長(zhǎng)期飼喂鈥對(duì)鯉魚非特異性免疫酶活性的影響

吳紅松

菏澤學(xué)院，菏澤274015

長(zhǎng)期飼喂鈥對(duì)鯉魚非特異性免疫酶活性的影響

吳紅松*

菏澤學(xué)院，菏澤274015

以鯉魚為研究對(duì)象,進(jìn)行為期60 d的飼喂試驗(yàn),研究了硝酸鈥對(duì)其非特異性免疫的影響。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)在肝臟中呈先升高后降低的趨勢(shì), SOD、GSH-Px酶活性在20mg·kg-1時(shí),升高顯著(P＜0.05),三者在65mg·kg-1時(shí)都被顯著抑制(P＜0.05)；在腎中都被誘導(dǎo),在65mg·kg-1升高顯著(P＜0.05)。肝腎中丙二醛(MDA)含量都變化不顯著(P＞0.05)。抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基能力和單胺氧化酶(MAO)活性都降低,且在65mg·kg-1時(shí)降低顯著(P＜0.05或P＜0.01)。因此,在飼料中添加稀土元素鈥20、42、65mg·kg-1,能夠影響非特異性免疫力,且鯉魚肝組織比腎臟反應(yīng)更敏感。

鈥；鯉魚；非特異性免疫

鈥屬于鑭系元素中的重稀土類,在地殼中的豐度為1.4×10-6。作為添加劑,廣泛使用于糧食、水果、蔬菜等作物上；應(yīng)用在畜、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖上。但稀土畢竟不是動(dòng)植物的必須元素,在生產(chǎn)養(yǎng)殖上的安全應(yīng)用引起了人們的關(guān)注。

據(jù)報(bào)道,適宜濃度的稀土元素添加給植物,浸種可提高種子的發(fā)芽率[1],噴施甜瓜葉面可提高甜瓜果實(shí)品質(zhì)[2],增強(qiáng)作物抗鹽漬、抗酸雨等脅迫的能力[3-4]。而高濃度添加則可抑制種子的萌發(fā),降低甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì),損傷水稻根系,抑制蠶豆幼苗生長(zhǎng)。適量的稀土添加到飼料中,可以提高鯽魚血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性[5],顯著提高比目魚生長(zhǎng)性能[6],增加虹鱒魚采食量、提高日增重[7],增加火雞體重,降低飼料轉(zhuǎn)化率[8],改善保育期仔豬生長(zhǎng)性能[9],增加灘羊血液中白蛋白、血紅蛋白等的含量,抑制人體癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[10-13]。但高劑量的添加會(huì)降低比目魚免疫力,降低灘羊血液中的有機(jī)成分的含量,損傷小鼠肝、腦細(xì)胞,降低其免疫功能,抑制小鼠精子的質(zhì)量和數(shù)量[14-17]。目前發(fā)現(xiàn),大鼠肝臟是稀土元素主要蓄積器官[18],肉牛的主要蓄積器官為肝、腎和肋骨[19],稀土元素均可以磷酸鹽形式損害機(jī)體細(xì)胞[20]。但關(guān)于單一稀土元素鈥在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的效應(yīng)機(jī)理的研究報(bào)道較少。

本文以硝酸鈥作為飼料添加劑飼喂鯉魚60 d,通過(guò)對(duì)鯉魚肝腎臟內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、單胺氧化酶(MAO)、抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基活性和丙二醛(MDA)含量的研究,從生物化學(xué)角度揭示稀土元素鈥對(duì)鯉魚非特異性免疫酶活性的影響,以期能為稀土在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面安全應(yīng)用,進(jìn)一步機(jī)理研究和安全評(píng)估上,提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

鯉魚,購(gòu)買自菏澤市牡丹區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng),平均體重340.1～436.5 g。硝酸鈥(Johnson Matiney Company提供,分析純)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

