高Cu、高Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性作用

尹素真， 于沖， 李光德,*， 劉玉升， 趙杰， 張心怡

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，泰安271018

2.山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018

3.土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，泰安271018

4.山東省萊蕪市萊城區(qū)環(huán)境保護(hù)局，萊蕪271100

5.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安271018

高Cu、高Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性作用

尹素真1,2,3， 于沖4， 李光德1,2,3,*， 劉玉升5， 趙杰1,2,3， 張心怡1,2,3

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，泰安271018

2.山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018

3.土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，泰安271018

4.山東省萊蕪市萊城區(qū)環(huán)境保護(hù)局，萊蕪271100

5.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安271018

Cu(銅)和Zn(鋅)是環(huán)境中最常見的重金屬污染元素,為探究其對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性,采用濾紙接觸法、人工土壤法和菌渣培養(yǎng)法研究了高Cu、高Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的生長(zhǎng)及氧化脅迫效應(yīng)。結(jié)果表明,濾紙接觸法和人工土壤法中試驗(yàn)濃度Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲死亡率無明顯影響。菌渣培養(yǎng)法中蟲體的取食抑制率和體重增長(zhǎng)抑制率均與Cu、Zn濃度呈顯著性正相關(guān)關(guān)系；Cu處理誘導(dǎo)了蟲體可溶性蛋白含量的增加,抑制了SOD(超氧化物歧化酶)、GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)的活性和MDA(丙二醛)的產(chǎn)生,對(duì)CAT(過氧化物酶)活性沒有顯著影響；Zn濃度為3 500和5 000mg·kg-1的處理組可溶性蛋白含量被顯著誘導(dǎo)、MDA含量被顯著抑制,濃度為2 000和6 500mg·kg-1處理組的SOD活性被激活(P＞0.05),Zn脅迫未對(duì)CAT、GST活性造成明顯影響。表明Cu、Zn污染對(duì)白星花金龜幼蟲生長(zhǎng)具有毒性效應(yīng),在評(píng)價(jià)高濃度的重金屬污染對(duì)蟲體的毒性作用時(shí),不能僅采用SOD、CAT、GST等指標(biāo)作為標(biāo)志物,需要綜合其他指標(biāo)進(jìn)行分析。

Cu；Zn；白星花金龜幼蟲；毒性作用

隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展,每年都會(huì)產(chǎn)生大量的畜禽糞便[1]。根據(jù)國家農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)生物質(zhì)能產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2007—2015年)》,2015年我國規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便資源的實(shí)物量可達(dá)32.5億t。畜禽糞便的大量堆積和不合理排放,在制約畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時(shí),也會(huì)對(duì)周邊地區(qū)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[2]。因此,畜禽糞便的無害化處置是當(dāng)今社會(huì)普遍關(guān)注和亟待解決的熱點(diǎn)問題。然而,畜禽糞便的成分與以往比已經(jīng)發(fā)生了質(zhì)的改變,由于畜禽飼料中普遍采用高Cu、高Zn等添加劑,使得畜禽糞便的重金屬污染問題越來越突出[3]。根據(jù) Bonazzi等[4]的研究,畜禽飼料中有72%～80%的Cu隨糞便排出體外,Zn的比例則高達(dá)92%～96%。根據(jù)對(duì)江蘇省大型養(yǎng)殖場(chǎng)的飼料和畜禽糞便中金屬元素含量的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其中以Cu、Zn污染最為嚴(yán)重[5]。

白星花金龜(Potosia brevitarisLewis)又名白紋銅花金龜、白星花潛,屬于鞘翅目(Coleoptera)、金龜甲總科(Scarabaeoidea)、花金龜科(Cetoniidae)。其幼蟲俗稱蠐螬,是重要的腐食性昆蟲,主要在糞堆、菌渣堆、腐爛的作物秸稈堆等里營寄生生活[6],與蚯蚓、蠅蛆、黑水虻等一起,素有“清道夫”的美稱[7]。其幼蟲不僅可以入藥,營養(yǎng)物質(zhì)含量也很豐富,被譽(yù)為“蛋白質(zhì)飼料寶庫”[8]；同時(shí),幼蟲過腹轉(zhuǎn)化畜禽糞便及其他農(nóng)業(yè)廢棄物后得到的蠐螬糞具有良好的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)特性,可作為有機(jī)肥。因此,白星花金龜?shù)酿B(yǎng)殖業(yè)近年來不斷發(fā)展。

