不同菌種發(fā)酵對巴戟天活性成分含量的影響

譚麗容，代文豪，羅志鋒，李文治，黎 攀，林微微，程 敏*，杜 冰

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

巴戟天（Morinda officinalisHow.）來源于茜草科巴戟屬植物巴戟天的干燥根，主要成分包括多糖及寡糖、蒽醌、水晶蘭苷、有機酸等化合物及無機元素，是我國著名的四大南藥之一[1]，具有補腎壯陽、提高細胞免疫功能等功效[2-3]。炮制作為巴戟天入藥前必須經(jīng)過的工序，主要有鹽制巴戟天、發(fā)酵法炮制、蒸制巴戟天、甘草水制巴戟天（制巴戟天）、煮制巴戟天，目前巴戟天的炮制研究主要集中在鹽制及甘草水制方面。對于各類炮制品的質(zhì)量和工藝，目前行業(yè)尚未定制統(tǒng)一標準，這阻礙了炮制品的研發(fā)和生產(chǎn)等[4-5]。

發(fā)酵法炮制中草藥是中藥炮制方法之一，是中草藥通過微生物發(fā)酵，借助于酶和微生物的作用改變中草藥原有的性質(zhì)藥效等，進而增強原有功效或產(chǎn)生新的功效，擴大中草藥原有的用藥品種，以適應臨床用藥的需要[6]。目前，國內(nèi)外有關巴戟天發(fā)酵法炮制鮮有文獻報道，只有一篇論文報道了巴戟天發(fā)酵炮制的研究，其利用酵母菌發(fā)酵巴戟天提高了巴戟天多糖的含量[7]。因此，本研究在篩選適合巴戟天發(fā)酵炮制菌種的基礎上，研究發(fā)酵炮制過程中活性成分的變化，旨在為發(fā)酵法炮制巴戟天的研究開拓新的領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

工廠巴戟天（抽芯干燥巴戟天（MorindaofficinalisHow.）：廣東省云浮市郁南縣大方鎮(zhèn)巴戟天市場。

1.1.2 菌種

芽孢桿菌屬（Bacillussp.）DU-106、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）：華南農(nóng)業(yè)大學新資源食品與功能性原料研究及評價中心保藏，并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g菌粉，作為實驗室備用；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）RV171：安琪酵母公司。

1.1.3 試劑

氯仿、甲醇、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲基異茜草素、甲基異茜草素-1-甲醚、寡糖、水晶蘭苷標準品（純度均＞98%）：由本研究室分離純化得到。

1.1.4 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，10 g NaCl，1 000 mL蒸餾水，115℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；YSC-2數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；VD-650桌上式潔凈式工作臺：蘇州凈化設備有限公司；Ultimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽制巴戟天

將工廠巴戟天用清水洗凈，去除泥土，瀝干待用。每50 g工廠巴戟天中加入50 mL、2%的NaCl中煮沸60 min，撈出瀝干，于60℃條件下熱風干燥24 h，得鹽制巴戟天。

1.3.2 發(fā)酵巴戟天

活化液：分別將0.10 g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106、0.10 g鼠李糖乳桿菌、0.10g植物乳桿菌、0.10g釀酒酵母菌RV171溶于50 mL的2%葡萄糖水中，37℃、160 r/min條件下振蕩混勻活化30 min即為活化液。

發(fā)酵：將瀝干待用的巴戟天用清水于100℃煮制20min，在超凈工作臺上將150 g煮制后的巴戟天置于350 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取1 mL活化液接種于培養(yǎng)基中，搖勻。30℃條件下發(fā)酵12 d。取出瀝干，60℃條件下烘干24 h，烘干的樣品粉碎后過2號篩，于4℃保存，得芽孢桿菌DU-106發(fā)酵巴戟天、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵巴戟天、植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天、釀酒酵母發(fā)酵巴戟天。

1.3.3 活性成分的檢測

水分含量測定：采用水分含量測定儀測定水分含量，每個樣品重復3次[8]。

水溶性浸出物測定：精確稱定樣品4 g，按照2010年版《中國藥典》中冷浸法對可溶性浸出物進行測定[9]。

多糖含量測定：精密稱量巴戟天粉末0.200 g于圓底燒瓶中，加入150 mL體積分數(shù)為80%的乙醇，80℃條件下水浴加熱2 h，過濾；濾渣加入150 mL體積分數(shù)為80%的乙醇，80℃條件下水浴加熱2 h，過濾；濾渣加入150 mL水，100℃水浴加熱2h，過濾，取濾液濃縮，冷卻，定容至100mL。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[10-11]。

