基于羧酸酯酶降解伏馬毒素研究

■陳亭亭 張巧艷* 王 坡， 林 琳 楊 華 楊蘭花 楊勝利 袁玉偉

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；3.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海200233；4.義烏出入境檢驗檢疫局，浙江義烏322000)

伏馬毒素（Fumonisins，F(xiàn)Bs）是由層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticillioides）等絲狀真菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[1]，分子結(jié)構(gòu)見圖1。與絕大多數(shù)真菌毒素不同的是，它缺乏環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但仍具有很強(qiáng)的毒性[2]。其中，伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）污染率最高，占伏馬毒素總量的70%～80%，且危害最大，具有致畸性、致癌性，可誘發(fā)人類食管癌、豬肺水腫、馬腦白質(zhì)軟化等癥[1-3]。豬長期攝入低劑量伏馬毒素污染的飼料還將導(dǎo)致日增重下降和免疫抑制[4]。近年來，調(diào)查顯示，玉米、大豆、小麥、DDGS飼料和全價飼料中伏馬毒素是主要的污染物[5]。2014年，我國華東地區(qū)抽檢的仔豬配合飼料中伏馬毒素檢出率為83.3%，雛禽、蛋禽配合飼料污染率達(dá)100%[6]。為了減少污染危害，美國FDA規(guī)定動物飼料中伏馬毒素的限量范圍為5～100 mg/kg[7]。我國即將實施的《GB 13078—2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》特別新增了伏馬毒素的限量要求，其中豬飼料中的限量為5 mg/kg，牛飼料中的限量為50 mg/kg[8]。

飼料中伏馬毒素的污染不僅影響畜禽健康養(yǎng)殖，而且將通過食物鏈長期威脅人類健康。高效安全的脫毒方法受到養(yǎng)殖企業(yè)、飼料企業(yè)以及獸醫(yī)專家的廣泛關(guān)注。大多數(shù)物理和化學(xué)脫毒法容易破壞飼料的營養(yǎng)成分，改變適口性，從而影響動物產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量；一些處理試劑的殘留蓄積還會帶來二次污染而造成不可估量的安全隱患。生物法脫毒包含微生物法和酶法。酶法因具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡單、相對安全等特點而廣受青睞，而且酶制劑相對于微生物制劑更容易保存，可直接以飼料添加劑形式用于畜禽生產(chǎn)中。本研究從緩沖體系、反應(yīng)溫度、酶濃度、底物濃度等方面首次探索了一種羧酸酯酶對FB1的降解規(guī)律(見圖1)，旨在為伏馬毒素酶法脫毒的實際應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

圖1 伏馬毒素B1酶解示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗材料

FB1標(biāo)準(zhǔn)品購自青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。羧酸酯酶：從養(yǎng)殖場附近的土壤中篩選獲得一株革蘭氏陰性細(xì)菌，具有伏馬毒素降解活力，經(jīng)搖瓶發(fā)酵、初步純化制得粗酶。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器條件

采用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測。色譜柱：Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.05 mol/l檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.0），B相為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，55%B；2～4 min，55%B～75%B；4～9 min，75%B～90%B；9～9.5 min，90%B；9.5～13 min，90%B～55%B；13～15 min，55%B；流速：1.0 ml/min；激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長440 nm；進(jìn)樣量：50 μl；柱溫：35 ℃。

1.2.2 樣品處理

取一定體積的待測液，適當(dāng)稀釋，與反應(yīng)液Ⅰ和反應(yīng)液Ⅱ等體積混合衍生，過膜后檢測。反應(yīng)液Ⅰ：14 μl β-巰基乙醇溶于 4 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1）；反應(yīng)液Ⅱ：稱取10 mg鄰苯二甲醛，溶于1 ml甲醇中，再加入3 ml 0.1 mol/l硼酸鈉緩沖液（pH值9.1），混勻。其中反應(yīng)液Ⅱ在室溫下可穩(wěn)定1周[9]。

1.2.3 HFB1制備

取0.5 ml 200 μg/ml FB1甲醇溶液，與10 ml 1 mol/l KOH溶液混合，70℃孵育1 h，冷卻后用2 mol/l HCl溶液將pH值調(diào)至4.5。將反應(yīng)液用HLB柱凈化，獲得濃度為11.2 μg/ml的HFB1甲醇溶液，用作液相分析HFB1含量的參考標(biāo)樣[10-11]。