實(shí)驗(yàn)前,將硝酸鈥以20、42、65mg·kg-1的含量分別添加到基礎(chǔ)飼料中(參照中國(guó)稀土農(nóng)用網(wǎng)發(fā)布的:魚類飼料中添加的稀土以50mg·kg-1為宜)[21],混勻,顆粒機(jī)成型,再烘干,作為實(shí)驗(yàn)組鯉魚的餌料。實(shí)驗(yàn)期間,鯉魚先在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)2周(馴養(yǎng)期間無(wú)死亡),然后實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組,每組36尾魚,以飼喂基礎(chǔ)飼料的鯉魚作為對(duì)照組,玻璃缸(120×80×60 cm)養(yǎng)殖,水溫16～18℃,充氧過(guò)濾泵供氧(OD＞6mg·L-1),每天8時(shí)和16時(shí)各投喂1次,換水1次,每次換一半。自然光照下飼喂60 d(期間各組魚均未出現(xiàn)死亡)。

1.2.2 酶液的提取

每實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取鯉魚6尾擦干,解剖,分離出肝腎臟。按組織質(zhì)量與0.65%的生理鹽水體積之比為m(g):v(mL)=1:5,勻漿,4℃,4 000 r·min-1,離心15 min,取上清,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活性的測(cè)定

SOD、CAT、GSH-Px、MAO、抗超氧陰離子自由基活性、抑制羥自由基能力和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定,均采用由南京建成生物工程研究所提供試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明操作,利用紫外分光法測(cè)出吸光值,根據(jù)公式計(jì)算出各樣本的酶活和MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPASS軟件,求出平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,并進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD),取顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果(Results)

從圖1可以看出,用含硝酸鈥飼料飼喂60 d后。隨著飼料中硝酸鈥含量的增加,鯉魚肝臟中的CAT活性先升高后降低,與對(duì)照組相比,在20mg·kg-1時(shí),升高不顯著(P＞0.05)；在42、65mg·kg-1時(shí),肝中CAT活性比對(duì)照組極顯著降低(P＜0.01)。但腎臟中的CAT活性卻不斷升高,在20、42mg·kg-1時(shí),升高不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時(shí),腎中CAT活性比對(duì)照組極顯著升高(P＜0.01)。

如圖2所示,隨著飼料中硝酸鈥含量的增加,與對(duì)照組相比,鯉魚肝臟中的SOD活性先升高后降低,在20mg·kg-1時(shí),升高顯著(P＜0.05)；在42、65mg·kg-1時(shí),顯著降低(P＜0.05)。但腎臟中的SOD活性卻不斷升高,在20、42mg·kg-1時(shí),升高不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時(shí),升高顯著(P＜0.05)。

如圖3所示,鯉魚肝臟中的GSH-Px活性隨著硝酸鈥劑量的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,在20mg·kg-1時(shí),受到了顯著的誘導(dǎo)(P＜0.05)；但在42mg·kg-1時(shí),GSH-Px的活性降低,但差異不顯著(P＞0.05)；在65mg·kg-1時(shí),活力顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。但鯉魚腎臟中的GSH-Px活性隨著硝酸鈥劑量的升高而呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì),且在劑量為65mg·kg-1時(shí),與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。

圖1 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎CAT活性的影響注:*表示處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)；**表示處理組與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)。Fig.1 Effect of nitrate holmium on CAT activity in the liver and kidney ofC.carpioNote:*shows significant difference compared with control group(P＜0.05) **shows extremely significant difference compared with control group(P＜0.01).

