溫陽法對肝癌免疫微環(huán)境的影響

蔡之幸，陳 越

(上海交通大學(xué)附屬同仁醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200336)

原發(fā)性肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率高居世界腫瘤病死率的第3位[1]。其中肝細(xì)胞肝癌是最常見的原發(fā)性肝癌。目前認(rèn)為，肝細(xì)胞肝癌并不是單純由肝癌細(xì)胞構(gòu)成，還包括多種彼此相互作用的細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)所形成的存在復(fù)雜交匯網(wǎng)絡(luò)的肝癌微環(huán)境。肝癌微環(huán)境可從多方面決定肝癌的表型[2]。研究肝細(xì)胞肝癌的微環(huán)境，可能有助于預(yù)測肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的特定表型，這對找到新的抗癌策略至關(guān)重要。

肝癌常歸屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“鼓脹”“黃疸”“水腫”“積聚”等范疇[3]。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就提出了腫瘤形成與陽氣不足、陰寒凝滯的關(guān)系。《靈樞·百病始生》云：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣?！瓬貧獠恍校N(yùn)里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣?！敝赋瞿[瘤形成的根本原因在于陽氣不足、寒濕過盛[4]?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》有“陽化氣，陰成形”的理論。而腫瘤的發(fā)生是有形蓄積的過程，即“陰成形”的過程，其原因?yàn)椤瓣柣瘹狻钡墓δ苁д{(diào)[5]。筆者將著重探討溫陽法對肝癌免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。

1 與肝癌有關(guān)的免疫微環(huán)境

對肝癌的研究離不開肝癌所處的免疫微環(huán)境，因?yàn)楦闻K本身就是一個(gè)特殊的免疫器官。肝臟中存在有免疫相關(guān)細(xì)胞，包括抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)、髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)、淋巴細(xì)胞等，肝中APC包括肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)、肝巨噬細(xì)胞、肝樹突狀細(xì)胞等。肝臟中APC吞噬清除抗原后，會(huì)限制適應(yīng)性免疫的活化，抑制效應(yīng)細(xì)胞的分化成熟，同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群的增殖[6]。

1.1 相關(guān)免疫細(xì)胞 LSECs是一群包圍在肝細(xì)胞周圍的高度特化的內(nèi)皮細(xì)胞。在抗原性物質(zhì)處于較低水平時(shí)，LESCs會(huì)與CD8+T細(xì)胞相互作用，從而降低肝細(xì)胞表面的共刺激因子B7-1和B7-2的表達(dá)，同時(shí)升高共抑制因子程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)/PD-L2的表達(dá)[7]。LESCs還能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化成免疫抑制性的細(xì)胞[8]。肝巨噬細(xì)胞是全身單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)重要的組成部分，生理?xiàng)l件下肝巨噬細(xì)胞能通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖活化，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)分化來抑制免疫活化[9]。而處于炎性狀態(tài)下，肝巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)將被打破。腫瘤浸潤性樹突細(xì)胞一方面可誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫，另一方面也能誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，其過程與PD-L1有關(guān)[10-11]。肝癌微環(huán)境中一個(gè)關(guān)鍵組成部分為MDSCs，它代表未成熟骨髓細(xì)胞的異質(zhì)群體，在分化的不同階段停滯，并響應(yīng)各種腫瘤因子而擴(kuò)增肝中MDSCs，具有顯著抑制免疫應(yīng)答的能力[12]。MDSCs可由腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-10、血管內(nèi)皮生長因子。其主要通過對T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的抑制，以及對Treg的激活，誘發(fā)機(jī)體的“免疫逃逸”[13]。

1.2 相關(guān)免疫因子 IL-10是重要的免疫抑制因子，其與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)共同激活B7-H1的表達(dá)，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸[14]。IL-17是一種主要由CD4+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等分泌的前炎性細(xì)胞因子[15]。CD4+T淋巴細(xì)胞可分成Th1、Th2、Treg和Th17四大亞群，其中Th17能分泌IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子。炎性因子IL-17在MDSCs形成的免疫耐受過程中起到重要作用，近年來不斷受到研究者的重視。IL-17受體缺失抑制了MDSCs的浸潤，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的浸潤，MDSCs來源的IL-17因子又能驅(qū)化Treg到達(dá)腫瘤部位，增強(qiáng)其免疫抑制功能。MDSCs誘發(fā)的免疫逃逸主要集中在MDSCs對T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的抑制，以及對Treg的激活，與其聯(lián)合抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17介導(dǎo)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移主要通過激活JAK2/STAT3信號通路而發(fā)揮作用[16]，調(diào)控肝癌細(xì)胞p53表達(dá)進(jìn)而下調(diào)化學(xué)治療誘導(dǎo)的凋亡敏感性[15]。作為腫瘤免疫逃逸的主要調(diào)控因子[17]，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)可抑制多種免疫細(xì)胞在腫瘤組織中增殖分化，表現(xiàn)為誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils，TAN)極化，阻斷樹突狀細(xì)胞的成熟，促進(jìn)Treg的產(chǎn)生，還可以募集MDSCs，加強(qiáng)TGF-β信號在腫瘤微環(huán)境中的促癌作用。因此，抑制TGF-β的功能，重建抗腫瘤免疫環(huán)境將成為治療腫瘤的一個(gè)重要策略。

