丙烯酰胺對(duì)斑馬魚(yú)各器官的毒性作用及生殖細(xì)胞的DNA損傷

曹秀明,羅飛,*,樊宇

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076

2.上海羅氏制藥有限公司，上海200000

丙烯酰胺對(duì)斑馬魚(yú)各器官的毒性作用及生殖細(xì)胞的DNA損傷

曹秀明1,羅飛1,*,樊宇2

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076

2.上海羅氏制藥有限公司，上海200000

在我國(guó),聚丙烯酰胺(PAM)主要應(yīng)用于石油開(kāi)采,其長(zhǎng)期暴露于環(huán)境中可以降解成有毒的丙烯酰胺(AM)。為探究在降解過(guò)程中AM的毒性作用,選擇斑馬魚(yú)作為受試動(dòng)物,進(jìn)行AM長(zhǎng)期毒性暴露40 d,考察了對(duì)斑馬魚(yú)的肝臟、腦組織、心臟、腮等器官的影響情況。結(jié)果表明:在2.04mg·L-1、6.12mg·L-1和18.36mg·L-1暴露濃度下,形態(tài)學(xué)觀察斑馬魚(yú)的鰓絲,鰓小片和鰓細(xì)胞有嚴(yán)重的受損現(xiàn)象；隨著濃度的升高斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量、LDH活力的升高,SDH和Na+-K+-ATPase活力的降低,均對(duì)其肝臟、腦組織和心臟造成氧化損傷作用,從而影響了斑馬魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞能量代謝過(guò)程。采用彗星試驗(yàn)檢測(cè)斑馬魚(yú)的生殖腺細(xì)胞DNA損傷,結(jié)果顯示暴露于濃度為2.04mg·L-1～18.36mg·L-1的AM后,斑馬魚(yú)的DNA損傷均表現(xiàn)為顯著差異(P＜0.01)。上述研究結(jié)果均確定了AM對(duì)斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng)并可造成其生殖腺細(xì)胞的DNA損傷。

丙烯酰胺；斑馬魚(yú)；氧化損傷；DNA損傷

目前,在石油開(kāi)采過(guò)程中主要應(yīng)用聚丙烯酰胺(PAM)來(lái)調(diào)節(jié)絮凝劑的絮凝、增稠和對(duì)流體流變性,它是由AM均聚或與其他單體共聚而成,含50%以上的線性及水溶性高分子化學(xué)產(chǎn)品的總稱[1-4]。但在生產(chǎn)使用過(guò)程中,PAM難免會(huì)發(fā)生一系列的降解,對(duì)其性能產(chǎn)生影響,社會(huì)各界對(duì)其極為關(guān)注。在自然條件下,PAM會(huì)發(fā)生緩慢的物理降解(熱、機(jī)械)、化學(xué)降解(水解、氧化以及催化氧化)和生物降解,最終生成各種低聚物以及具有劇毒的AM單體[5]。如果直接將含有PAM的污水排放,將在環(huán)境中逐漸積累,危害環(huán)境[6]。AM可對(duì)生殖、皮膚、消化道、肌肉、神經(jīng)組織產(chǎn)生毒性[7],其致癌性已引起世界衛(wèi)生組織(WHO)和國(guó)際糧農(nóng)組織(FAO)的關(guān)注,國(guó)際癌癥研究中心(IARC)將AM列為“可能人類致癌物”。但是關(guān)于AM和PAM的廣泛使用對(duì)環(huán)境尤其是水生態(tài)環(huán)境影響的研究較少,本文將斑馬魚(yú)長(zhǎng)期暴露于PAM的單體AM中,研究AM對(duì)斑馬魚(yú)體的毒性作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:解剖鏡XTL-2400(北京福凱儀器有限公司)；FA1004分析天平(上海上平儀器有限公司)；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)；Anke TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)(Beckman-Coulter公司)；SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；S3400N型掃描電鏡(日本日立公司)；H7650型透射電鏡(日本日立公司)；MX-E型小型固定式混勻儀(BIOSHARP公司)；磁力攪拌器(上海一科儀器設(shè)備有限公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