1.3 試驗方法

1.3.1 相關(guān)定義

酶活定義：在30℃、pH值8.0條件下，每分鐘從10 μg/ml FB1中降解1 μg FB1所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。FB1降解率定義：FB1的降解量與原始添加量之比，用百分比表示。HFB1生成率定義：HFB1的生成量與FB1完全轉(zhuǎn)化成HFB1的理論值之比，用百分比表示。結(jié)果均為3次測定的平均值。

1.3.2 緩沖體系

配制磷酸鉀緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）、Teorell-Stenhagen緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）[12]、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0），以及系列不同pH值的20 mmol/l Teorell-Stenhagen緩沖液（pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），分別在2 ml緩沖體系中加入FB1（10 μg/ml）、BSA（0.1 mg/ml）和酶（20 U/l），30 ℃孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.3 反應(yīng)溫度

制備2 ml反應(yīng)體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，酶20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]，分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃中孵育3 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.4 酶濃度

在 2 ml反應(yīng)體系[FB110 μg/ml，BSA 0.1 mg/ml，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加粗酶至終濃度分別為：1、10、20、40、100 U/l，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

1.3.5 底物濃度

在2 ml反應(yīng)體系[BSA 0.1 mg/ml，酶 20 U/l，Tris-HCl緩沖液（20 mmol/l，pH值8.0）]中，添加底物FB1至終濃度分別為：1、5、10、20、50、100 μg/ml，30 ℃孵育0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h，沸水浴滅活10 min，取樣檢測，比較降解效果。

2 結(jié)果

2.1 緩沖體系的影響

緩沖鹽和pH值會影響酶、底物的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化。FB1的酶解在不同的緩沖體系中進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tris-HCl緩沖液有利于FB1的酶解，3 h的降解率達(dá)到47.08%，磷酸鉀緩沖液僅次之，Teorell-Stenhagen緩沖液效果最差（降解僅32.32%）。但由于Teorell-Stenhagen緩沖液具有相對較寬的緩沖范圍（pH值2.0～12.0）[12]，被進(jìn)一步用于考察酶解反應(yīng)的最適pH值。由圖2可知，該酶最適反應(yīng)pH值8.0，此時FB1降解率和HFB1生成率基本達(dá)到最高值。整體上看，F(xiàn)B1隨pH值變化的降解規(guī)律與HFB1生成規(guī)律基本一致，但降解率曲線與生成率曲線不完全重合，推測FB1酶解過程存在中間產(chǎn)物。Heinl等[1]也曾發(fā)現(xiàn)FB1的酶解產(chǎn)物除了HFB1外，還存在兩種結(jié)構(gòu)不同的部分水解型伏馬毒素B1（pHFB1）。而且，中間產(chǎn)物在降解產(chǎn)物中的比例可能與緩沖體系的pH值緊密相關(guān)，堿性條件相比酸性條件顯然更有利于FB1的完全轉(zhuǎn)化，可以解釋為：FB1通過羧酸酯酶水解生成HFB1、pHFB1和TCA，TCA能與堿發(fā)生中和反應(yīng)，促進(jìn)整個反應(yīng)向生成HFB1的方向進(jìn)行。另外，當(dāng)緩沖液的pH值小于3.0或大于11.0時，該酶幾乎無法降解FB1，可能過酸或過堿的條件不適宜酶與FB1的結(jié)合、催化，或者此時酶已變性失活。

圖2 反應(yīng)pH值對伏馬毒素B1酶解的影響

2.2 反應(yīng)溫度的影響

酶促反應(yīng)具有溫度依賴性，因為反應(yīng)溫度會影響分子運(yùn)動、酶的活力和底物親和力。一方面，升高溫度可以增加酶促反應(yīng)速度；另一方面，溫度過高會導(dǎo)致酶蛋白變性失活。FB1的酶解在不同的溫度下進(jìn)行，由圖3可知，最適反應(yīng)溫度為30℃。涉及的羧酸酯酶具有較寬的溫度適應(yīng)性，在20～70℃范圍內(nèi)均有降解活力，高于80℃時，F(xiàn)B1降解率幾乎為零，可能高溫不利于FB1的水解反應(yīng)或者此時酶已失活。另外，隨反應(yīng)溫度的變化，F(xiàn)B1降解和HFB1生成具有相似的趨勢，但降解率與生成率不一致，進(jìn)一步證實中間產(chǎn)物的存在，并推測中間產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)溫度緊密相關(guān)。

