?耐鎘棘孢木霉的篩選鑒定及其鎘吸附特性研究?

摘 要：為了篩選鑒定耐鎘真菌，采用Cd2+濃度梯度壓力馴化法從鎘污染稻田土壤中分離到耐鎘菌株HD228，綜合菌株形態(tài)特征、ITS基因序列系統(tǒng)進化分析，鑒定其為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）并研究了其鎘吸附特性。結(jié)果表明：該菌株耐22 mmol/L"Cd，對Cd的吸附率可達79.88%;對Pb、Zn、Cu具有很強耐性，Pb、Zn、Cu對HD228的最低抑制濃度（MIC）分別為gt;80 mmol/L、gt;80 mmol/L、gt;30 mmol/L。HD228菌落直徑與重金屬濃度呈負相關(guān)，20 mmol/L時菌落不規(guī)則。該菌能在pH值 4～8、溫度20～35℃條件下良好生長，最適生長和耐鎘pH值為5、溫度為30℃，溫度和pH值均不影響其耐鎘能力。其發(fā)酵液對水稻出苗、幼苗生長無抑制作用，發(fā)酵液40 mL（200 g 土）用量對水稻具有促生作用，對鎘脅迫水稻具有解毒作用。此耐鎘真菌HD228具有應(yīng)用于鎘污染水稻田治理的潛力。

關(guān)鍵詞：水田土壤;鎘污染;棘孢木霉;鎘吸附

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）12-0001-07

Screening and Identification of Cd-Tolerant Trichoderma asperellum and Characterization

of Its Cadmium Biosorption

DENG Ya-nan1，PENG Di1，WANG Li-feng1，ZHOU Xiao-mao1，MAN Yi-long1，BAI Lian-yang2

（1. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute， Changsha 410125， PRC;

2. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract： This study aims to screen and identify Cd-tolerant fungus and to characterize its cadmium biosorption. A Cd-tolerant strain （HD228） was isolated from the cadmium polluted paddy soil by using Cd2+ concentration gradient pressure domestication method. Based on its morphological characteristics and the phylogenetic analysis of ITS （internal transcribed spacers） gene sequences， the strain was identified to be Trichoderma asperellum. This strain is resistant to Cd at 22 mmol/L with Cd adsorption rate up to 79.88%， and also resistant to other heavy metals including Pb， Zn and Cu. The MICs （minimum inhibitory concentration） of Pb， Zn and Cu on HD228 are 80 mmol/L， 80 mmol/L and 30 mmol/L， respectively. A negative correlation between the colony diameter and the heavy metal concentration was observed， and the colony was out-of-shape when Cd2+ concentration reached 20 mmol/L. The strain HD228 grows well at pH 4 to 8 and the temperature between 20℃ and 35℃， and the optimal growth conditions is at pH 5 and 30℃. Neither temperature nor pH value affects its cadmium tolerance. Fermented liquid of this strain has no inhibitory effects on the emergence and growth of rice seedlings， but rather improves the growth of rice seedlings and alleviates the toxicity of cadmium in rice at the ratio of 40 mL to 200 g soil. Thus， the Cd-resistant fungus HD228 has potential for treatment of Cd-polluted rice paddies.

Key words： paddy soil; Cd pollution; Trichoderma asperellum; Cd adsorption

腺嘌呤、鳥嘌呤、腺苷酸、脫氧鳥苷酸共價結(jié)合形成不穩(wěn)定的加合物，損傷DNA[1]，還能引發(fā)“痛痛病”或暴力和其他相關(guān)精神失常的疾病行為[2];流行病學(xué)最近的研究數(shù)據(jù)表明，日常飲食攝入鎘，罹患骨質(zhì)疏松癥等病的危險性更高[3]，鎘給人類健康帶來巨大危害，已被國際癌癥研究機構(gòu)認定為Ⅰ類（人類）致癌物[4]。

