時，隨著沙蔥總黃酮濃度的升高，其對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制作用均呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)沙蔥黃酮添加劑量相同時，對沙門氏菌的抑制作用更強一點，且顯著高于其他幾組（P＜0.05）。隨著沙蔥總黃酮的濃度升高，其對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制率具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。相同濃度條件下對大腸桿菌的抑制作用強于綠膿桿菌，且差異顯著（P＜0.05）。

2.3 沙蔥總黃酮體外抗腫瘤活性的研究（見圖2）

圖2 沙蔥總黃酮對A549腫瘤細胞抑制率的測定

由圖2可知，當(dāng)沙蔥總黃酮作用于A549腫瘤細胞48 h時其抑制活性最強，隨著添加時間的延長其對腫瘤細胞的抑制作用明顯降低。在24 h時隨著添加劑量的增加抑制率呈上升趨勢，但到達48 h后沙蔥總黃酮對A549腫瘤細胞的抑制作用并沒有顯示出明顯的計量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 沙蔥總黃酮體外抗病毒作用的研究

目前，國內(nèi)外對于植物提取物體外抗病毒作用的研究報道較為廣泛。如姚干等[10]通過研究黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜在體外對H1N1感染的A549細胞抑制率，發(fā)現(xiàn)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物具有明顯的抗病毒效應(yīng)，其作用機制可能是抑制病毒在細胞內(nèi)的增殖和對病毒的直接殺滅作用，而單獨使用黃芩總黃酮或梔子總環(huán)烯醚萜苷，其抗病毒作用低于組合效應(yīng)。高川等[11]研究顯示白穎苔草丙酮-乙酸乙酯粗提物對RSV和Flu A的細胞病變效應(yīng)具有顯著的抑制作用。由本次的試驗結(jié)果分析可以看出沙蔥總黃酮具有一定的體外抗病毒的作用。這可能與本次選用的病毒株對沙蔥總黃酮不敏感有關(guān)，或者是沙蔥總黃酮中抗病毒活性成分較少，繼續(xù)進行分離提純，加大抗病毒成分的濃度或許可以獲得更為滿意的效果。

3.2 沙蔥總黃酮體外抗菌作用的研究

諸多研究證明酚類衍生物具有使生物細胞壁及細胞膜破碎或是細胞膜通透性改變的作用，從而能讓細胞內(nèi)容物擴散、導(dǎo)致細胞內(nèi)外物質(zhì)與信息的傳遞失調(diào)，使微生物生長停止、導(dǎo)致微生物死亡[12]。由黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)來看，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中擁有與酚類衍生物相似的結(jié)構(gòu)，因此有研究者們認(rèn)為黃酮類物質(zhì)也具有一定的抗菌作用，且證明了有些植物提取黃酮類物質(zhì)對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及霉菌、真菌等具有一定的抑制作用，具有廣譜抗菌活性[13]。本次試驗研究發(fā)現(xiàn)沙蔥總黃酮對試驗所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有一定的抑制作用，其中對沙門氏傷寒菌的抑制作用最強，對綠膿桿菌無抑制作用。正如物質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定其生物活性一樣，有研究認(rèn)為黃酮類化合物的抗菌活性主要與其官能團組成和黃酮類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中有無電荷密度較高的部位有關(guān)，與其整個分子結(jié)構(gòu)中電荷分布有關(guān)[14]。

3.3 沙蔥總黃酮體外抗腫瘤活性的研究

細胞凋亡是腫瘤研究的一個重要方向，近年來研究表明許多抗腫瘤藥物均可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生[15]。如張羽男等[16]指出紫花苜?？傸S酮可誘導(dǎo)人肝癌細胞SMMC7721凋亡，呈現(xiàn)出較為顯著的體外抗腫瘤活性。董蒙蒙等[17]通過比較五種中華補血草黃酮類化合物的抗腫瘤作用發(fā)現(xiàn)，在該試驗條件下木樨草素的抗腫瘤活性最強，其次為槲皮素，異鼠李素、芹菜素第三，異槲皮苷抗腫瘤活性最低，且認(rèn)為黃酮類化合物抗腫瘤活性與其抗氧化活性有關(guān)。腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-OD實驗/OD對照)×100。以同一樣品的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC50＜10 μg/ml或植物粗提物的IC50＜20 μg/ml時，則判斷樣品在體外對腫瘤細胞有殺傷作用。由本次試驗可知沙蔥總黃酮對A549腫瘤細胞無顯著抑制作用。這可能與本實驗室制備沙蔥總黃酮的提取工藝有關(guān)，或是沙蔥總黃酮中具有抑制A549腫瘤細胞的有效成分含量過少，進一步提純制備有望獲得抗腫瘤效果較好的成分。

4 結(jié)論

由本試驗結(jié)果可知，沙蔥總黃酮具有一定的抗病毒、抗菌和抗腫瘤活性。其中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有一定的抑菌作用，對沙門氏菌的抑制作用最強，對綠膿桿菌無抑制作用。本試驗結(jié)果顯示沙蔥總黃酮對A549腫瘤細胞和綿羊偽狂犬病毒有一定的抑制作用。