Treg通過產(chǎn)生TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子而抑制T細(xì)胞功能[18-21]；通過表達(dá)負(fù)調(diào)控因子如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4、免疫球蛋白-3及PD-1而抑制效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生；去除Treg可增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的功能，增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療的療效。另有研究發(fā)現(xiàn)， Th17/Treg型細(xì)胞為新型CD4+T細(xì)胞亞群，起重要的免疫調(diào)控作用[22]。

1.3 主要信號通路 肝癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移是一個(gè)長期的、多因素作用的結(jié)果。目前實(shí)驗(yàn)研究涉及的主要通路有Ras/Raf/Mek/Erk信號通路[23]、Hedgehog信號通路[24]、EGFR信號通路[25]、p38MAPK信號通路[26]、PI3K/AKt信號通路[27]、TGF-β信號通路[17]、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[28]、STAT3信號通路[29]等。其中STAT3被證實(shí)處于多條癌癥信號通路的交匯點(diǎn)， JAK-STAT、PI3K-mTOR、Ras-Raf-MAPK等信號通路均涉及STAT3信號傳導(dǎo)[30]，對STAT3信號通路的研究成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

2 溫陽法影響肝癌免疫微環(huán)境的中醫(yī)理論基礎(chǔ)

關(guān)于腫瘤的形成，《靈樞·水脹》云：“寒氣客于腸外，與衛(wèi)氣相搏，氣不得榮，因有所系，癖而內(nèi)著，惡氣乃起，息肉乃成?！薄峨y經(jīng)·五十五難》曰：“積者，陰氣也，其始發(fā)有常處，其痛不離其部?！薄吨T病源候論·虛勞病諸疾》曰：“積聚者，由寒氣在內(nèi)所生也，血?dú)馓撊?，風(fēng)邪搏于臟腑，寒多則氣澀，氣澀則生積聚也”“積者，臟病也，陰氣所生也”“瘕病者，皆由久寒積冷，飲食不消所致也，……虛勞之人，脾胃氣弱，不能克消水谷，復(fù)為寒冷所乘，故結(jié)成此病也”。《臨證指南醫(yī)案》曰：“著而不移，是為陰邪聚。”可見，中醫(yī)理論多認(rèn)為腫瘤為有形之物，屬陰邪范疇。

《外科醫(yī)案匯編》記載：“正虛則為巖?！被谀[瘤微環(huán)境的扶正祛邪治則，體現(xiàn)了中醫(yī)腫瘤治療的整體觀和辨證論治原則[31]。然而，初治雖不乏療效，久治則克伐中氣，癥積難消[32]。實(shí)際上，肝癌術(shù)后氣血俱虛，經(jīng)歷長時(shí)期化學(xué)“驅(qū)邪”治療，癌瘤生長雖暫時(shí)得以控制，但仍然存在，可謂“正虛邪不盛”，然而，正氣虧虛，陽氣衰弱，不能推動(dòng)氣血運(yùn)行，日久則使病邪留滯，氣機(jī)不暢，血運(yùn)瘀阻，積瘤復(fù)大。肝癌陽虛證，主要表現(xiàn)為四肢畏寒、神疲乏力、喜靜喜臥、腹?jié)M鼓脹等。研究表明，肝癌患者體質(zhì)以氣虛質(zhì)和陽虛質(zhì)為主，陽虛證貫穿于肝癌TMN分期及Okuda分期始終，隨著肝癌的進(jìn)展，“陽虛”的分布比例越來越高[33]。早在《醫(yī)宗必讀》中，李中梓就提出“積之成也，而后邪氣據(jù)之”，治療上主張“氣血俱要，補(bǔ)氣在補(bǔ)血之先，陰陽并需，而養(yǎng)陽在養(yǎng)陰之上”。中醫(yī)溫陽法益氣溫陽，扶陽抑陰，首先顧護(hù)陽氣這一人之根本，益火之源以消陰翳，消積除癥。