由于人類活動產(chǎn)生的含鎘污染物如工業(yè)廢氣、廢水、廢物及農(nóng)業(yè)廢棄物和生活污水排放等，稻田土壤鎘污染越來越嚴重，已成為全世界普遍關(guān)注的問題，水稻鎘污染治理任務(wù)越來越緊迫。水稻鎘污染主要直接來源為土壤，因而，鎘污染稻田土壤修復(fù)是關(guān)鍵。

傳統(tǒng)的物理、化學(xué)修復(fù)方法收效較快但工程量大、成本高[5]，不僅需要消耗大量能源或化學(xué)制品等，而且某些鈍化劑的使用會造成修復(fù)污染土壤同時對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不良作用，從而影響土壤的后續(xù)利用[6]。微生物數(shù)量多、比表面積大、代謝活性旺盛，可通過多種機制包括主動吸收、結(jié)晶、螯合、細胞壁或色素吸附等與重金屬發(fā)生作用而減少環(huán)境中重金屬含量或改變其生物有效性[7]。微生物修復(fù)較物理、化學(xué)等修復(fù)技術(shù)操作簡單、處理費用低、效果好。真菌的細胞壁上有大量多糖和糖蛋白如葡聚糖、幾丁質(zhì)等，這些聚合物提供了大量金屬結(jié)合配體，能與重金屬充分結(jié)合，減少土壤中活性游離態(tài)重金屬離子，從而減少土壤中有效態(tài)污染物質(zhì)含量，且不會對環(huán)境造成二次污染等。大多數(shù)真菌具菌絲結(jié)構(gòu)，菌絲能滲透污染土壤，可與土壤中重金屬充分接觸而發(fā)生物理、化學(xué)反應(yīng)。真菌來源廣，且對營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH值的變化相對不那么敏感，易于發(fā)酵，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低。經(jīng)濟上、生態(tài)上和生產(chǎn)上的多重優(yōu)勢使真菌在重金屬污染治理中具有巨大潛力和廣闊的應(yīng)用前景。由于環(huán)境長期選擇作用，鎘污染環(huán)境中一般存在耐鎘且鎘吸附能力較強的真菌。從廢水、礦區(qū)等土壤篩選到具有高耐鎘能力和鎘吸附能力的真菌有青霉屬、酵母菌[8]等，但從水稻田土壤篩選到的此類真菌較少。本土耐鎘、重金屬高吸附微生物更能適應(yīng)重金屬污染稻田土壤特殊環(huán)境[9]而有利于發(fā)揮其生物吸附作用。因此，篩選鎘污染水稻田土壤耐鎘真菌并研究其鎘吸附特性等，對鎘污染水稻田土壤修復(fù)具有重要的理論與現(xiàn)實意義。

筆者主要從湖南衡東市鎘污染水稻田土壤中篩選耐鎘真菌并進行鑒定;研究其鎘吸附能力、對鎘和其他幾種常見重金屬的耐性，以最小抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）為重金屬耐受性指標對菌株重金屬耐受性進行評價[10];研究其對鎘脅迫響應(yīng)的外在表現(xiàn);研究其對水稻生長安全性和對鎘脅迫水稻解毒作用，以期獲得對水稻等作物安全的具有鎘污染稻田土壤高效治理潛力的菌株，擴充鎘污染水稻田微生物修復(fù)的菌種資源庫;并對其生長條件進行摸索，為培養(yǎng)和進一步探索利用該菌株進行稻田環(huán)境鎘污染治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 耐鎘真菌的分離