目前對(duì)白星花金龜幼蟲的研究主要集中在對(duì)廢棄物的轉(zhuǎn)化利用方面[9],但對(duì)污染物對(duì)其毒理方面的研究還鮮有報(bào)道。因此本研究選取白星花金龜?shù)?齡幼蟲作為供試材料,采用OECD推薦的方法,研究了高濃度的重金屬Cu、Zn單一作用下對(duì)其的毒性效應(yīng),以期為白星花金龜幼蟲生產(chǎn)中預(yù)防重金屬污染危害提供一定的實(shí)踐指導(dǎo),并為進(jìn)一步開展利用白星花金龜幼蟲提取或固定畜禽糞便中重金屬等的研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試生物

試驗(yàn)所用生物為在實(shí)驗(yàn)室條件下連續(xù)飼養(yǎng)至第3代的白星花金龜幼蟲,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康3齡幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 供試重金屬

CuSO4·5H2O(99%,AR),購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,ZnSO4·7H2O(99.5%,AR),購自天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濾紙接觸毒性試驗(yàn)

根據(jù)OECD推薦的濾紙接觸法,首先配制Cu、Zn濃度均為0(CK)、0.4、4、40、400和4 000mg·L-1的溶液；在直徑為7 cm的養(yǎng)蟲盒底部墊入直徑為8 cm的濾紙,取預(yù)先配制好的重金屬溶液各2 mL均勻?yàn)⒃跒V紙上,使Cu、Zn的染毒濃度分別為0(CK)、0.0159、0.159、1.59、15.9和159mg·cm-2,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行分別投放預(yù)先清腸24 h并清洗干凈的3齡幼蟲6頭,然后用保鮮膜封口,用解剖針將保鮮膜扎孔后置于溫度為(25±1)℃、濕度為70%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于試驗(yàn)開始的第24、48和72小時(shí)觀察和記錄其中毒癥狀和死亡情況,以白星花金龜幼蟲頭部和尾部對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡。

1.2.2 人工土壤毒性試驗(yàn)

根據(jù)OECD中的標(biāo)準(zhǔn)方法配制人工土壤:由10%的苔蘚泥炭細(xì)土,20%的高嶺粘土(高嶺土大于50%),69%的工業(yè)石英砂(含50%以上0.05～0.2 mm的細(xì)小顆粒)和1%的CaCO3(化學(xué)純)組成。

分別將一定濃度的重金屬水溶液與500 g人工土充分混合(人工土以干重計(jì)),使人工土中Cu、Zn的濃度分別為100、1 000、3 000、6 000和8 000mg·kg-1,同時(shí)設(shè)未添加重金屬的作為空白對(duì)照(CK),加適量去離子水調(diào)整人工土壤的含水率在35%左右,轉(zhuǎn)移到1 L沖洗干凈的大燒杯中平衡48 h,選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的白星花金龜3齡幼蟲(預(yù)先清腸24 h)投入燒杯中,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行投放10頭,用保鮮膜封口,并用解剖針在保鮮膜上扎孔后置于(25±1)℃的生化培養(yǎng)箱中無光照連續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后的第7、14天記錄白星花金龜幼蟲的中毒癥狀及存活狀況,以白星花金龜幼蟲頭部和尾部對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡。

1.2.3 菌渣毒性試驗(yàn)

供試菌渣為平菇菌渣,分別將一定濃度的重金屬水溶液與400 g菌渣充分混合(菌渣以干重計(jì)),使菌渣中Cu和Zn的濃度分別為500、2 000、3 500、5 000和6 500mg·kg-1,同時(shí)設(shè)置未添加重金屬的作為空白對(duì)照(CK),加適量去離子水調(diào)整含水率至約60%,轉(zhuǎn)移到1 L沖洗干凈的大燒杯中平衡48 h,選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的白星花金龜3齡幼蟲(預(yù)先清腸24 h)投入燒杯中,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行投放10頭,培養(yǎng)方法同人工土壤毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)濃度下蟲體未出現(xiàn)死亡,分別于培養(yǎng)后的第7、14天記錄白星花金龜幼蟲的生長(zhǎng)情況,并在試驗(yàn)結(jié)束后取幼蟲測(cè)定高濃度的Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的氧化脅迫情況,包括對(duì)其體內(nèi)可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性、GST活性、MDA含量及取食量等的影響。