游離蒽醌含量測定：精密稱量巴戟天粉末1.0 g置圓底燒瓶中，加入50 mL氯仿，85℃條件下水浴回流1 h后補加20 mL氯仿，繼續(xù)回流1 h，過濾，將濾液中的氯仿?lián)]干，加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解，采用0.5%醋酸鎂-甲醇法測定游離蒽醌的含量[12]。

甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量測定：精密稱量巴戟天粉末2.000g，加氯仿100mL，85℃回流提取2次，每次2 h，濾液合并，回收氯仿，殘渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，以0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液，采用HPLC外標法測定濾液中甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量[13]。HPLC條件為色譜柱：DiamonsilTMC18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～5 min，20%A；5～10 min，20～44%A；10～40 min，44%A；40～50 min，44～95%A；50～55 min，95%A）；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；檢測波長：277nm；柱溫：30℃。

寡糖含量測定：精密稱量巴戟天粉末0.5 g于圓底燒瓶中，精密加入體積分數(shù)60%的乙醇50 mL，85℃回流15 min，轉(zhuǎn)移到具塞錐形瓶中，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20min，冷卻、稱質(zhì)量，用體積分數(shù)60%的乙醇補足至50mL，于4 000 r/min條件下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液。采用HPLC外標法測定巴戟天寡糖（D-果糖、D（+）-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖）含量[14]。HPLC色譜條件為色譜柱：ZORBAX NH2柱（2500 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-超純水（B）；梯度洗脫（0～5 min，70%A～85%A；5～15min，85%A～70%A；15～45min，70%A；后運行5min）；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELCD）。

水晶蘭苷含量測定：精密稱量巴戟天粉末1.000 g于具塞三角瓶中，加入體積分數(shù)80%的甲醇100 mL，15℃條件下冷浸1 h，超聲處理（220 W，55 kHz）1 h，過濾，殘渣加入體積分數(shù)80%的甲醇50 mL，再超聲處理30 min，合并提取液，揮干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液采用HPLC外標法測定水晶蘭苷含量[15]。HPLC色譜條件為色譜柱：Kromalsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（90∶10，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：233 nm；檢測時間：15 min；進樣量：5 μL。柱溫：30 ℃。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Office Excel 2016及DPS 7.05軟件進行處理；作圖采用Office Excel 2016及GraphPad Prism 7。

2 結果與分析

2.1 巴戟天水分含量

不同炮制方法對巴戟天水分含量的影響結果見圖1。

由圖1可知，工廠巴戟天水分含量最低（15.21%）；不同菌種發(fā)酵的4種巴戟天水分含量都在19%～21%；鹽制巴戟天的水含量較高（26.38%）。鹽制巴戟天的水分含量顯著高于發(fā)酵炮制和工廠炮制的巴戟天（P＜0.05），分析原因可能由于鹽煮炮制使得鹽制巴戟天含鹽量較高，貯存時易吸水，導致含水量較高。

圖1 不同炮制方法對巴戟天水分含量的影響Fig.1 Effect of different processing methods on moisture in Morinda officinalisHow.

2.2 巴戟天水溶性浸出物含量

不同炮制方法對巴戟天水溶性浸出物含量的影響結果見圖2。

圖2 不同炮制方法對巴戟天水溶性浸出物含量的影響Fig.2 Effect of different processing methods on water soluble extracts content inMorinda officinalisHow.

由圖2可知，工廠巴戟天和鹽制巴戟天的水溶性浸出物含量都較高，均達到了干質(zhì)量的86%以上，且無顯著性差異（P＞0.05）；而芽孢桿菌DU-106及乳酸菌發(fā)酵后的巴戟天水溶性浸出物含量在55%～62%，且無顯著性差異（P＞0.05）；酵母菌發(fā)酵后的巴戟天水溶性浸出物含量最低，為34.67%。說明發(fā)酵會顯著降低巴戟天中的水溶性物質(zhì)（P＜0.05），且酵母消耗最多，而鹽煮炮制巴戟天中可能鹽含量較高，導致水溶性浸出物含量較高。

2.3 巴戟天多糖含量

不同炮制方法對巴戟天多糖含量的影響結果見圖3。

圖3 不同炮制方法對巴戟天多糖含量的影響Fig.3 Effect different processing methods on polysaccharide content inMorinda officinalisHow.