2.3 酶濃度的影響

通常，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。固定底物濃度為10 μg/ml，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進(jìn)行FB1的酶解反應(yīng)，考察不同酶濃度下的降解規(guī)律。由圖4可知，在酶解起始階段，隨著酶濃度的增加，同一時間的降解率增加。計算反應(yīng)3 h的平均速率，當(dāng)酶濃度低于40 U/l時，降解速率與酶濃度成正比；當(dāng)酶濃度為100 U/l時，降解速率增幅較小，可能此時底物分子趨向于被酶分子所飽和。較低的酶濃度（1 U/l）下反應(yīng)1 d，仍有36.91%的FB1殘留。較高的酶濃度（100 U/l）下反應(yīng)2 h，F(xiàn)B1的降解率已達(dá)到91.70%；反應(yīng)3 h以后，F(xiàn)B1的降解率和HFB1的生成率趨于100%，顯然此時FB1被完全轉(zhuǎn)化成HFB1，而HFB1沒有進(jìn)一步降解為其他產(chǎn)物，說明該酶專一性作用于酯鍵。當(dāng)酶濃度為20 U/l時，反應(yīng)8 h就能獲得較好的降解效果，此時FB1殘留僅剩10%左右。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在該酶濃度下，反應(yīng)前期（20 h前），降解率始終大于生成率，說明中間產(chǎn)物的存在；反應(yīng)后期（20 h后），降解率幾乎等于生成率，推測FB1酶解生成HFB1的反應(yīng)是不可逆的，隨作用時間的延長，中間產(chǎn)物pHFB1也能被完全水解成HFB1。

圖3 反應(yīng)溫度對伏馬毒素B1酶解的影響

圖4 酶濃度對伏馬毒素B1酶解的影響

2.4 底物濃度的影響

一般隨底物濃度升高，酶促反應(yīng)速度先升高后不變。固定酶濃度為20 U/l，在最適條件（pH值8.0、30℃）下進(jìn)行FB1的酶解反應(yīng)，考察不同底物濃度下的降解規(guī)律。由圖5可知，在酶解過程中，隨著FB1濃度的增加，同一時間的降解率降低，可能過多的底物分子阻礙了酶分子的結(jié)合、催化。以圖5數(shù)據(jù)計算反應(yīng)3 h的平均速率，繪制底物濃度(S)與降解速度(V)的關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)FB1濃度低于50 μg/ml時，降解速率隨底物濃度的增加而增加，呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)；高于50 μg/ml時，降解速率基本保持不變，表現(xiàn)為零級反應(yīng)，說明此時酶已被底物完全飽和。由米氏方程推出：，繪制1/V-1/S關(guān)系曲線，可得：最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數(shù)Km為33.2 μmol/l。HFB1的生成規(guī)律與FB1的降解規(guī)律隨底物濃度變化的相關(guān)性趨勢基本一致，但同一時間的生成率幾乎都小于降解率，直至反應(yīng)1 d時FB1才完全轉(zhuǎn)化成HFB1，反映了FB1的酶解程度與作用時間緊密相關(guān)。反應(yīng)8 h，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應(yīng)20 h，各種濃度的FB1均能被降解。

2.5 實際應(yīng)用

圖5 底物濃度對伏馬毒素B1酶解的影響

從超市、農(nóng)貿(mào)市場、養(yǎng)殖場、飼料企業(yè)獲得25份玉米粉，用李為喜等[13]的方法進(jìn)行樣品前處理，用柱前衍生高效液相色譜-熒光法檢測，篩選獲得1份FB1含量為18.26 mg/kg的試樣，其液相色譜圖見圖6(B)。取5 g玉米粉試樣，以料液比1∶1.5加入20 mmol/l Tris-HCl緩沖液（pH值8.0）（包含20 U/l酶和0.1 mg/ml BSA），充分混合，在最適條件（pH值8.0、30℃）下靜止反應(yīng)1 d，F(xiàn)B1仍有35.67%殘留；靜止反應(yīng)2 d，F(xiàn)B1完全轉(zhuǎn)化成HFB1[圖6(C)]。假設(shè)玉米粉試樣中所有FB1均浸出于緩沖液中，估算底物濃度為12.17 μg/ml。由圖5可知，當(dāng) FB1濃度為 10 μg/ml時，反應(yīng) 8 h，降解率為94.57%；反應(yīng)20 h，降解率達(dá)到100%。推測玉米粉酶解過程中，固體基質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾了酶分子與底物分子的作用，從而影響了酶解效率。以后將優(yōu)化料液比，增加攪拌等措施，使酶分子與底物分子充分接觸，縮短完全降解時間。