1.3 測(cè)定方法

可溶性蛋白含量參照Bradford[10]的方法,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,在595 nm進(jìn)行比色測(cè)定；SOD活性參照Beauchamp和Fridovich[11]的方法,酶的活力采用抑制NBT光化還原50%為一個(gè)活力單位,用U·mg-l蛋白表示；CAT活性測(cè)定參照徐鏡波等[12]的方法,以每1 min催化1μmol H2O2分解的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(mol·g-lFW)；GST活性測(cè)定采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)比色法[13],還原型谷胱甘肽(GSH)與CDNB反應(yīng)生成2,4-二硝基-谷胱甘肽復(fù)合物(GS-CDNB),該復(fù)合物的生成量可以反映GST的活性,以每分鐘生成1 nmol的產(chǎn)物為一個(gè)活力單位,用nmol·min-1·mg-l蛋白表示。菌渣毒性試驗(yàn)結(jié)束后分離蟲體、蟲糞和剩余菌渣,測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蟲體質(zhì)量和剩余菌渣的干重,計(jì)算白星花金龜幼蟲的體重增長(zhǎng)率和取食量。體重增長(zhǎng)率(%) =(試驗(yàn)開始時(shí)的蟲體鮮重-試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的蟲體鮮重)/試驗(yàn)開始時(shí)的蟲體鮮重×100；體重增長(zhǎng)抑制率(%)=(CK組的體重增長(zhǎng)率-處理組的體重增長(zhǎng)率)/ CK組的體重增長(zhǎng)率×100；取食量(g)=試驗(yàn)開始時(shí)的菌渣干重-試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的菌渣干重；取食抑制率(%)=(CK組的取食量-處理組的取食量)/CK組的取食量×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用 Microsoft Excel 2013和SPSS17.0軟件進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(Mean±SE),并利用單因素方差分析法進(jìn)行空白(CK)組與處理組之間的差異顯著性分析,同時(shí)利用線性回歸分析進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的擬合。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cu和Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性

2.1.1 濾紙接觸毒性

表1為Cu和Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的濾紙接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果。濾紙接觸法中各時(shí)間段白星花金龜幼蟲的中毒癥狀均不明顯,但各處理組與CK組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),均出現(xiàn)蟲體身體變軟、活力下降等現(xiàn)象。由表1可以看出,試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Cu和Zn濃度與白星花金龜幼蟲的死亡率無顯著規(guī)律性,說明試驗(yàn)濃度Cu和Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的死亡率影響很小,Cu和Zn對(duì)白星花金龜幼蟲無明顯的接觸毒性。

2.1.2 人工土壤毒性

表2為Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的人工土壤毒性試驗(yàn)結(jié)果。人工土壤法中白星花金龜幼蟲的中毒癥狀重于濾紙接觸法,主要表現(xiàn)為蟲體取食量減少、體重減輕、活力降低、體表環(huán)節(jié)皺縮等,這種癥狀隨Cu、Zn濃度的升高而加劇,在高濃度(8 000mg·kg-1)時(shí)蟲體出現(xiàn)了明顯的拒食現(xiàn)象。由表2可以看出,人工土壤法中試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Cu、Zn濃度與白星花金龜幼蟲的死亡率也無顯著規(guī)律性,此外,由于人工土壤環(huán)境與白星花金龜幼蟲生活的自然環(huán)境(畜禽糞、菌渣、秸稈堆等有機(jī)質(zhì)豐富的地方)差別較大, CK組和各處理組蟲體的取食量均較少,因此,本試驗(yàn)又對(duì)菌渣中Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性效應(yīng)進(jìn)行了研究。

表1 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的濾紙接觸毒性Table 1 The contact filter paper toxic effect of Cu and Zn onP.brevitarisLewis larvae

表2 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的人工土壤毒性Table 2 The artificial soil toxic effect of Cu and Zn onP.brevitarisLewis larvae

表3 重金屬濃度與蟲體取食及體重增長(zhǎng)抑制率的相關(guān)性分析Table 3 Correlation relationships between the feeding amount,body growth inhibition rate and the concentration of heavy metals

2.1.3 菌渣毒性

試驗(yàn)濃度Cu、Zn與白星花金龜幼蟲取食及體重增長(zhǎng)抑制率的相關(guān)性分析如表3所示,對(duì)蟲體取食量的影響如圖1所示,對(duì)蟲體體重增長(zhǎng)率的影響如圖2所示。

圖1 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲取食情況的影響注:圖中不同小寫字母表示與CK組比差異顯著(P＜0.05),下同。Fig.1 Effects of Cu and Zn on the feeding amount of P.brevitarisLewis larvaeNote:Different letters indicated significant differences compared with the control group(P＜0.05),the same below.

