高職生物化學(xué)“肝中酮體的生成作用”實(shí)驗(yàn)的教學(xué)

諸戌嫻

(無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 江蘇無錫 214000)

在藥學(xué)、藥物分析技術(shù)和生物制藥技術(shù)組成的藥學(xué)專業(yè)群中，生物化學(xué)是一門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課。而在以就業(yè)為導(dǎo)向，以提升學(xué)生實(shí)踐能力為主要目標(biāo)的高職學(xué)校中，如何上好這門專業(yè)基礎(chǔ)課的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課就顯得尤為重要[1]。

“肝中酮體的生成作用”是與脂類代謝中脂肪酸分解氧化章節(jié)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)[2]，學(xué)生能否規(guī)范合格的操作和嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的思考，往往影響著實(shí)驗(yàn)成效。

1 講清原理，讓學(xué)生明明白白做實(shí)驗(yàn)

除了成熟紅細(xì)胞和腦組織外，幾乎所有組織都能氧化利用脂肪酸，通過活化、穿梭、β-氧化生成乙酰輔酶A，最終徹底分解為二氧化碳、水和大量能量。而在肝細(xì)胞內(nèi)β-氧化生成的乙酰輔酶A則大部分縮合生成乙酰乙酸(70%)、β-羥丁酸(30%)和丙酮(含量極少)，三者合稱酮體。酮體生成酶只存在于肝細(xì)胞內(nèi)，所以本實(shí)驗(yàn)就利用組織對(duì)比法，將肝勻漿和其他組織勻漿分別與丁酸底物保溫，底物和酮體生成酶在適宜的條件下將生成酮體，而酮體能使白色的顯色粉轉(zhuǎn)變成紫紅色，因此可利用顯色反應(yīng)，對(duì)各組合進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證“肝為酮體生成器官”這一理論。

理論上只有既存在底物丁酸，又存在肝勻漿(酮體生成酶系)的這支試管顯色，但是根據(jù)多年實(shí)踐操作，結(jié)果并非如此。因?yàn)槲覀儾荒芎鲆曂w“肝內(nèi)生酮，肝外利用”這一代謝特點(diǎn)，也就是說根據(jù)機(jī)體狀況，各組織器官其實(shí)都有可能出現(xiàn)酮體。肝內(nèi)組織有已經(jīng)合成但還沒有運(yùn)出去的酮體，肝外組織有還未開始分解利用的酮體。所以為了指導(dǎo)學(xué)生對(duì)稍后實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出更全面，更科學(xué)地分析，講實(shí)驗(yàn)原理時(shí)一定會(huì)提醒酮體的代謝特點(diǎn)，幫助學(xué)生拓展思路。

2 規(guī)范操作，鼓勵(lì)學(xué)生邊做邊思考

2.1 制備組織勻漿

本實(shí)驗(yàn)選取的是豬肝和豬的肌肉作為組織對(duì)比材料。為了提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)參與度，掌握實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)的操作要點(diǎn)，學(xué)生需要自己用研缽將兩個(gè)組織分別研磨直到細(xì)胞破碎，釋放出胞內(nèi)酶和其他物質(zhì)。在教學(xué)中強(qiáng)調(diào)學(xué)生必須養(yǎng)成高度的責(zé)任心和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，如果研磨不徹底，細(xì)胞將不能釋放出酶，后續(xù)實(shí)驗(yàn)都無法順利進(jìn)行，所以這是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。

2.2 酮體生成反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)，按下表用滴管分別滴加四支試管即可。在此步驟中學(xué)生最容易犯的錯(cuò)誤是滴管混用，吸完一種試劑不清洗干凈或新?lián)Q一個(gè)滴管，就直接吸取下一種試劑，尤其是吸取肝勻漿和肌勻漿時(shí)，這將引起較大顯色誤差。另外試劑全部滴加完后未認(rèn)真混勻，也是常見的問題，這將影響酮體的生成量。

2.3 顯色反應(yīng)

37度保溫后，各管滴加15%三氯醋酸20滴(用途：終止酮體生成酶活性)，混勻，靜置5 min備用。同時(shí)取白瓷反應(yīng)板，在4個(gè)凹槽中各加入等量顯色粉，隨后分別用干凈吸管從四支試管中，吸取適量試劑滴加于顯色粉，最后觀察各管的顏色變化。本步驟需注意白瓷反應(yīng)板各孔的顯色粉量盡量一致，并且顯色粉中有少量亞硝基鐵氰化鈉，有一定毒性，需提醒學(xué)生提高安全意識(shí)，謹(jǐn)慎操作。其次滴加試劑的滴管必須滴一次，洗一次或換一次，以免干擾正確結(jié)果。同時(shí)滴加的量只要使顯色粉濕潤(rùn)即可，而每組自行添加的顯色粉量不一定相同，所以需要每一組學(xué)生在滴加第一孔顯色粉時(shí)，做簡(jiǎn)單摸索，確定需要滴幾滴試劑才能達(dá)到要求，隨后幾管試劑可照此操作。

2.4 結(jié)果與分析

因?yàn)樵谥v解原理時(shí)已經(jīng)為學(xué)生拓展過思路，所以分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，認(rèn)真聽課、勤于思考的學(xué)生完全可以自行分析，而學(xué)習(xí)能力較弱的學(xué)生，通過老師引導(dǎo)，也能說出實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的成因。一號(hào)管含肝勻漿和丁酸，顯色最深，因?yàn)榇斯苤屑扔行律傻耐w，又可能存在肝中本就合成卻沒有運(yùn)輸出去的酮體。二號(hào)管含肝勻漿，顯色較一號(hào)管淺，比其他管深，雖然沒有底物，不能合成新的酮體，但是應(yīng)該存在肝中合成卻沒有運(yùn)輸出去的酮體，故仍然能使顯色粉顯色。三號(hào)管只含底物丁酸，因?yàn)槿狈νw生成酶，所以既不能新生成酮體，也不含組織內(nèi)已有的酮體，完全不顯色。四號(hào)管含丁酸和肌勻漿，雖然不能生成新的酮體，但是存在組織內(nèi)早已轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)來，但尚未用完的酮體，所以也會(huì)淺淺的顯色。通過陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、組織對(duì)比和比色法，此實(shí)驗(yàn)即驗(yàn)證了肝中酮體的生成作用，又進(jìn)一步體現(xiàn)了酮體的代謝特點(diǎn)，可謂一舉兩得。

3 總結(jié)

“肝中酮體的生成作用”雖然是一個(gè)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，但是面對(duì)學(xué)習(xí)能力較弱的高職學(xué)生，必須仔細(xì)透徹地將本章節(jié)相關(guān)理論知識(shí)一一講解清楚，使前后知識(shí)融會(huì)貫通。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中根據(jù)不斷積累的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)際結(jié)果，要求學(xué)生處理好每一個(gè)操作細(xì)節(jié)和關(guān)鍵步驟，養(yǎng)成高度的責(zé)任心，培養(yǎng)解決問題的能力和分析問題的能力。針對(duì)此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以鼓勵(lì)學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)方案中的優(yōu)缺點(diǎn)，提出改進(jìn)措施，從而培養(yǎng)學(xué)生的探索精神和創(chuàng)新精神。總之，實(shí)驗(yàn)教學(xué)既要鍛煉學(xué)生的動(dòng)手能力，也要鍛煉動(dòng)腦能力，學(xué)會(huì)分析問題，解決問題。

[1] 汪燕芳.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2017,20(1)：91-93

[2] 劉家秀.生物化學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2015