由圖3可知，酵母發(fā)酵巴戟天多糖含量最多，為4.03%，較工廠巴戟天（2.91%）提高了38.38%；其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵巴戟天，多糖含量為3.79%，較工廠巴戟天提高了30.09%；鹽制巴戟天和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天多糖含量無顯著性差異（P＞0.05），較工廠巴戟天分別提高26.00%和25.39%；植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天多糖含量為3.32%，也能顯著提高巴戟天多糖含量（P＜0.05），較工廠巴戟天提高了14.10%。由此得出，發(fā)酵炮制和傳統(tǒng)鹽制相較于工廠巴戟天都能顯著性的提高巴戟天多糖含量（P＜0.05），說明無論是傳統(tǒng)炮制還是發(fā)酵炮制，都能顯著提高巴戟天多糖含量（P＜0.05）。

2.4 巴戟天游離蒽醌含量

不同炮制方法對巴戟天游離蒽醌含量的影響結果見圖4。

圖4 不同炮制方法對巴戟天游離蒽醌含量的影響Fig.4 Effect of different processing methods on free anthraquinone content inMorinda officinalisHow.

由圖4可知，相比于未處理的工廠巴戟天（0.024mg/g），除鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天外，其他炮制方法都顯著提高了巴戟天中游離蒽醌的含量（P＜0.05）。芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天中游離蒽醌含量最高（0.057 mg/g）；其次是酵母菌發(fā)酵后的巴戟天（0.052mg/g），相比于工廠巴戟天分別提高了139.83%、118.71%，且顯著高于傳統(tǒng)鹽制的巴戟天（P＜0.05）；植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天游離蒽醌含量為0.047 mg/g，與鹽制巴戟天無顯著性差異（P＞0.05），相比于工廠巴戟天提高了96.37%。

2.5 巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量

甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素為巴戟天中主要蒽醌類物質(zhì)，不同炮制方法對巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響結果見圖5。

圖5 不同炮制方法對巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響Fig.5 Effect of different processing methods on rubiadin-1-methylether and rubiadin content inMorinda officinalisHow.

由圖5可知，工廠巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素的含量分別為30.2 mg/kg、9.2 mg/kg；酵母菌發(fā)酵后的巴戟天中的甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量都最高，分別為38.9 mg/kg和11.1 mg/kg，與游離蒽醌含量（0.057 mg/g）基本符合，較工廠巴戟天均顯著提高（P＜0.05）；其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天，甲基異茜草素-1-甲醚的含量為30.7 mg/kg，甲基異茜草素含量為10.9 mg/kg，比游離蒽醌含量（0.057 mg/g）低，分析原因可能是發(fā)酵后，部分甲基異茜草素-1-甲醚或甲基異茜草素轉(zhuǎn)化成了其他蒽醌類物質(zhì)；鹽制巴戟天、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚含量分別為22.7mg/kg、19.5mg/kg、16.4mg/kg，甲基異茜草素含量分別為6.4 mg/kg、7.1 mg/kg、6.3 mg/kg，均顯著低于工廠巴戟天（P＜0.05）。

2.6 巴戟天水晶蘭苷含量

不同炮制方法對巴戟天水晶蘭苷含量的影響結果見圖6。

由圖6可以看出，鹽制巴戟天中的水晶蘭苷含量最高（23.0 mg/g）；其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天（19.9 mg/g）；酵母菌發(fā)酵后的巴戟天的水晶蘭苷含量為14.3 mg/g；鼠李糖乳桿菌發(fā)酵巴戟天和植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天的水晶蘭苷含量無顯著性差異（P＞0.05），分別達到了10.17 mg/g和8.86 mg/g。相比于工廠巴戟天（5.38 mg/g），4個菌種（芽孢桿菌DU-106、酵母菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌）發(fā)酵后的巴戟天中水晶蘭苷分別提高了269.76%、166.59%、89.01%和64.70%。相比于傳統(tǒng)鹽制巴戟天，4個菌種發(fā)酵后的巴戟天都沒有達到鹽制巴戟天的水晶蘭苷含量。

圖6 不同炮制方法對巴戟天中水晶蘭苷含量的影響Fig.6 Effect of different processing methods on monotropein content inMorinda officinalisHow.

2.7 巴戟天寡糖含量

不同炮制方法對巴戟天寡糖（D-果糖、D（+）-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖）含量的影響結果見圖7。

圖7 不同炮制方法對巴戟天中寡糖含量的影響Fig.7 Effect of different processing methods on oligosaccharide content inMorinda officinalisHow.