圖2 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)率的影響Fig.2 Effects of Cu and Zn on the weight growth rate ofP.brevitarisLewis larvae

2.1.3.1 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲取食情況的影響

由圖1可以看出,隨著菌渣中Cu、Zn含量的升高,各處理組的白星花金龜幼蟲取食量呈逐漸降低的趨勢(shì),并且均低于CK組,但低濃度的Cu、Zn(500mg·kg-1)處理組的蟲體取食量與CK組均無顯著性差異(P＞0.05)。濃度為2 000mg·kg-1的Cu處理組蟲體取食量顯著下降(P＜0.05),比CK組低59.7%；隨著Cu濃度的升高(3 500、5 000、6 500mg·kg-1),蟲體取食量繼續(xù)逐漸下降,且顯著低于CK組和低濃度處理組(P＞0.05),說明食物中高濃度的Cu能夠抑制蟲體的取食(P＜0.05)。除低濃度Zn(500mg·kg-1)處理組外,其他Zn處理組的蟲體取食量也顯著低于CK組(P＜0.05),說明高濃度的Zn作用也會(huì)抑制蟲體的取食,使蟲體出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。此外,相同濃度的Cu作用下的蟲體取食量均低于Zn作用。

通過對(duì)Cu、Zn濃度與白星花金龜幼蟲取食抑制率的回歸分析可知(見表3),Cu濃度與蟲體取食抑制率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P=0.023,R2=0.707),通過回歸方程得到當(dāng)抑制率達(dá)到25%(EC25)和50% (EC50)時(shí)的Cu濃度分別為1 264和3 537mg·kg-1。Zn濃度與蟲體取食抑制率表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系(P=0,R2=0.983),通過回歸方程得到當(dāng)抑制率達(dá)到25%(EC25)和50%(EC50)時(shí)的Zn濃度分別為2 744、5 521mg·kg-1。Cu的EC25、EC50均小于Zn,說明Cu對(duì)白星花金龜幼蟲取食的抑制作用大于Zn。

2.1.3.2 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)率的影響

由圖2A可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)率呈先升高后逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)Cu濃度為500mg·kg-1時(shí),第7、14天時(shí)的幼蟲體重增長(zhǎng)率均高于CK組,但無顯著性差異(P＞0.05)。隨著菌渣中Cu濃度的繼續(xù)升高,在第7天時(shí),蟲體的體重增長(zhǎng)率小于0,并顯著低于CK組(P＜0.05),各處理組間也表現(xiàn)為顯著性差異(P＜0.05)；第14天時(shí)各處理組的幼蟲體重增長(zhǎng)率與CK組均無顯著性差異(P＞0.05)。CK組和高濃度(3 500、5 000、6 500mg·kg-1)處理組蟲體第14天時(shí)的體重增長(zhǎng)率均高于第7天,可能與蟲體對(duì)添加高濃度Cu菌渣的逐漸適應(yīng)有關(guān)。

由圖2B可以看出,隨著Zn濃度的升高,白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)率也呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)Zn濃度為500mg·kg-1時(shí),第7、14天時(shí)的幼蟲體重增長(zhǎng)率均升高,但與CK組均無顯著性差異(P＞0.05)。在第7天時(shí),低濃度處理組(500、2 000mg·kg-1)與CK組無顯著性差異(P＞0.05),其他處理組則顯著低于CK組(P＜0.05)；第14天時(shí),除濃度為6 500mg·kg-1的處理組外,其他處理組與CK組均無顯著性差異(P＞0.05)。此外,除500mg·kg-1處理組外,其他處理組蟲體第14天時(shí)的體重增長(zhǎng)率均低于第7天。

