永康高山綠茶超高效液相色譜指紋圖譜研究

楊 璐，支紅峰，胡中豪

（永康市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江永康321300）

永康地處浙江省中部，擁有較多山地和丘陵，氣候溫和，四季分明，利于茶葉生長種植。目前，永康擁有大寒山、毛虎山等生產(chǎn)基地，茶園總面積超過500畝，2018年茶葉總產(chǎn)量約14.5 t。憑借良好的地理優(yōu)勢(shì)與生態(tài)環(huán)境，經(jīng)過多年的開發(fā)與研制，已經(jīng)擁有“寒峰有機(jī)綠茶”、“永康紅”等知名產(chǎn)品。由于受氣候、環(huán)境、加工工藝等因素的影響，茶葉品質(zhì)會(huì)出現(xiàn)一定的差異。

指紋圖譜分析作為目前一種成熟的分析技術(shù)，可對(duì)已知和未知的成分做出全面的表征，適用于中藥及中藥制劑真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制以及新產(chǎn)品開發(fā)等[1-3]，近年來也逐漸在茶葉品質(zhì)控制上得到應(yīng)用[4-11]。通過對(duì)茶葉品質(zhì)做出可量化的評(píng)價(jià)，可以有效彌補(bǔ)“感官評(píng)價(jià)”存在的帶有較強(qiáng)主觀性、缺乏科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，且評(píng)價(jià)結(jié)果易受環(huán)境條件、設(shè)備條件、品評(píng)方法等因素影響的缺陷，是一種更科學(xué)、有效的控制及評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的方法。其中，色譜法應(yīng)用最為廣泛，發(fā)展迅猛[12]。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）由于其靈敏度高、分離效果好等特點(diǎn)，相較于普通液相色譜更有優(yōu)勢(shì)[13-14]。

關(guān)于永康高山綠茶指紋圖譜的研究尚未見報(bào)道，本研究利用超高效液相色譜法初步構(gòu)建了永康高山綠茶UPLC指紋圖譜，以期為品質(zhì)控制提供客觀依據(jù)，同時(shí)也為后期的良種選育提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶樣品1#、2#、8#產(chǎn)自永康毛虎山，3#～7#、9#～10#、14#～15#產(chǎn)自永康大寒山、16#產(chǎn)自永康盤龍谷；11#～13#來自安徽蕪湖，分別為碧螺春茶和2個(gè)炒青茶。

茶氨酸（theanine，T）（99%）、沒食子酸（gallic acid，GA）（99.9%）、可可堿（theobromine，TB）（99.9%）、咖啡因（caffeine，CAF）（500 mg/L）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）（98.1%）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）（99.4%）、兒茶素（catechin，C）（99.3%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，EGCG）（99%）、表兒茶素（epicatechin，EC）（96.7%）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）（98.1%）、三氟乙酸（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

甲醇（色譜純）：美國Tedia公司；無水乙醇（色譜純）：天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WatersUPLCI-class超 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）：美國Waters公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Allefra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；BSA 822電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

茶葉樣品粉碎后取0.20 g，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇水溶液，渦旋混合均勻，于水浴恒溫振蕩器中70℃、200 r/min提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用水定容至25 mL，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

分別稱取茶氨酸、沒食子酸、可可堿、咖啡因、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯適量標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL儲(chǔ)備液備用。

1.3.2 色譜條件

島津Shim-pack XR-ODSⅡ色譜柱（2.0 mm×150 mm，2.2 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫30℃；流動(dòng)相A為0.05%三氟乙酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1；檢測(cè)波長0～3 min為203 nm，3～9 min為280 nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 方法學(xué)考察

取同一綠茶樣品，按1.3.1制備，取同一樣品提取液6份，在1.3.2的色譜條件下分析，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的精密度；取同一樣品提取溶液分別于0、4 h、8 h、16 h、24 h測(cè)定，計(jì)算RSD值，考察方法的穩(wěn)定性。在綠茶樣品中分別添加3份濃度不等的標(biāo)準(zhǔn)混合液，測(cè)定各目標(biāo)成分的回收率。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生成共有模式，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。使用SPSS 22.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析和判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC方法學(xué)考察

方法的精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在精密度實(shí)驗(yàn)中，UPLC圖譜中的各個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于0.06%和3.4%，方法精密度良好；在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，24 h內(nèi)，各共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別小于0.8%和5.0%，說明該方法制備的綠茶提取液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，茶氨酸等10種組分3水平的平均加標(biāo)回收率在89.2%～110.4%范圍內(nèi)，其RSD值在0.9%～3.9%之間，符合檢測(cè)方法對(duì)回收率的要求。

表2 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision and stability tests

表3 10種成分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recoveries tests of 10 components