圖6 玉米粉伏馬毒素B1酶解前后液相色譜圖

3 討論

DDGS（Distillers'dried grains with solubles）是釀酒酵母發(fā)酵玉米等谷物生產(chǎn)酒精的主要副產(chǎn)物，蛋白含量高（約30%～35%），營養(yǎng)價值好（富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和多糖），且產(chǎn)量較大、成本較低，近幾年已逐漸成為一種高需求的動物飼料[14]。然而，玉米原料容易被伏馬毒素污染，加上酵母細(xì)胞壁和原料中的礦物質(zhì)會富集真菌毒素（發(fā)酵后FB1含量增加1.37～1.94倍），導(dǎo)致DDGS的安全性受到影響[15-16]。在發(fā)酵中添加降解毒素的酶制劑，可實現(xiàn)生產(chǎn)過程脫毒。按玉米發(fā)酵生產(chǎn)酒精的工藝，一般控制發(fā)酵溫度在30℃左右；而大多數(shù)酵母在微酸性環(huán)境中生長最好，發(fā)酵pH值一般控制在5.0左右[17]。本研究涉及的羧酸酯酶在pH值5.0條件下可以降解伏馬毒素，最適酶解溫度為30℃，能夠適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。應(yīng)用羧酸酯酶，聯(lián)合其他酶制劑，開發(fā)脫毒DDGS產(chǎn)品，有利于提升國產(chǎn)DDGS品質(zhì)，應(yīng)對進(jìn)口貿(mào)易壁壘。

BSA（Bovine serum albumin）是一種常用的載體蛋白，由581個氨基酸殘基組成，可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，防止酶的分解和非特異性吸附[18]。Fornasier等[19]報道，BSA可以增加酯酶的提取得率。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/ml FB1在20 U/l酶作用下水解3 h，不添加BSA的降解率僅有添加時的1/3，可見BSA能夠顯著提高羧酸酯酶的催化活力。Palacharla等[20]曾發(fā)現(xiàn)BSA具備捕獲脂肪酸的能力。由此推測，其作用機(jī)理是：BSA與FB1水解產(chǎn)物TCA結(jié)合，從而促進(jìn)FB1的酶解。此外，聚乙二醇（PEG）、吐溫（Tween）等一些非離子型表面活性劑，在促進(jìn)酶解方面展現(xiàn)了與BSA相當(dāng)?shù)男Ч鸞21-22]。以后將深入研究這些添加劑的作用機(jī)理，并結(jié)合不同酶濃度、底物濃度下的降解規(guī)律，開發(fā)復(fù)合型酶制劑和飼料脫毒技術(shù)，應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

本研究涉及的羧酸酯酶具有較強(qiáng)的pH值和溫度適應(yīng)性，最適反應(yīng)pH值為8.0，最適反應(yīng)溫度為30℃。酶解過程具有時間依賴性，且FB1的降解和HFB1的生成存在不同的規(guī)律。較低的酶濃度（1 U/l）下反應(yīng)1 d，有36.91%的FB1殘留；較高的酶濃度（100 U/l）下反應(yīng)3 h，F(xiàn)B1能被完全降解。當(dāng)酶濃度為20 U/l時，在最適條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)8 h時，濃度低于20 μg/ml的FB1降解率在90%以上；反應(yīng)20 h時，低、中、高濃度的FB1均被降解。最大降解速率Vmax為0.148 μmol/(l·min)，米氏常數(shù)Km為33.2 μmol/l。該酶作用于玉米粉，反應(yīng)2 d，能將FB1完全轉(zhuǎn)化成HFB1，應(yīng)用前景廣闊。