通過對(duì)Cu、Zn濃度與白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)抑制率的回歸分析可知(見表3),Cu、Zn濃度與蟲體體重增長(zhǎng)抑制率均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系(P= 0.004)。通過回歸方程計(jì)算可知,當(dāng)抑制率達(dá)到25%(EC25)和50%(EC50)時(shí)的Cu濃度分別為991、1 269mg·kg-1,Zn濃度分別為1 221、1 374mg·kg-1。Cu的EC25、EC50均小于Zn,說明Cu對(duì)白星花金龜幼蟲體重增長(zhǎng)的抑制作用大于Zn。

2.2 Cu、Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的氧化脅迫效應(yīng)

白星花金龜幼蟲暴露于Cu、Zn污染的菌渣中體內(nèi)SOD、CAT、GST活性的變化如圖3中所示,可溶性蛋白含量和MDA含量的變化如圖4所示。

2.2.1 SOD活性

由圖3A可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體內(nèi)SOD活性呈先降低后升高又降低的變化趨勢(shì),當(dāng) Cu含量為500mg·kg-1時(shí),蟲體SOD活性最小,比CK組低30.33%,被顯著抑制(P＜0.05)；當(dāng)Cu含量為3 500、5 000、6 500mg·kg-1時(shí),蟲體SOD活性與CK組差異不顯著(P＞0.05)。但各處理組的SOD活性均小于CK組,被不同程度的抑制。隨著Zn濃度的升高,蟲體SOD活性呈先降低后升高降低后又升高的波動(dòng)變化趨勢(shì),當(dāng)Zn含量為3 500mg·kg-1時(shí),蟲體SOD活性被顯著抑制(P＜0.05)；當(dāng)Zn含量為2 000和6 500mg·kg-1時(shí),SOD活性被激活,分別比CK組高了14.30%和20.47%,但差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 Cu、Zn對(duì)蟲體SOD、CAT、GST活性的影響Fig.3 Effects of Cu and Zn on the SOD,CAT,GST activities ofP.brevitarisLewis larvae

2.2.2 CAT活性

由圖3B可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體內(nèi)CAT活性變化趨勢(shì)與SOD相同,并且各處理組與CK組差異均不顯著(P＞0.05),除Cu含量為3 500mg·kg-1的處理組外,各處理組的CAT活性均低于CK組,也受到了一定的抑制。隨著Zn濃度的升高,蟲體CAT活性呈先升高后降低又逐漸升高的波動(dòng)變化趨勢(shì),各處理組也與CK組差異不顯著(P＞0.05),除Zn含量為500mg·kg-1的處理組外,其他各處理組的 CAT活性也均低于CK組。

2.2.3 GST活性

由圖3C可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體內(nèi)GST活性變化不穩(wěn)定,當(dāng)Cu含量為500mg·kg-1時(shí),GST活性最小,比CK組低了57.45%,被顯著抑制(P＜0.05),其他各處理組的GST活性則與CK組均無顯著性差異(P＞0.05),但各處理組的GST活性均低于CK組,即試驗(yàn)濃度Cu對(duì)GST主要表現(xiàn)為抑制作用。隨著Zn濃度的升高,蟲體GST活性呈先升高后降低、升高后又降低的波動(dòng)變化趨勢(shì),各處理組的GST活性均高于CK組,試驗(yàn)濃度Zn對(duì)GST則主要表現(xiàn)為激活作用,但差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.4 可溶性蛋白含量

由圖4A可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體內(nèi)可溶性蛋白含量總體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì),各處理組的可溶性蛋白含量均顯著高于CK組(P＜0.05),說明Cu作用誘導(dǎo)了白星花金龜幼蟲體內(nèi)可溶性蛋白含量的生成；在Cu含量為500mg·kg-1時(shí),蟲體可溶性蛋白含量達(dá)最高,并且與其他處理間差異顯著(P＜0.05),即Cu在500mg·kg-1時(shí)對(duì)蟲體內(nèi)可溶性蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)。隨著Zn濃度的升高,蟲體可溶性蛋白含量呈先降低后升高又降低的變化趨勢(shì),其中3 500、5 000mg·kg-1Zn處理組的可溶性蛋白含量顯著高于CK組(P＜0.05),其他處理組的可溶性蛋白含量均低于CK組(P＞0.05),說明Zn在一定濃度范圍內(nèi)能夠誘導(dǎo)蟲體可溶性蛋白含量的升高。