試劑:丙烯酰胺購(gòu)自BIOSHARP公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；丙二醛測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、琥珀酸脫氫酶試劑盒、鈉鉀ATP酶試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；冰乙酸購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；Tris購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；肌氨酸鈉購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司；二甲基亞砜購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；TritonX-100購(gòu)自天津富德士科技有限公司；正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自北京白晶生物技術(shù)有限公司；溴化乙錠購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；戊二醛購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)館電鏡室。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú),購(gòu)于哈爾濱市香坊區(qū)花卉大市場(chǎng),雌雄不限,發(fā)育良好。實(shí)驗(yàn)前先馴養(yǎng)7 d,每天定時(shí)定量喂食2次,水溫約25℃,光暗比例14 h:10 h。實(shí)驗(yàn)用水采用人工曝氣48 h的自來(lái)水,并確保水質(zhì)符合OECD實(shí)驗(yàn)要求[6]。每天早上清理魚(yú)缸內(nèi)的排泄物和其他雜質(zhì),在此期間死亡率不得超過(guò)5%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在預(yù)馴養(yǎng)1周后的斑馬魚(yú)中選取平均體重為(0.42±0.05)g,平均體長(zhǎng)為(3.67±0.50)cm進(jìn)行AM暴露處理。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì) 1/45LC50、1/15LC50、1/ 5LC503個(gè)劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(其中低劑量組為2.04mg·L-1、中劑量組為6.12mg·L-1、高劑量組為18.36mg·L-1),并設(shè)置空白對(duì)照組。在體積為20 L的玻璃魚(yú)缸中分別配置上述濃度的試液14 L,每組20條,雌雄平均,隔天換去一半水,空白組條件一樣,每天清理缸內(nèi)雜質(zhì)和排泄物,其余條件與馴養(yǎng)期間相同,40 d后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 魚(yú)鰓的組織形態(tài)學(xué)觀察

暴露時(shí)間結(jié)束后,分別從各給毒組和對(duì)照組中隨機(jī)抽取5條斑馬魚(yú)(雌雄不限),麻醉處理后立即解剖,各組斑馬魚(yú)解剖摘取單片的魚(yú)鰓,每條魚(yú)摘取完整無(wú)損的魚(yú)鰓1～2片即可。摘下魚(yú)鰓后迅速用適量PBS緩沖液沖洗掉鰓片表面的粘液,然后再用適量的胰酶沖洗鰓片2次,每次大約間隔30 s,目的是消化掉鰓片表面附著的組織和細(xì)胞以便于電鏡下觀察。最后再用PBS清洗2次后將魚(yú)鰓放入1.5 mL EP管中,在EP管中加入適量(沒(méi)過(guò)鰓片即可)戊二醛,在4℃條件下固定24 h后送哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)館電鏡室,做掃描電鏡和透射電鏡觀察成像。

1.3.2 MDA含量、LDH、SDH、Na+-K+-ATPase酶活性測(cè)定

暴露時(shí)間結(jié)束后,分別從各給毒組和對(duì)照組中隨機(jī)抽取10條斑馬魚(yú)(雌雄不限),麻醉處理后立即解剖,分別取出肝臟、腦組織、心臟,3種組織器官,用生理鹽水洗凈,相同的組織器官放在一起稱重,稱重后的組織器官分為分兩部分,將其制成含量分別為10%和0.2%的組織勻漿液。用移液器分別吸取等量組織勻漿液和PBS緩沖液進(jìn)行配平,4℃, 12 000 r·min-1條件下離心15 min。取10%的組織與勻漿上清液用于蛋白、丙二醛(MDA)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)含量的測(cè)定；0.2%的組織勻漿液用于乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定。以上嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行操作。