土壤樣品采自湖南衡東市大浦鎮(zhèn)爐鋪村工業(yè)園附近稻田，采樣點用地理信息系統(tǒng)GIS地圖工具

（Garmin）定位（土壤采集地點坐標為：112°47′29.22″E，27°00′17.78″N）。用滅菌土鉆各鉆取一季晚稻田5～20 cm土壤2 kg（編號HD），分別混勻后各分裝于2個無菌密封袋，一袋置于冰盒中帶回實驗室4 ℃保存，一袋常溫帶回風(fēng)干測定土壤重金屬含量及pH值等。取4 ℃保存的A、B土壤樣品各10 mg分別溶于90 mL無菌去離子水中，磁力攪拌30 min制備土壤懸浮液。取土壤懸浮液1 mL接種于含2 mmol/L Cd（NO3）2的PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃、150 r/min條件下耐鎘真菌富集培養(yǎng)7 d。取10倍系列稀釋的耐鎘真菌富集液100 μL涂布于2 mmol/L Cd2+ PDA平板上，28℃培養(yǎng)7 d后生長良好的菌落依次轉(zhuǎn)接于更高濃度（4、8、16 mmol/L）Cd2+ PDA平板上，梯度馴化培養(yǎng)，篩選得到耐鎘能力最強的真菌。從篩選到的鎘耐性最強的菌株中選擇一株作為進一步研究的供試菌株。

1.2 耐鎘真菌鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)分析 采用三點接種法將HD228接種于CYA、MEA、OA、YES、CYAS培養(yǎng)基平板上（90 mmol/L培養(yǎng)皿）[11]，25、30、35、40℃黑暗培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，觀察產(chǎn)孢情況，正反面菌落顏色和可溶性色素有無。MEA平板上培養(yǎng)7 d的菌落材料用于顯微觀察，子囊果、子囊、子囊孢子觀察用OA平板材料，菌絲、分生孢子梗、分生孢子器觀察用電子掃描顯微鏡（Jeol JSM-6360）（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心）。按照《真菌鑒定手冊》索引表進行菌株形態(tài)鑒定。

1.2.2 DNA提取、PCR 擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析 選用在PDA上培養(yǎng)1周的菌落提取DNA，用Omega E.Z.N.A.

真菌DNA試劑盒 （Omega， USA）。滅菌牙簽挑取真菌菌絲100 mg，參照說明書，用Omega真菌DNA小量提取試劑盒提取分離真菌DNA。ITS序列是使用最廣泛的真菌標記序列[12]。用ITS通用引物ITS-1 （5'-TCCTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS-4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min;35次循環(huán)：94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min;72℃ 7 min和10℃終止。PCR產(chǎn)物序列由生物工程（上海）股份有限公司測定。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，Blast 比對ITS和BenA基因序列，并從中獲得參考序列用于系統(tǒng)進化分析。系統(tǒng)進化分析用Mega 5.0軟件中的neighbor-joining（NJ）方法。

1.3 鎘吸附能力試驗

吸附過程在裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基250 mL的錐形瓶中進行。將無Cd2+平板上生長7 d的HD228菌體刮入錐形瓶中，150 rpm，28℃培養(yǎng)7 d后8 000"r/min離心15 min，在無菌條件下分別稱取0.1、0.5、1.0、1.5 g（取1.0 g濕菌絲體置于60℃烘箱中烘干，直至菌絲質(zhì)量恒定不變，計算濕菌絲體干重）菌絲體分別接種于100 mg/L的Cd2+ PDA液體培養(yǎng)基中，為避免培養(yǎng)基對鎘離子的吸附，分別以100、200 mg/L不加菌絲體為對照，150 r/min，28℃培養(yǎng)7 d后8 000 r/min離心15 min，用原子吸收分光光度法測定上清液中Cd2+濃度。用下面的公式計算菌株鎘吸附率。所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值用于數(shù)據(jù)分析。

計算公式：鎘吸附率Ar（%）=（Cc-Ct）/Cc×100。式

中，Cc為對照上清液的Cd2+終濃度（mg/L）;Ct為菌絲吸附后上清液中Cd2+濃度（mg/L）。

1.4 鎘耐性及其他重金屬耐性試驗

取16 mmol/L Cd2+平板上分離的HD228先后接種的平板Cd2+濃度則為20、21、22、23、24 mmol/L等。在28 ℃培養(yǎng)7 d，直至菌落不長出，停止轉(zhuǎn)接，此時的Cd2+濃度即為Cd對菌株的MIC值。用直徑5 mm打孔器在長有HD228單菌落的PDA平板上打出菌碟，分別接種于Pb（NO3）2（0、20、40、60、80 mmol/L）、ZnSO4（0、20、40、60、80 mmol/L）、CuSO4（0、5、10、20、30、40 mmol/L等）PDA平板上，培養(yǎng)3 d，用直尺十字交叉法測定菌落直徑（下同），探究HD228對鎘污染水稻田常見的其他幾種重金屬耐性水平，即測MIC值。所有試驗均設(shè)重復(fù)3次。