2.2.5 MDA含量

由圖4B可以看出,隨著Cu濃度的升高,白星花金龜幼蟲體內(nèi)的MDA含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì),當(dāng)Cu濃度為3 500mg·kg-1時(shí),蟲體MDA含量最低,顯著低于CK組25%(P＜0.05),其他各處理組的MDA含量也均低于CK組,但差異不顯著(P＞0.05)。隨著Zn濃度的升高,蟲體MDA含量呈先升高后降低又升高的變化趨勢(shì),當(dāng)Zn含量為500、2 000mg·kg-1時(shí),蟲體MDA含量高于CK組,但差異不顯著(P＞0.05),隨著Zn濃度的進(jìn)一步升高,蟲體MDA含量降低,當(dāng)Zn為5 000mg·kg-1時(shí),蟲體MDA含量最小,比CK組低了41.67%,與CK組差異顯著(P＜0.05)。

3 討論(Discussion)

Cu、Zn是生物進(jìn)行正常生理活動(dòng)的必需元素,但當(dāng)攝取過量時(shí),則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒害作用。本文采用濾紙接觸法、人工土壤法和與白星花金龜幼蟲生活環(huán)境較為相似的菌渣培養(yǎng)法研究了Cu、Zn單一作用對(duì)其的生態(tài)毒性效應(yīng)。

圖4 Cu、Zn對(duì)蟲體可溶性蛋白、MDA含量的影響Fig.4 Effects of Cu and Zn on the content of the soluble protein and MDA ofP.brevitarisLewis larvae

從研究結(jié)果可以看出,濾紙接觸法和人工土壤法中Cu、Zn的試驗(yàn)濃度對(duì)白星花金龜幼蟲的死亡率無明顯影響,這與李桂亭等[14]對(duì)稀土的研究結(jié)果相似,在他們?cè)O(shè)計(jì)的稀土試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)(濾紙接觸法:0～3 000mg·L-1；自然土壤法:0～3 000mg·kg-1),蠐螬死亡率受稀土試驗(yàn)濃度的影響很小,可能與蟲體本身具有較強(qiáng)的耐受性有關(guān)。菌渣培養(yǎng)法中試驗(yàn)蟲體均未出現(xiàn)死亡,當(dāng)Cu、Zn濃度為500mg·kg-1時(shí),幼蟲體重增長(zhǎng)率均高于CK組(P＞0.05),說明低濃度Cu、Zn能夠促進(jìn)蟲體的生長(zhǎng),但高濃度的Cu、Zn明顯抑制了蟲體的取食和生長(zhǎng),并且這種抑制程度隨Cu、Zn濃度的增大而逐漸增強(qiáng),分析可能是白星花金龜幼蟲應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的一種重要機(jī)制,由于高濃度的Cu、Zn的侵染,幼蟲會(huì)減少對(duì)食物的攝取,而與此同時(shí),蟲體解毒代謝活動(dòng)加劇了對(duì)自身能量的消耗,進(jìn)而導(dǎo)致蟲體重下降[15-17]。

通過對(duì)Cu、Zn濃度與白星花金龜幼蟲取食抑制率和體重增長(zhǎng)抑制率的回歸分析可知,取食抑制率和體重增長(zhǎng)抑制率均與Cu、Zn濃度表現(xiàn)為顯著性正相關(guān)關(guān)系,說明白星花金龜幼蟲在對(duì)畜禽糞污等的Cu、Zn污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。通過計(jì)算可知,蟲體的取食抑制率和體重增長(zhǎng)抑制率達(dá)到25%(EC25)和50%(EC50)時(shí)的Cu濃度均小于Zn濃度,表明Cu對(duì)白星花金龜幼蟲的毒害作用大于Zn,同時(shí)重金屬對(duì)動(dòng)物的毒性作用不僅與其濃度有關(guān),也與重金屬的性質(zhì)有關(guān)[18]。

根據(jù)Mosleh等[19]的研究,重金屬、有機(jī)物、寒、旱等外來脅迫會(huì)使動(dòng)、植物體內(nèi)可溶性蛋白的合成能力發(fā)生改變,這是動(dòng)、植物受到外界脅迫的一種直接指示。研究發(fā)現(xiàn),Cu處理組的蟲體可溶性蛋白含量均顯著高于CK組(P＜0.05),Zn含量為3 500、5 000mg·kg-1處理組的可溶性蛋白含量也顯著高于CK組(P＜0.05),分析可能是白星花金龜幼蟲應(yīng)對(duì)Cu、Zn脅迫所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),通過合成更多可溶性蛋白減輕機(jī)體受到的毒害。