1.3.3生殖腺細(xì)胞的DNA損傷分析

從對(duì)照組和3個(gè)暴露濃度組中取出的雌性斑馬魚(yú)放置在碎冰上麻醉處死。然后在解剖鏡下解剖取出生殖腺,取0.25%胰酶100μL,將生殖腺?zèng)_入EP管中,將其混勻1 min,放入37℃的水浴鍋中5 min,取少量混懸液在顯微鏡下觀察,大部分組織已消化成單細(xì)胞即可終止消化。過(guò)濾混懸液,細(xì)胞懸液3 000 r·min-1、離心10 min,去上清,吸取100μL PBS緩沖液加入管內(nèi)反復(fù)吹打沉淀直至均勻混懸于PBS緩沖液中,得到斑馬魚(yú)生殖腺細(xì)胞懸液。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106～108個(gè)·mL-1,放入冰盒中保存。將雙層膠的載玻片放入表面皿中,倒入細(xì)胞裂解液,避光置于4℃冰箱中。1.5 h后將其取出,放置在電泳儀的陽(yáng)極附近,緩緩加入電泳緩沖液至淹沒(méi)玻片膠層,同時(shí)防止氣泡產(chǎn)生,避光靜置30 min。解旋后,電泳儀調(diào)至25 V、300 mA,15 min。取出載玻片,用PBS避光沖洗3次,每次5 min。用濾紙吸去余液后進(jìn)行EB染色,避光染色15 min后用雙蒸水反復(fù)沖洗3遍,吸去多余水分。在熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長(zhǎng)為515～560 nm。

2 結(jié)果(Results)

2.1 魚(yú)鰓的組織形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示,圖1a鰓絲結(jié)構(gòu)清晰,完整,無(wú)粘連；圖1b鰓小片結(jié)構(gòu)清晰,上皮及基底膜完整,柱狀細(xì)胞排列整齊；圖1c鰓絲結(jié)構(gòu)尚清晰,局部有粘連；圖1d鰓小片結(jié)構(gòu)尚清晰,上皮及基底膜部分缺失,柱狀細(xì)胞排列不整齊,個(gè)別細(xì)胞有腫大現(xiàn)象；圖1e鰓絲粘連,結(jié)構(gòu)不完整,局部有塌陷；圖1f鰓小片結(jié)構(gòu)不完整,上皮及基底膜全部缺失,柱狀細(xì)胞腫大,排列不整齊；圖1g鰓絲結(jié)構(gòu)不完整,大部分鰓絲塌陷,粘連；圖1h鰓小片結(jié)構(gòu)不完整,上皮及基底膜徹底缺失,柱狀細(xì)胞排列雜亂,細(xì)胞腫大,局部細(xì)胞有脫落。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度AM暴露對(duì)斑馬魚(yú)鰓造成不同程度的損傷。損傷程度隨暴露濃度升高而加重,既有鰓絲和鰓小片組織結(jié)構(gòu)的損傷也有鰓細(xì)胞的損傷,1/45LC50濃度時(shí)斑馬魚(yú)鰓的組織結(jié)構(gòu)局部被破壞,鰓絲有粘連現(xiàn)象,鰓細(xì)胞結(jié)構(gòu)也發(fā)生一定的變化,柱狀細(xì)胞腫大,排列不整齊等；當(dāng)濃度達(dá)到1/5LC50時(shí)斑馬魚(yú)鰓絲和鰓小片的組織結(jié)構(gòu)基本被完全破壞,局部鰓細(xì)胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。

圖1 對(duì)照組和各丙烯酰胺(AM)暴露組斑馬魚(yú)鰓掃描電鏡和透射電鏡圖像Fig.1 Scanning electron and transmission electron microscope of zebrafish gill in control and acrylamide(AM)exposure groups

2.2 對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中細(xì)胞的氧化損傷及能量代謝酶的影響

2.2.1 AM長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量的影響

AM長(zhǎng)期暴露下斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,1/45LC50暴露濃度的斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟MDA含量無(wú)顯著性差異,1/15LC50暴露濃度的斑馬魚(yú)肝臟和心臟MDA含量升高顯著,且腦組織中MDA含量升高顯著,1/5LC50暴露濃度的斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量升高顯著。暴露濃度斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量隨著AM暴露濃度升高而增大。

表1 AM對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中MDA含量的影響(x—±s,n=10)Table 1 Effect of AM on zebrafish MDA content in liver,brain and heart(x—±s,n=10)

2.2.2 乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響

圖2結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期暴露于AM后各個(gè)暴露濃度組的斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中LDH活性均顯著升高,LDH活性隨著AM暴露濃度增大而升高。

圖2 AM長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟乳酸脫氫酶(LDH)酶活性影響注:**P＜0.01。Fig.2 The effects of AM lone-term exposure on lactate dehydrogenase(LDH)activities of the liver,brain and heart of zebrafishNote:** P＜0.01 vs Control.