圖2 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎SOD活性的影響Fig.2 Effect of nitrate holmium on the SOD activity in the liver and kidney ofC.carpio

圖3 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝臟GSH-Px活性的影響Fig.3 Effect of nitrate holmium on the GSH-Px activity in the liver and kidney ofC.carpio

圖4 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎MDA含量的影響Fig.4 Effect of nitrate holmium on the content of MDA in the liver and kidney ofC.carpio

圖5 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎抗超氧陰離子自由基活性的影響Fig.5 Effect of nitrate holmium on the scavenging effect of superoxide anion free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如圖4所示,與對(duì)照組相比,硝酸鈥劑量在20、42、65mg·kg-1時(shí),鯉魚肝、腎臟中MDA含量都有所降低,但與對(duì)照組相比,差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

如圖5所示,在鯉魚肝腎內(nèi)抗超氧陰離子自由基活力隨著硝酸鈥劑量的升高,呈先升高后降低的趨勢(shì),與對(duì)照組相比在20mg·kg-1時(shí),都有所升高,但不顯著(P＞0.05)；在42mg·kg-1時(shí),活力都有所降低,肝臟與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01),而腎臟差異不明顯(P＞0.05)；在65mg·kg-1時(shí),都極顯著降低(P＜0.01)。

圖6 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎抑制羥自由基能力的影響Fig.6 Effect of nitrate holmium on the inhibition of hydroxide free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如圖6所示,與對(duì)照組相比,鯉魚肝、腎臟中抑制羥自由基能力隨著硝酸鈥劑量的升高都呈逐步降低的趨勢(shì),且變化趨勢(shì)一致。抑制羥自由基能力在20mg·kg-1時(shí),肝臟內(nèi)顯著降低,腎臟降低不顯著(P＞0.05)；但在42、65mg·kg-1時(shí),肝腎臟中都呈極顯著降低(P＜0.01)。

圖7 硝酸鈥對(duì)鯉魚肝腎MAO活性的影響Fig.7 Effect of nitrate holmium on the MAO activity in the liver and kidney ofC.carpio

如圖7所示,鯉魚肝腎臟中MAO活力都隨著硝酸鈥劑量的升高而降低,與對(duì)照組相比,在20mg·kg-1時(shí),兩者都差異不顯著(P＞0.05)；在42mg·kg-1時(shí),僅肝臟中差異顯著(P＜0.05),在65mg·kg-1時(shí),腎臟中差異顯著(P＜0.05),肝臟中差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論(Discussion)

田蜜等[22]認(rèn)為輕稀土元素進(jìn)入生物體后主要累積于肝臟。Shinohara等[23]報(bào)道了鈥、鈰、鑭等12種稀土元素進(jìn)入小鼠后主要分布在肝、腎等組織。崔麗卿等[24]認(rèn)為稀土離子半徑較小,表現(xiàn)為硬酸性,容易與作為硬堿的氧結(jié)合,可以通過(guò)此機(jī)制清除活性氧?；钚匝醯臄?shù)量與殺菌力存在相關(guān)性,是反映非特異性免疫能力的一項(xiàng)指標(biāo)。申治國(guó)等[25]通過(guò)研究在0.01～0.5 mmol·L-1濃度下鈰對(duì)正常肝細(xì)胞和V79細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響,為低濃度稀土能清除機(jī)體內(nèi)自由基提供了直接的依據(jù)。本文用含硝酸鈥飼料飼喂鯉魚60 d后,與對(duì)照組相比,鯉魚肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均隨飼喂劑量升高呈現(xiàn)低促高抑的特點(diǎn),在飼料中硝酸鈥含量為20mg·kg-1時(shí),CAT活力升高不顯著,SOD、GSH-Px均升高顯著；在42mg·kg-1時(shí),CAT、SOD顯著降低,GSH-Px降低不顯著；在65mg·kg-1時(shí),3種酶與對(duì)照組相比均顯著降低。這與汪承潤(rùn)等[26]用鈥溶液給小鼠腹腔注射染毒后現(xiàn)象一致,發(fā)現(xiàn)SOD,POD和CAT 3種抗氧化酶活力在10～40mg·kg-1劑量范圍內(nèi),3種酶活力均隨劑量的增加而升高；在40～60mg·kg-1劑量范圍內(nèi),3種酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì),表現(xiàn)出“低促高抑”的效應(yīng)的結(jié)果一致。同時(shí)也與廖紅艷等[27]發(fā)現(xiàn)的低劑量的鑭對(duì)小鼠肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性表現(xiàn)出激活作用,高劑量表現(xiàn)出抑制作用的結(jié)果相一致。郝述霞等[28]研究發(fā)現(xiàn),低劑量稀土可抑制過(guò)氧化,高劑量可促進(jìn)過(guò)氧化。劉穎等[29]以“長(zhǎng)樂(lè)”和La(NO3)3灌大鼠胃6個(gè)月后也發(fā)現(xiàn),低劑量均能抑制自由基的產(chǎn)生,提高肝組織中SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。腎臟中 CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趨勢(shì),在65mg·kg-1時(shí)升至最大,且均與對(duì)照組相比差異顯著?？梢?與腎臟中酶活性相比,肝臟對(duì)硝酸鈥劑量的增加更加敏感。這與黃可欣等[30]給昆明小鼠胃灌La(NO3)3后腎臟中GSH-Px較對(duì)照組顯著升高相似。這可能是由于鈥離子與鯉魚肝腎組織內(nèi)過(guò)氧化物的配位結(jié)合阻止了自由基的生成,也可能是鈥離子通過(guò)與生物體內(nèi)氧自由基的磁相互作用掩蔽自由基阻止單電子傳遞[31]?？梢?稀土的抗氧化作用是通過(guò)其與自由基的相互作用以及增強(qiáng)抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