在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中,昆蟲同其他動(dòng)物一樣,體內(nèi)也形成了一套有效抵御自由基損傷的抗氧化防御系統(tǒng),包括SOD、CAT、GST等,它們能夠使昆蟲體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)[20-21],從而保證生物體各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行。SOD能夠?qū)⒊蹶庪x子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2,然后由CAT進(jìn)一步將H2O2迅速分解為H2O和O2,SOD和CAT協(xié)作構(gòu)成了生物體抵御外界脅迫的第一道防線。GST屬于生物體內(nèi)第二代謝階段的酶,不僅可以催化GSH與親電子代謝物的結(jié)合[22],其自身還可以與親脂性物質(zhì)結(jié)合,從而生成水溶性的化合物排出體外,起到解毒和阻斷生物體脂質(zhì)過氧化的作用[23]。在受到逆境條件脅迫時(shí),生物體內(nèi)的自由基含量發(fā)生變化,從而誘導(dǎo)酶活水平改變,自由基所具有的超強(qiáng)的氧化能力也會(huì)導(dǎo)致生物體的功能分子損傷,使細(xì)胞功能受到威脅。MDA是生物體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物,其含量越高,表明機(jī)體受到的過氧化損傷越嚴(yán)重,此外,MDA能夠與蛋白質(zhì)中的游離氨基作用,使蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)與分子間的交聯(lián),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[24]。

本研究中,在受到 Cu脅迫后,低濃度(500、2 000mg·kg-1)處理組的 SOD活性低于高濃度(3 500、5 000、6 500mg·kg-1)處理組,可能與低濃度下幼蟲取食了大量的菌渣,在攝入的大量Cu脅迫下超氧陰離子的生成量超出了機(jī)體清除能力,導(dǎo)致SOD活性下降,而在Cu高濃度時(shí),蟲體由于拒食而維持了體內(nèi)SOD活力的相對(duì)穩(wěn)定。而各處理組蟲體的SOD活性均低于CK組,可能是由于生物體內(nèi)的自由基超出了自身的承受范圍,此時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的SOD已經(jīng)不能有效清除自由基的傷害,SOD的活力就會(huì)降低[25],這與關(guān)于高濃度污染物對(duì)蚯蚓[26-28]、家蠶[29]、果蠅[30]等的研究結(jié)果相似。各處理組CAT活性變化規(guī)律與SOD一致,并且各處理組CAT活性均與CK組無顯著性差異(P＞0.05),試驗(yàn)處理對(duì)CAT活性沒有顯著影響。在Cu含量為500mg·kg-1時(shí), GST活性被顯著抑制(P＜0.05),可能是低濃度下攝入的大量Cu對(duì)蟲體的毒害作用超過了GST的解毒作用,使其活力中心遭到破壞,導(dǎo)致活性降低[26]；其他處理組GST活性也低于CK組但差異不顯著(P＞0.05),分析原因同SOD變化,蟲體通過減少攝食降低了對(duì)GST的毒害作用。各處理組MDA含量均低于CK組,除3 500mg·kg-1處理組MDA含量顯著低于CK組外(P＜0.05),其他各處理組均與CK組無顯著性差異(P＞0.05),進(jìn)一步說明試驗(yàn)濃度水平下Cu未對(duì)白星花金龜幼蟲造成明顯過氧化損傷,蟲體內(nèi)的解毒系統(tǒng)在抵抗外來脅迫所導(dǎo)致的損傷時(shí)有效發(fā)揮了作用。

在受到Zn脅迫后,濃度為2 000和6 500mg·kg-1的處理組SOD活性被激活,其他處理組的SOD活性被抑制,但除3 500mg·kg-1處理組的SOD活性顯著低于CK組外(P＜0.05),其他處理組均與CK組差異不顯著(P＞0.05),說明蟲體可以通過調(diào)節(jié)SOD酶的活性來抵御一定量外源重金屬的氧化脅迫。除500mg·kg-1處理組外,其他各處理組的CAT活性均低于CK組,與受到Cu脅迫相同,Zn脅迫也未對(duì)CAT活性造成明顯影響,此外,Zn作用下的GST活性也與CK組無顯著性差異(P＞0.05),說明試驗(yàn)濃度Zn未對(duì)蟲體造成嚴(yán)重的過氧化影響,可能與蟲體自身的調(diào)節(jié)作用有關(guān),一方面蟲體自身的耐受性較強(qiáng),另一方面蟲體通過拒食或排泄作用維持了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的相對(duì)平衡。除3 500和5 000mg·kg-1處理組蟲體的MDA含量顯著低于CK組(P＜0.05)外,其他處理組均與CK組無顯著性差異(P＞0.05),進(jìn)一步說明了蟲體通過自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)維持了體內(nèi)代謝的相對(duì)穩(wěn)定。