2.2.3 琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響

圖3表明與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期暴露于AM后各個(gè)暴露濃度組的斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中SDH活力顯著降低。SDH活力隨著AM暴露濃度增大而降低。

2.2.4 鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)活力的影響

圖4表明與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期暴露于AM后各個(gè)暴露濃度組中斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中Na+-K+-ATPase活力顯著降低。Na+-K+-ATPase活力隨著AM暴露濃度的增大而降低。

圖3 AM長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活性影響注:與對(duì)照組相比,**P＜0.01。Fig.3 The effects of AM lone-term exposure on synchronous digital hierarchy(SDH)activities of the liver,brain and heart of zebrafishNote:**P＜0.01 vs Control.

圖4 AM長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟Na＋-K＋-ATPase酶活性影響注:與對(duì)照組相比,**P＜0.01。Fig.4 The effects of AM lone-term exposure on Na+-K+-ATPase activities of the liver,brain and heart of zebrafishNote:** P＜0.01 vs Control.

結(jié)果表明:在40 d的長(zhǎng)期毒性暴露后,與對(duì)照組相比3個(gè)暴露濃度組斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中LDH活性均出現(xiàn)顯著升高,SDH和Na+-K+-ATPase活力均出現(xiàn)顯著降低。LDH活性隨著AM暴露濃的增大而升高,SDH和Na+-K+-ATPase活力隨著AM暴露濃度的增大而降低。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明一定濃度的AM長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織和心臟中細(xì)胞能量代謝相關(guān)的酶活性與對(duì)照組相比有顯著影響,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 生殖腺細(xì)胞的DNA損傷分析

結(jié)果顯示:不同濃度AM處理下,雌性斑馬魚(yú)生殖腺細(xì)胞SCGE結(jié)果如圖5所示。圖5a為對(duì)照組；圖5b-d,可以明顯看到細(xì)胞受損,經(jīng)電泳后DNA斷裂離開(kāi)核DNA,產(chǎn)生像彗星一樣的圖像。且隨著染毒濃度的增加,細(xì)胞核逐漸變得疏松,體積逐漸變大, DNA的遷移量逐漸增加。當(dāng)濃度增加到1/5LC50時(shí),大部分DNA遷移出了細(xì)胞核,使細(xì)胞核成為一個(gè)鏤空的組織,表明AM長(zhǎng)期暴露處理能后引起DNA損傷。

圖5 AM長(zhǎng)期暴露下斑馬魚(yú)生殖腺細(xì)胞DNA的彗星圖像(400×)Fig.5 DNA comet images of zebrafish germen cells after AM lone-term exposure(400×)

表2 AM對(duì)生殖腺細(xì)胞DNA的損傷(x—±s，n=50)Table 2 DNA damages of gonad cells induced by AM(x—±s,n=50)

3 討論(Discussion)

鰓是斑馬魚(yú)的基本呼吸器官,像肺一樣,鰓有巨大的表面積以供呼吸,也是溶解性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行交換的重要場(chǎng)所。AM的長(zhǎng)期暴露下,觀察到斑馬魚(yú)鰓已造成了嚴(yán)重的損傷,導(dǎo)致了其呼吸系統(tǒng)的損害以及對(duì)自身的保護(hù)作用降低。鰓小片上皮細(xì)胞腫大降低了鰓與外界進(jìn)行氣體交換的效率,導(dǎo)致鰓吸收氧的能力下降,氧攝取量的不足還將影響機(jī)體的代謝活動(dòng)。初步揭示了AM對(duì)腮造成了影響。