3 溫陽法調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境的臨床及實(shí)驗(yàn)研究

多位學(xué)者開展了肝癌陽虛證特征及溫陽法論治肝癌的臨床研究。溫通助陽、益氣升陽法、益氣溫陽解毒法在臨床腫瘤防治中具有顯著療效[34-36]。陳群偉等[37]探討了原發(fā)性肝癌陽虛證患者血清代謝組特征性改變，發(fā)現(xiàn)肝癌陽虛證患者存在脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝的紊亂以及糖類等代謝物濃度的下降。孫慧茹等[38]發(fā)現(xiàn)，溫陽散結(jié)解毒湯(西洋參、黃芪、鹿角膠、附子、草烏等)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，與化學(xué)治療聯(lián)用，不僅療效明顯，且可保護(hù)免疫器官，提高細(xì)胞免疫功能，以及對抗化學(xué)治療引起的骨髓抑制?；谥嗅t(yī)學(xué)溫陽固腎、益氣升陽、扶正驅(qū)邪理論，研究發(fā)現(xiàn)溫陽益氣類中藥(黃芪、熟地黃、肉蓯蓉)可提高腫瘤微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞穩(wěn)定性[39]。

將蛋白組學(xué)技術(shù)及基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于溫陽法對肝癌微環(huán)境影響的研究已成為一大熱點(diǎn)。實(shí)踐證明，許多溫陽散寒方藥可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡、分化，抑制腫瘤微血管形成[40]。溫陽法[41]對肝癌具有免疫保護(hù)作用。研究顯示，四逆湯能調(diào)節(jié)機(jī)體特異性免疫和固有免疫[42]，通過上調(diào)肝癌組織p53蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[43]，結(jié)果提示溫陽法有激發(fā)機(jī)體免疫功能的作用。四逆湯能通過下調(diào)微環(huán)境中細(xì)胞的CD4+CD25Foxp3比例，上調(diào)微環(huán)境中Th型細(xì)胞因子IL-6、IL-10水平，從而改善肝癌微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)[42]。四逆湯可能通過下調(diào)腫瘤組織中TLR4蛋白的表達(dá)，改善肝癌微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)[44]。黃芪四君子湯可增強(qiáng)肝癌荷瘤小鼠整體及腫瘤微環(huán)境中特異性抗腫瘤免疫，能增加肝癌荷瘤小鼠整體及腫瘤微環(huán)境的免疫監(jiān)視功能和固有免疫功能，改善免疫抑制狀態(tài)，兩者呈量效關(guān)系[45]。中藥復(fù)方制劑溫化膠囊(主要由附子、貝母等組成)通過溫陽散寒與化痰活血，發(fā)揮溫陽化氣散結(jié)的作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，溫化膠囊具有誘導(dǎo)Bel-7402人肝癌細(xì)胞株凋亡的作用，并引起細(xì)胞周期的改變[40]。益氣溫陽補(bǔ)腎藥(附子、肉桂、淫羊藿)與益氣養(yǎng)陰藥北沙參、麥冬等配伍后的藥物血清能抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞癌基因N-ras的表達(dá)，促進(jìn)抑癌基因p53的表達(dá)[46]。以溫陽法為主的中藥復(fù)方治療聯(lián)合表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)，能夠抑制EGFR-TKI耐藥，提高EGFR-TKI的療效，其作用機(jī)制可能與調(diào)控相關(guān)miRNA基因及雌激素受體表達(dá)，對抗腫瘤異質(zhì)性，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等因素有關(guān)[41]。

4 結(jié)語

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生、進(jìn)展及復(fù)發(fā)與其免疫微環(huán)境密切相關(guān)[47-48]。中藥及其有效成分正被越來越多地應(yīng)用于調(diào)節(jié)肝細(xì)胞肝癌的免疫微環(huán)境。溫陽類中藥能對肝癌免疫耐受及免疫逃逸現(xiàn)象進(jìn)行干預(yù)，這既有中醫(yī)理論的支撐，又有確切的臨床療效。但目前這方面的臨床及實(shí)驗(yàn)研究較少，對溫陽法調(diào)節(jié)肝癌免疫微環(huán)境的分子機(jī)制及信號通路仍不明確，仍有待深入研究。

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