由圖7可知，鹽制、芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天均能顯著提高巴戟天中果糖含量（P＜0.05），果糖含量分別為374.92 mg/g、61.04 mg/g、61.03 mg/g、57.30 mg/g，而酵母菌發(fā)酵后的巴戟天未測出果糖，分析原因可能是酵母菌消耗了巴戟天中的果糖；相比于鹽制巴戟天，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中的果糖含量都顯著低于傳統(tǒng)鹽制巴戟天（P＜0.05）。以果糖為指標，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發(fā)酵炮制巴戟天。

工廠、鹽制、酵母菌發(fā)酵后的巴戟天中均未測出葡萄糖，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中葡萄糖含量分別為17.79 mg/g、11.90 mg/g和11.82 mg/g。原因可能是芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵炮制巴戟天轉(zhuǎn)化生成了葡萄糖，而酵母菌消耗了葡萄糖，故未測出。以葡萄糖為指標，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發(fā)酵炮制巴戟天。

相較于工廠巴戟天（36.16 mg/g），其中3個菌種芽孢桿菌DU-106（12.68 mg/g）、鼠李糖乳桿菌（28.15 mg/g）、植物乳桿菌（29.02 mg/g）、發(fā)酵巴戟天均不同程度消耗了巴戟天中的蔗糖（64.92%、22.14%、19.74%），而鹽制巴戟天（102.94 mg/g）提高了蔗糖含量（184.69%），其中植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌消耗較少，而芽孢桿菌DU-106消耗較多，酵母菌全部消耗，說明酵母菌不太適合發(fā)酵炮制巴戟天。

4個菌種發(fā)酵炮制巴戟天都消耗了1-蔗果三糖，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中1-蔗果三糖含量分別為9.89 mg/g、16.24 mg/g、13.33 mg/g，而酵母菌發(fā)酵巴戟天中未測出蔗果三糖。相比于工廠巴戟天，DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵分別消耗了巴戟天63.12%、39.49%、50.32%的1-蔗果三糖，而酵母菌全部消耗了巴戟天中的蔗果三糖。相比于傳統(tǒng)鹽制巴戟天[16]，4個菌種發(fā)酵炮制巴戟天都不能達到鹽制提高蔗果三糖含量的效果。

耐斯糖為《中國藥典》中規(guī)定巴戟天質(zhì)量的特征指標。經(jīng)炮制后的巴戟天中耐斯糖含量都有所下降?！吨袊幍洹分幸?guī)定耐斯糖含量標準是2%，其中酵母菌發(fā)酵的巴戟天中耐斯糖含量不達標。相比于工廠巴戟天，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發(fā)酵均顯著降低了巴戟天中的耐斯糖含量（P＜0.05），分別消耗了巴戟天55.30%、43.22%、43.40%和91.77%的耐斯糖。相比于鹽制巴戟天，4個菌種發(fā)酵都不能達到傳統(tǒng)鹽制消耗巴戟天耐斯糖較少的效果。由此得出，無論是傳統(tǒng)炮制方法還是發(fā)酵炮制方法，巴戟天中的耐斯糖都被不同程度的消耗。

相比于工廠巴戟天，經(jīng)炮制后的巴戟天中1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都有顯著性下降（P＜0.05）。其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發(fā)酵分別消耗了巴戟天58.83%、52.52%、58.26%、93.36%的1F-果呋喃糖基耐斯糖。相比于鹽制巴戟天，4個菌株中除酵母菌株外，其他3個菌株發(fā)酵后的巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都達到了或高于傳統(tǒng)鹽制巴戟天的水平，無顯著性差異（P＞0.05）。由此得出，無論是傳統(tǒng)炮制方法還是發(fā)酵炮制方法，都會不同程度的消耗巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖，其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為合適發(fā)酵巴戟天。

通過對巴戟天中6種寡糖的測定，與工廠巴戟天和傳統(tǒng)鹽制巴戟天相比，4個菌種中，芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合作為發(fā)酵巴戟天的菌種，而酵母菌不適合發(fā)酵巴戟天。

3 結論

通過比較不同炮制法巴戟天中的各活性成分發(fā)現(xiàn)，以工廠巴戟天為對照，傳統(tǒng)腌制法優(yōu)于發(fā)酵法炮制巴戟天；芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌發(fā)酵法炮制巴戟天均顯著提高了工廠巴戟天中的水分含量、多糖含量、游離蒽醌總量、水晶蘭苷、果糖、葡萄糖含量（P＜0.05），而不同程度的消耗了工廠巴戟天中的水溶性浸出物、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖，其中酵母菌幾乎全部消耗了巴戟天中的寡糖，芽孢桿菌DU-106優(yōu)于鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌，更適合發(fā)酵炮制巴戟天。