一般生物體暴露在污染環(huán)境中,毒物會(huì)通過(guò)很多途徑進(jìn)入生物體體內(nèi),先經(jīng)過(guò)一系列氧化、還原、水解或結(jié)合等生物化學(xué)反應(yīng)后被代謝成無(wú)毒或低毒代謝物而逐漸排出體外,此外,毒物也可能轉(zhuǎn)化成更毒的代謝物作用于不同的靶器官。其次毒物或活性代謝物與受體進(jìn)行還原反應(yīng),使受體性質(zhì)發(fā)生改變,隨后引起生物化學(xué)反應(yīng),如酶活性誘導(dǎo)或抑制、細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)合成受阻等；最后將會(huì)引起一系列病理生理的繼發(fā)反應(yīng),表現(xiàn)整個(gè)生物機(jī)體可能觀察到的毒性反應(yīng)[8]。

MDA是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸形成的產(chǎn)物,同時(shí)也可以與蛋白質(zhì)的游離氨基作用,引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞損傷。正常生理狀態(tài)下,生物體內(nèi)的MDA含量很低,其含量的高低可以反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度[9]。在AM暴露下,斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟中的MDA含量均隨濃度升高,說(shuō)明高濃度的外源污染物導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)剩氧自由基,斑馬魚(yú)機(jī)體的抗氧能力有限,過(guò)剩的氧自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用,形成脂質(zhì)過(guò)氧化物,MDA含量隨濃度的增加而增加,說(shuō)明高濃度的外源污染物對(duì)機(jī)體的氧化損傷在進(jìn)一步加重。

LDH是糖酵解過(guò)程中一種重要的酶,主要分布于胞質(zhì)內(nèi),參與糖的有氧氧化和無(wú)氧酵解。任何原因引起的細(xì)胞損傷均可導(dǎo)致乳酸脫氫酶溢出,引起乳酸脫氫酶活力增加[10]。在AM暴露下,斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟中的LDH活性呈上升趨勢(shì),這主要可能是由于AM在斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟中的積累導(dǎo)致AM對(duì)其細(xì)胞造成了一定的損傷,且AM質(zhì)量濃度越大對(duì)其細(xì)胞造成的損傷越強(qiáng)烈,從而使LDH活性升高,且AM質(zhì)量濃度越大LDH活性升高程度越大。SDH作為參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一,其活性一般可作為評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)[11]。在AM暴露下,斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟中的SDH活性呈下降趨勢(shì),這可能使氫受體FAD與電子的結(jié)合受到阻滯,從而阻礙FADH2的生成,導(dǎo)致FADH2與酶不能完全結(jié)合,最終造成FADH2傳遞給酶中Fe3＋的電子數(shù)量減少。位于細(xì)胞膜上的鈉鉀ATP酶,促進(jìn)鈉與鉀離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。此酶的作用有矢量性,每水解一分子ATP催化3個(gè)Na+流出和2個(gè)K+流入,利用ATP水解把Na+泵出,而把K+泵入細(xì)胞。存在于動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上,是維持細(xì)胞膜電位的重要蛋白質(zhì)[12]。在AM暴露下,斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟中的Na+-K+-ATPase活性呈下降趨勢(shì),其原因主要可能由于AM在斑馬魚(yú)肝臟和腮中的積累,破壞了細(xì)胞膜上的離子平衡,使生物膜功能遭到破壞,導(dǎo)致機(jī)體抗自由基的防御能力減弱,影響了Na+-K+-ATPase活性中心的某些基團(tuán)的解離,酶活性中心的親核催化作用也受到影響,從而導(dǎo)致Na+-K+-ATPase酶活力降低。LDH含量的升高、SDH和Na+-K+-ATPase含量的降低進(jìn)一步說(shuō)明了AM對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腦組織、心臟造成了氧化損傷。

