?基于淀粉合成基因TRAP標(biāo)記的甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析?

摘 要：為探究淀粉合成相關(guān)基因在甘薯種質(zhì)資源中的遺傳多樣性，通過(guò)對(duì)錨定引物的篩選構(gòu)建了基于淀粉合成基因的TRAP分子標(biāo)記技術(shù)，并對(duì)59份不同作用類型的甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。TRAP分子標(biāo)記篩選結(jié)果表明：SAI/me2、AGPase/em4和β-Amylase/me2這3對(duì)引物組合在分子標(biāo)記中存在較為豐富的多態(tài)性片段，結(jié)果重復(fù)性好，可作為TRAP分子標(biāo)記;其中，AGPase/em4分子標(biāo)記的區(qū)分能力最強(qiáng)，能將59份甘薯資源進(jìn)行較好的區(qū)分。甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析結(jié)果表明：不同類型的甘薯種質(zhì)資源之間無(wú)明顯的遺傳群體區(qū)分。研究表明，甘薯基因組為六倍體起源，其淀粉合成相關(guān)基因存在多基因遺傳作用，在不同甘薯種質(zhì)資源之間存在一定的遺傳差異，因而可以開(kāi)發(fā)成有效的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：甘薯;淀粉合成基因;遺傳多樣性;TRAP分子標(biāo)記;聚類分析

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）12-0013-05

Genetic Diversity Analysis of Sweet Potato Germplasm Resources Based on TRAP Markers of Starch Synthesis Gene

ZHANG Dao-wei1，YIN Qin1，2，DONG Fang1，HUANG Yan-lan1，ZHOU Hong1，

ZHANG Ya1，ZHANG Chao-fan1

（1. Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University ， Changsha 410128， PRC）

Abstract： To explore the genetic diversity of starch synthesis genes in sweet potato， the TRAP molecular marker based on starch synthesis genes was constructed by screening anchored primers， and genetic diversity of 59 different types of sweet potato germplasm resources was analyzed. The results show that for the 3 pairs of primer combinations SAI/me2， AGPase/em4 and beta-Amylase/me2， the polymorphic fragments are abundant and stable， and thus can be used as ideal TRAP molecular markers. Among them， AGPase/em4 molecular markers has the highest discrimination and reliability， which can distinguish 59 sweet potato resources in this test. No obvious genetic population differentiation among different types of sweet potato germplasm resources was found by the genetic diversity analysis.Previous studies have shown that the genome of sweet potato is the origin of hexaploid， and its starch synthesis genes suggests polygenic inheritance and indicates genetic diversity among different sweet potato germplasm resources. Thus the starch synthesis genes can be developed as effective molecular markers.

Key words： sweet potato; starch synthesis genes; genetic diversity; molecular markers; TRAP molecular markers; cluster analysis

淀粉（Starch）是一種多糖，是作物光合產(chǎn)物的主要儲(chǔ)存形式。甘薯中的淀粉除了食用和食品加工用外，也廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、飼料、醫(yī)藥、化工、造紙、紡織、鑄造、皮革等行業(yè)[1]，是重要的糧食和工業(yè)原料。淀粉含量是構(gòu)成甘薯產(chǎn)量的主要因素，其形成與積累方式?jīng)Q定了品種的產(chǎn)量和干率[2]。我國(guó)不同類型的甘薯種質(zhì)資源中薯塊淀粉含量差異較大，且遺傳多樣性較為豐富，雜交子代性狀分離明顯。因此，淀粉含量是甘薯育種和栽培研究的重要考核指標(biāo)。我國(guó)已培育了徐薯22、商薯19等一大批高淀粉型甘薯新品種，這些品種具有產(chǎn)量高、淀粉含量高、干物質(zhì)轉(zhuǎn)化快、凈同化率高等特點(diǎn)[3-4]。

淀粉在植物體中存在2種合成途徑：一種是ADP葡萄糖（ADPG）途徑，另一種為淀粉磷酸化酶催化途徑。2種途徑均受多基因的復(fù)雜調(diào)控，需要ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-Glucose Pyrophosphorylase，AGPase）、顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉分支酶（SBE）以及淀粉脫分支酶（DBE）的共同參與[5]。此外，蔗糖合成酶（Sucrose Synthase）基因SuSy、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（Soluble Acid Invertase）基因SAI、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate"Synthase）基因SPS、淀粉合酶（Starch Synthase）基因StSy、β-淀粉酶（β-Amylase）基因等也在淀粉合成途徑中有至關(guān)重要的作用[6-9]。由于甘薯具有復(fù)雜的多倍體基因組，同源基因之間存在豐富的拷貝，比較這些關(guān)鍵酶基因的遺傳差異可以解析甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性產(chǎn)生的原因。

靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（Target Region Amplified Polymorphism，TRAP）是在相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP）基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化改良而來(lái)[10]，通過(guò)已知的生物序列信息，利用生物信息學(xué)工具和表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，EST）數(shù)據(jù)庫(kù)的信息設(shè)計(jì)錨定引物和隨機(jī)引物，對(duì)目標(biāo)候選基因序列區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到多態(tài)性結(jié)果的標(biāo)記，能更好地體現(xiàn)目標(biāo)基因區(qū)多態(tài)性表型的差異，更適于遺傳多樣性研究[11-12]。該技術(shù)最先在向日葵中開(kāi)發(fā)應(yīng)用，目前已成功應(yīng)用于水稻、菜豆、大麥、小麥、甜菜等作物[13]。隨著甘薯大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的公布，甘薯TRAP標(biāo)記具有更明顯的優(yōu)勢(shì)，因而對(duì)甘薯種質(zhì)資源淀粉合成基因進(jìn)行遺傳多樣性分析，并建立基于淀粉合成基因的TRAP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)優(yōu)質(zhì)專用型甘薯新品種的選育和栽培具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從湖南省作物研究所甘薯種質(zhì)資源圃中選擇59份具有代表性的資源，分為淀粉型、紫薯、鮮食、莖葉菜用、觀賞和藥用等類型，如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TRAP引物設(shè)計(jì)方法 參照TRAP分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)原則[14]，錨定引物設(shè)計(jì)如下：（1）根據(jù)甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得候選基因序列，將序列在NCBI進(jìn)行blast驗(yàn)證;（2）利用Primer5設(shè)計(jì)6對(duì)靶標(biāo)引物（表2），結(jié)合位點(diǎn)多位于開(kāi)放讀碼框上游，隨機(jī)引物使用Li等[11]報(bào)道的15條隨機(jī)引物（表3），靶標(biāo)引物和隨機(jī)引物之間隨機(jī)組合。

1.2.2 甘薯葉片總DNA提取 采用改良后的CTAB提取法提取甘薯葉片基因組總DNA[15]。

1.2.3 最適分子引物的篩選及反應(yīng)體系 隨機(jī)取多份樣品DNA混合物為模板，根據(jù)靶標(biāo)引物和隨機(jī)引物的90對(duì)組合，進(jìn)行最適引物篩選，記錄PCR產(chǎn)物各引物組合電泳條帶數(shù)，篩選條帶較多且明亮清晰的組合為TRAP分子標(biāo)記引物組合。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min;94℃ 45 s，35℃ 45 s，72℃ 3 min，2個(gè)循環(huán);94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 3 min，38個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;16℃ 1 h。

1.2.4 TRAP分子標(biāo)記遺傳多態(tài)性統(tǒng)計(jì)與賦值 采用篩選的引物組對(duì)所有的試驗(yàn)樣品進(jìn)行TRAP標(biāo)記分析檢測(cè)，PCR結(jié)果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。電泳結(jié)果用Cambirdge的UVITEC系列凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，以DNA mark和多數(shù)樣品共有的序列為參照，根據(jù)實(shí)際條帶分布進(jìn)行多態(tài)性分析及結(jié)果記錄。同一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)有條帶記為1，無(wú)條帶記為0，特殊條帶單獨(dú)賦值為一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。分子標(biāo)記檢測(cè)至少需要2次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果，各重復(fù)之間多態(tài)性結(jié)果穩(wěn)定一致才采納為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.5 TRAP分子標(biāo)記聚類分析和主成分分析 采用NTsys-pc 2.10e 軟件生成相似系數(shù)矩陣或關(guān)聯(lián)度值，并采用非加權(quán)類平均法，進(jìn)行SAHN聚類分析，構(gòu)建甘薯淀粉不同基因的聚類圖。使用NTsys-pc 2.10e軟件中的Dcenter模塊對(duì)GS矩陣做中心化處理，獲得主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉合成基因相關(guān)分子標(biāo)記分析