環(huán)境脅迫誘發(fā)的活性氧自由基傷害生物膜的過(guò)程中,最重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物是MDA,它是一種高活性的脂質(zhì)過(guò)氧化物,能交聯(lián)脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì),也可使蛋白質(zhì)的SH基氧化。在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),與對(duì)照組相比,鯉魚肝腎中MDA含量均差異不顯著。與鞏菊芳等[32]發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)期飲用不同劑量三硝酸鈥溶液對(duì)大鼠肝、腎中MDA含量無(wú)明顯變化的結(jié)果一致。這表明在20～65mg·kg-1劑量范圍內(nèi),不會(huì)使鯉魚肝腎細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,可能是由于鈥離子結(jié)合細(xì)胞膜,使其免受了自由基的氧化作用。這與劉湘陶等[33-34]研究的多種稀土離子對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化有較強(qiáng)的抑制作用的結(jié)果相似。

生物體內(nèi)的氧自由基通過(guò)酶促反應(yīng),膜電子傳遞泄露,自動(dòng)氧化不斷產(chǎn)生包括超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫等,其中最主要、最具破壞性的也最具破壞性的是羥自由基。實(shí)驗(yàn)中鯉魚抗超氧陰離子自由基能力,與對(duì)照組相比,均在劑量為20mg·kg-1時(shí)有所升高,在42mg·kg-1時(shí),肝臟呈極顯著降低,而腎臟降低不明顯；在65mg·kg-1時(shí),肝腎內(nèi)均降低極顯著。肝腎中抑制羥自由基能力,隨著飼料中硝酸鈥含量的增加而顯著降低,且與對(duì)照組相比,在42、65mg·kg-1時(shí),都下降極顯著?？赡苁氢€離子清除鯉魚體內(nèi)多余的OH-,O2-自由基,使肝腎細(xì)胞中抗超氧陰離子自由基、抑制羥自由基能力降低。肝腎中抗超氧陰離子自由基能力沒(méi)有抑制羥自由基能力的降低的顯著,可能與鈥離子與不同自由基的相互作用強(qiáng)弱有關(guān)。