在環(huán)境監(jiān)測(cè)中,彗星實(shí)驗(yàn)主要用于水環(huán)境污染的生物監(jiān)測(cè)和污染治理效果的生物評(píng)價(jià)[13]。細(xì)胞在正常狀態(tài)下,經(jīng)過(guò)細(xì)胞裂解液裂解后,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞中的RNA、蛋白質(zhì)等會(huì)進(jìn)入到凝膠中,電泳結(jié)束后,細(xì)胞核中的DNA會(huì)保持在原來(lái)的位置,染色后在熒光顯微鏡下,會(huì)呈現(xiàn)圓形狀。如果細(xì)胞DNA受到了損傷,形成DNA碎片,在SCGE過(guò)程中, DNA碎片會(huì)進(jìn)入到凝膠中,在電泳時(shí)DNA碎片會(huì)形成拖尾,染色后會(huì)呈現(xiàn)出彗星狀,彗星的尾長(zhǎng)、尾部DNA含量以及尾矩越大,表示細(xì)胞DNA受損情況越嚴(yán)重[14]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)測(cè)定了AM對(duì)斑馬魚(yú)生殖腺DNA損傷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)AM劑量高于1/45LC50(2.04mg·L-1)時(shí),會(huì)使斑馬生殖腺細(xì)胞中的DNA鏈斷裂并產(chǎn)生DNA不同程度的碎片,彗星拖尾長(zhǎng)度、尾矩值均隨之增加,從而導(dǎo)致DNA損傷,并且隨著AM劑量增加到1/15LC50(6. 12mg·L-1)和1/5LC50(18.36mg·L-1)時(shí),DNA損傷隨之增加。

氧化損傷過(guò)程中產(chǎn)生的自由基(包括活性氧),可使細(xì)胞產(chǎn)生DNA斷裂、堿基互換、姐妹染色體交換、染色體基因突變等遺傳毒理學(xué)效應(yīng),甚至還造成蛋白裂解、機(jī)體離子損失等,以上過(guò)程是機(jī)體遺傳突變、癌變過(guò)程中的重要事件,因此氧化損傷所導(dǎo)致的DNA損傷效應(yīng)被認(rèn)為是啟動(dòng)和促進(jìn)人和動(dòng)物機(jī)體發(fā)生癌變的重要因素之一[15]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,在外來(lái)污染物影響下,MDA、LDH、SDH、Na+-K+-ATPase在斑馬魚(yú)體內(nèi)協(xié)同作用下,在逆境脅迫中保護(hù)機(jī)體免于受損,但是由于AM的毒性作用,還是造成了一定程度上DNA的損傷和氧化損傷。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)選取的5項(xiàng)指標(biāo)之間的關(guān)系能夠?qū)ρ芯緼M對(duì)生物機(jī)體的毒性機(jī)制提供一個(gè)基本的理論支撐。

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Toxic Effects of Acrylamide on Zebrafish Organs and DNA Damage of Germ Cell

Cao Xiuming1,Luo Fei1,*,Fan Yu2
1.Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China
2.Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd.,Shanghai 200000,China

20 November 2015 accepted 19 February 2016

Polyacrylamide(PAM)is widely utilized in oil production in China.It may degrade into toxic acrylamide(AM)after long-term environmental exposure.This study was initiated to enhance our insight into the aquatic environmental impact of AM.Zebrafish were exposed to AM for 40 d to examine its toxic effect on gill,liver, brain,heart and DNA in germ cells.The results showed that the gill filaments and gill cells were damaged seriously in the 2.04,6.12 and 18.36mg·L-1exposure concentration.With the concentration increased zebrafish liver,brain and heart MDA content and LDH activity increased,and the activity of SDH and Na+-K+-ATPase reduced.Comet Assay showed that AM induced DNA damage in germ cells,indicating a statistically significant difference(P＜0.01) in the 2.04 to 18.36mg·L-1exposure concentration.These results suggest that AM induce a does-dependent toxici-ty effect on organs of zebrafish and DNA damage in their gonads.

acrylamide;zebra fish;oxidative damage;DNA damage

2015-11-20 錄用日期:2016-02-19

1673-5897(2016)1-382-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151120001

曹秀明,羅飛,樊宇.丙烯酰胺對(duì)斑馬魚(yú)各器官的毒性作用及生殖細(xì)胞的DNA損傷[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):382-388

Cao X M,Luo F,Fan Y.Toxic effects of acrylamide on zebrafish organs and DNA damage of germ cell[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1): 382-388(in Chinese)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201123):有機(jī)絮凝劑聚丙烯酰胺及其單體丙烯酰胺的水生態(tài)毒理學(xué)研究

曹秀明(1964-),女,副研究員,博士,研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué),E-mail:caoxiuming_smzx@163.com；

),E-mail:fifi_only@qq.com

簡(jiǎn)介:曹秀明(1964-)，女，副研究員，博士，研究方向生態(tài)毒理學(xué)。