2.2 UPLC指紋圖譜構(gòu)建

在同一色譜條件下對(duì)13批次樣品進(jìn)行測(cè)試，所得色譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析，得到13個(gè)綠茶樣品的指紋圖譜（圖1）和共有模式（圖2）。

選擇相對(duì)穩(wěn)定、出峰時(shí)間適中且峰面積較大的15號(hào)色譜峰為參照峰，分別計(jì)算各樣品中其余組分峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積。各組分峰按相對(duì)保留時(shí)間一一匹配后共得到18個(gè)共有峰。但有研究發(fā)現(xiàn)在出峰密集的情況下，僅用相對(duì)保留時(shí)間作為定性，結(jié)果并不完全可靠，需要進(jìn)一步驗(yàn)證[15-16]。利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)各色譜峰進(jìn)行光譜掃描（190～400 nm）可作為共有峰的輔助識(shí)別。將各樣品中的18個(gè)共有峰最大吸收波長兩兩進(jìn)行比較，其中8、13、15號(hào)色譜峰的最大吸收波長稍有差異（＜10 nm），但其全波長掃描圖譜形狀基本一致，可認(rèn)為是同一種物質(zhì)。其余15個(gè)共有峰之間的差異均＜5 nm。因此，通過光譜分析驗(yàn)證13個(gè)永康綠茶樣品指紋圖譜中共有18個(gè)共有峰，其最大吸收波長和相對(duì)保留時(shí)間見表4。

圖1 13個(gè)永康綠茶樣品的UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprint of 13 Yongkang green tea samples

圖2 永康綠茶UPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of UPLC fingerprint of Yongkang green tea

表4 13個(gè)綠茶樣品共有峰的最大吸收波長和相對(duì)保留時(shí)間Table 4 Maximum absorption wavelength and relative retention time of common peaks of 13 Yongkang green tea samples

經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定了9個(gè)峰的組分：峰3為茶氨酸，峰8為沒食子酸，峰9為沒食子兒茶素，峰11為可可堿，峰14為表沒食子兒茶素，峰15為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，峰16為咖啡因，峰17為表兒茶素，峰18為表兒茶素沒食子酸酯。且各色譜峰與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品峰最大吸收波長一致。18個(gè)共有峰面積占總峰面積比例約為95%，基本涵蓋了綠茶內(nèi)在的化學(xué)信息。

2.3 相似度評(píng)價(jià)

經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）軟件計(jì)算，13個(gè)永康本地綠茶樣品與其共有模式的相似度分別為0.990、0.988、0.990、0.990、0.988、0.996、0.992、0.988、0.985、0.989、0.994、0.988、0.984，相似度均＞0.98，符合指紋圖譜的要求，說明永康本土綠茶化學(xué)成分相似、質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4 不同產(chǎn)地綠茶的聚類分析和判別分析

數(shù)據(jù)采用歐式最短距離法對(duì)不同產(chǎn)地的綠茶進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)臨界值為5時(shí)，16個(gè)茶樹樣品可以分為2大類。其中，來自永康本地的聚成一類，安徽蕪湖的3個(gè)樣品聚成一類。來自安徽的碧螺春茶和炒青茶的加工工藝與永康本地高山綠茶加工工藝相似，主要經(jīng)過殺青、揉捻、干燥三個(gè)步驟，聚類分析結(jié)果表明，永康本地高山綠茶與來自安徽蕪湖的綠茶樣品內(nèi)在化學(xué)成分存在一定差異，可用聚類分析手段進(jìn)行初步篩分。

圖3 不同產(chǎn)地綠茶的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of green tea samples from different regions

本實(shí)驗(yàn)分為兩分類典則判別，Wilkλ值為0.001，卡方為48.811，P值為0.000，判別函數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Fisher判別函數(shù)得到兩類樣品的校正集判別與聚類分析結(jié)果完全一致，省外3個(gè)綠茶樣品判為一類，其余13個(gè)永康綠茶樣品判為一類。整體判別模型穩(wěn)定，同時(shí)也進(jìn)一步確認(rèn)了聚類分析的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用UPLC指紋圖譜分析手段得到了永康高山綠茶內(nèi)在化學(xué)成分的綜合信息，并通過保留時(shí)間定性和光譜掃描等方式確定了18個(gè)共有峰，同時(shí)確定了響應(yīng)值最高的9個(gè)峰的成分。該圖譜可有效反映永康高山綠茶內(nèi)在成分的相似性。通過聚類分析和判別分析進(jìn)一步證實(shí)該指紋圖譜的穩(wěn)定性與專一性，可作為永康高山綠茶質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。此外，綠茶品質(zhì)易受產(chǎn)地環(huán)境、加工工藝等多個(gè)因素的影響，后續(xù)研究可參考本試驗(yàn)建立的指紋圖譜，結(jié)合質(zhì)譜等儀器方法完善指紋圖譜信息，并將永康高山綠茶做進(jìn)一步甄別研究與選育研究。