試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)蟲體的可溶性蛋白含量、SOD、CAT、GST活性和MDA含量的變化與Cu、Zn的濃度有明顯的關(guān)系,這可能與昆蟲體內(nèi)存在的多種解毒機(jī)制有關(guān)[31],昆蟲的解毒機(jī)制與抗氧化系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的生物學(xué)關(guān)系[23],抗氧化系統(tǒng)中各種酶的活性也會(huì)受到各種因素的影響,進(jìn)而導(dǎo)致這種關(guān)系不明顯。綜合分析試驗(yàn)濃度Cu、Zn對(duì)蟲體的取食、抗氧化酶系統(tǒng)影響的結(jié)果,高濃度污染物作用下的蟲體取食量顯著低于CK組,也可能是Cu、Zn引起了蟲體的消化系統(tǒng)毒性,由于無法取食進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生的一些次生效應(yīng),并非真正的拒食[32],其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。此外,在不影響白星花金龜幼蟲正常取食情況下Cu、Zn污染對(duì)其的生態(tài)毒性的研究也在進(jìn)行中。

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Toxicological Effects of Excessive Cu and Zn on Protaetia brevitaris Lewis Larvae

Yin Suzhen1,2,3,Yu Chong4,Li Guangde1,2,3,*,Liu Yusheng5,Zhao Jie1,2,3,Zhang Xinyi1,2,3
1.College of Resource and Environment,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China
2.Key Laboratory of Agricultural Environment in Universities of Shandong,Taian 271018,China
3.National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources,Taian 271018,China
4.Laicheng District Environment-Protection Bureau of Laiwu City,Laiwu 271100,China
5.College of Plant Protection,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

15 May 2015 accepted 17 July 2015

Three methods(the contact filter paper method,the artificial soil method and the edible fungi residue culture method)were used to study the toxic effects of Cu and Zn onProtaetia brevitarisLewis larvae.The resultsshowed that the concentration of Cu and Zn had no significant effect on the mortality ofP.brevitarislarvae in the contact filter paper method and artificial soil method.In the edible fungi residue culture method,the feeding amount and body growth were significantly inhibited as the concentration of Cu and Zn increased,besides,the feeding inhibition rate and weight growth inhibition rate showed a significantly positive correlation with the concentration of Cu and Zn.The elements(Cu)applied to theP.brevitarislarvae induced the soluble protein content,inhibited the activities of SOD and GST and the content of MDA,and had no significant effects on the activities of CAT. The soluble protein content was significantly induced by 3 500 and 5 000mg·kg-1Zn,while the content of MDA was significantly inhibited.The SOD activities were induced by 2 000 and 6 500mg·kg-1Zn(P＞0.05).The CAT and GST activities showed no significant change with the Zn application.The results indicated that Cu and Zn had an ecotoxicological effect onP.brevitarislarvae.However,to estimate the toxicity of heavy metals with high concentrations toP.brevitarislarvae,except for SOD,CAT and GST as biomarkers,other indicators should be taken into account for a comprehensive analysis.

copper(Cu);zinc(Zn);Protaetia brevitarisLewis larvae;toxic effects

2015-05-15 錄用日期:2015-07-17

1673-5897(2016)1-313-10

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150515003

尹素真,于沖,李光德,等.高Cu、高Zn對(duì)白星花金龜幼蟲的毒性作用[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):313-322

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尹素真(1989-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)學(xué),E-mail:ysz0504@126.com；

),E-mail:lgd107@sdau.edu.cn

簡(jiǎn)介:李光德(1962-)，男，學(xué)士，副教授，主要從事環(huán)境污染的修復(fù)，生態(tài)毒理和污染生態(tài)等方面的研究。