單胺氧化酶(MAO)是一類黃素酶,廣泛分布于生物體內(nèi)各組織器官,尤以肝、腎等組織內(nèi)含量最多,主要參與生物源氨代謝,能夠催化多種結(jié)構(gòu)的胺類[35]。MAO變化可提示機(jī)體肝腎組織的損傷,尤其肝受損時(shí)MAO活性明顯升高。本文鯉魚肝臟中MAO在劑量為20mg·kg-1時(shí),升高不顯著；在劑量為42mg·kg-1時(shí),顯著降低,在65mg·kg-1時(shí),降低極顯著。而鯉魚腎臟中MAO隨鈥濃度升高而不斷降低,在劑量為65mg·kg-1時(shí),降低顯著,表現(xiàn)出一定的組織差異性?？梢?一定濃度的鈥離子可能通過(guò)與自由基相互作用,降低了機(jī)體中MAO活性,從而減少胺代謝產(chǎn)物對(duì)肝腎組織的損傷作用。

綜上所述,在添加劑量范圍內(nèi),飼料中添加的硝酸鈥影響了鯉魚非特異性免疫力的酶活性。隨飼喂劑量升高,肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均呈現(xiàn)低促高抑的特點(diǎn),腎中的CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趨勢(shì),抗超氧陰離子自由基能力、抑制羥自由基能力在肝腎中均顯著降低。一定劑量鈥離子具有清除自由基能力,且表現(xiàn)出一定組織差異性,相同劑量下,肝比腎更為敏感[36]。肝腎中MDA含量都變化不顯著,MAO活性的降低,表明添加劑量范圍內(nèi)的硝酸鈥,不會(huì)對(duì)肝腎細(xì)胞膜造成脂質(zhì)過(guò)氧化等組織損傷。稀土元素的這種影響機(jī)制究竟是什么,還有待進(jìn)一步深入研究。

致謝:本文得到了山東省菏澤學(xué)院張貴生副教授、朱道玉教授等的辛苦協(xié)助，在此表示感謝。

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Effect of Holmium on the Activities of Nonspecific Immune Enzymes in Cyprinus carpio

Wu Hongsong*
Heze University,Heze 274015,China

5 November 2015 accepted 24 December 2015

In order to investigate the effects of nitrate holmium on innate immune response ofCyprinus carpio(C. carpio),a 60-day period of feeding trial was conducted.The result showed that,with the increasing of nitrate holmium,the activities of catalase(CAT),the superoxide dismutase(SOD)and the glutathione peroxidase(GSH-Px)in the liver were all increased first and then decreased.In the liver,the activities of SOD and GSH-Px were induced significantly when the concentration of nitrate holmium was 20mg·kg-1(P＜0.05),while the three enzymes mentioned above were significantly inhibited in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05).Additionally, the activities of the three enzymes in the kidney were all induced remarkably when the dose of nitrate holmium was 65mg·kg-1(P＜0.05).Both in the liver and kidney,the malonaldehyde(MDA)appeared little changes(P＞0.05)in the range of experimental concentrations.The activities of monoamine oxidase(MAO),the scavenging effects of hydroxyl and the superoxide anion free radical in the liver and kidney were all decreased,especially in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05 orP＜0.01).These results suggested that the addition of rare-earthelement holmium to the feed could significantly affect the immunity ofC.Carpio in the range of experimental concentrations and the liver was more sensitive to holmium than the kidney.

cerium;C.carpio;innate immunity

2015-11-05 錄用日期:2015-12-24

1673-5897(2016)1-375-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151105002

吳紅松.長(zhǎng)期飼喂鈥對(duì)鯉魚非特異性免疫酶活性的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):375-381

Wu H S.Effect of holmium on the activities of nonspecific immune enzymes inCyprinus carpio[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):375-381(in Chinese)

山東省教育廳科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(J08LF54)；山東省動(dòng)物生理生化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助

),E-mail:hellowhs@163.com

簡(jiǎn)介:吳紅松(1977-)，女，山東省菏澤市人，碩士，講師，研究方向?yàn)閯?dòng)物學(xué)。