以多種甘薯資源的混合DNA為模板對(duì)90對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，電泳條帶數(shù)量表示該引物組在甘薯基因組可能的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量，間接反應(yīng)了該基因在甘薯基因組的核苷酸片段多態(tài)性。由表4可知，甘薯淀粉合成相關(guān)基因的核苷酸片段多態(tài)性較為豐富，以SAI/em2、SAI/em4、SAI/em6、SAI/me2、SAI/AN2、SPS/em1、AGPase/em3、AGPase/em4、AGPase/AN4、β-Amylase/em1、β-Amylase/me2這些引物組合獲得的核苷酸多態(tài)性片段數(shù)較多，可作為候選TRAP分子標(biāo)記。

2.2 分子標(biāo)記指紋圖譜質(zhì)量的比較與篩選

對(duì)候選TRAP分子標(biāo)記進(jìn)行不同種質(zhì)資源間的重復(fù)性和多態(tài)性驗(yàn)證，結(jié)果顯示，SAI/me2（圖1a）、AGPase/em4（圖1b）、β-Amylase/me2（圖1c）這3對(duì)引物組合在分子標(biāo)記中存在較為豐富的多態(tài)性片段，結(jié)果重復(fù)性好，可作為TRAP分子標(biāo)記。

2.3 甘薯種質(zhì)資源淀粉合成基因遺傳多樣性聚類分析

分別以篩選的TRAP分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性分析，根據(jù)多態(tài)性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，建立甘薯種質(zhì)資源的聚類樹(shù)狀圖（圖2），其中AGPase/em4（圖2b）分子標(biāo)記的區(qū)分能力最強(qiáng)，基本能將59份甘薯資源進(jìn)行較好的區(qū)分;而分子標(biāo)記SAI/me2 （圖2a）、β-Amylase/me2（圖2c）在諸多種質(zhì)資源中存在相同的指紋圖譜，因而不能將59份甘薯種質(zhì)資源有效區(qū)分開(kāi)來(lái)。

2.4 甘薯種質(zhì)資源群體遺傳的多樣性分析

將3個(gè)分子標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，匯編成一個(gè)完整的指紋圖譜，并根據(jù)指紋圖譜進(jìn)行各種質(zhì)資源的主成分分析，結(jié)果如圖3所示。各資源分布的位置代表了其遺傳關(guān)系，2份資源所處的點(diǎn)越接近，表明其遺傳距離越小;而分布較為密集的區(qū)域視為一個(gè)遺傳群體。從圖3可看出，不同類型的甘薯種質(zhì)資源之間無(wú)明顯的遺傳群體區(qū)分。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，甘薯淀粉合成相關(guān)基因的多態(tài)性研究成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重點(diǎn)。甘薯種質(zhì)資源中淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶等基因均存在豐富的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）和插入缺失標(biāo)記多態(tài)性（insertion-deletion，inDel）。李豐[16]通過(guò)對(duì)甘薯淀粉合成相關(guān)基因的克隆和SNP分子標(biāo)記，初步認(rèn)為SNP多態(tài)性和inDel多態(tài)性與淀粉含量有關(guān)。這些多態(tài)性和遺傳多樣性都是生物多樣性產(chǎn)生的主要遺傳基礎(chǔ)。因此利用分子標(biāo)記方法對(duì)淀粉合成相關(guān)基因的遺傳多樣性分析能進(jìn)一步解析甘薯淀粉遺傳機(jī)理。而TRAP分子標(biāo)記因?yàn)槠湫矢?、?zhǔn)確性好、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)在品種鑒定、遺傳多樣性分析、系譜分析、遺傳圖譜構(gòu)建、突變體檢測(cè)、基因定位[17]、分子標(biāo)記輔助選擇等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該研究篩選出SAI/me2、AGPase/em4和β-Amylase/me2這3對(duì)基于甘薯淀粉合成相關(guān)基因的TRAP分子標(biāo)記，其中AGPase/em4分子標(biāo)記的區(qū)分能力最強(qiáng)，基本能將59份甘薯資源進(jìn)行較好的區(qū)分;應(yīng)用這3對(duì)TRAP分子標(biāo)記對(duì)59份不同作用類型的甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，不同類型的甘薯種質(zhì)資源之間無(wú)明顯的遺傳群體區(qū)分。甘薯基因組為六倍體起源，其淀粉合成相關(guān)基因可能存在多基因遺傳作用，因此不同甘薯種質(zhì)資源存在一定的遺傳差異。這為后續(xù)優(yōu)質(zhì)專用型甘薯新品種選育和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用提供了參考。

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