1.5 HD228對不同濃度Cd2+脅迫的響應(yīng)

用上1.4取種方法取HD228接種于0、10、20 mmol/L的Cd2+PDA平板上和CYA（為避免其他重金屬離子對結(jié)果的干擾，未添加培養(yǎng)基所需成分——跡量元素Zn、Cu）平板上，各重復(fù)3次，28 ℃ 培養(yǎng)5 d測定菌落直徑并觀察菌落產(chǎn)孢情況、顏色、色素分泌等差異。

1.6 pH值和溫度對菌株生長和鎘耐性的影響

按1.4取種方法，取HD228接種于pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的不含Cd2+和含Cd2+ 2 mmol/L PDA平板上，各重復(fù)3次，28℃倒置培養(yǎng);連續(xù)2 d測定菌落直徑，并觀察菌落差異;接種于自然pH值且不含Cd2+和含Cd2+ 2 mmol/L PDA平板上，37、32、30、28、24、20℃，各重復(fù)3次，倒置培養(yǎng)3 d，連續(xù)2 d測定菌落直徑，并觀察菌落差異。

1.7 菌株HD228對水稻生長安全性檢測及其對鎘脅迫水稻解毒作用

微生物應(yīng)用于水稻田進行鎘污染治理的前提是其對水稻生長安全，不誘發(fā)疾病，不抑制生長。幼苗對環(huán)境脅迫敏感，故進行HD228對水稻致病情況和對出苗率、幼根、幼苗生長影響研究。種植土為采自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的水稻田土壤，Cd含量為0.28 mg/kg。發(fā)酵液系HD228在PDA液體培養(yǎng)基中150 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)7 d而成，再分別將0 、20、40、60和80 mL HD228發(fā)酵液用無菌去離子水補充至總體積為120 mL，充分混勻后倒入燒杯中攪拌均勻。以200 mL燒杯為容器，加入風(fēng)干土壤200 mg，播種前施加制備的HD228發(fā)酵液并充分攪拌均勻，水稻種10顆/杯，出芽整齊，芽長為谷粒長的2/3，水稻種先用 30% H2O2滅菌10 min，滅菌去離子水清洗5次后浸種、破胸、催芽處理。每個處理重復(fù)3次。12 h晝（32℃）夜（26℃）交替培養(yǎng)，2 d后統(tǒng)計出苗率，8 d后測定水稻苗長、苗鮮重、根鮮重。計算平均苗長和根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品及耐鎘真菌的篩選結(jié)果

土壤樣品全量 Cd、Cu、Zn、Pb分別為32.09、30.90、347.90、86.00 mg/kg，pH值為4.7。采用Cd2+濃度梯度馴化法逐級篩選耐鎘真菌，從2 mmol/L Cd2+平板上篩選到真菌11株。繼續(xù)轉(zhuǎn)接至4、8 mmol/L等濃度的Cd2+平板上，其中8株耐性逐漸減弱，另外3株仍表現(xiàn)出較強的耐性。直至轉(zhuǎn)接于16 mmol/L Cd2+ 平板上，其中8株不生長，僅剩下3株仍能生長。選取其中鎘耐性最強的一株菌株作為進一步研究的供試菌株，編號為HD228。

2.2 耐鎘真菌鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征分析 PDA培養(yǎng)基平板上，菌落生長迅速，黑暗條件下30、35、40 ℃培養(yǎng)72 h，半徑分別為56、28 mm，40 ℃不生長;白色透明菌絲緊貼平板快速延伸，36 h左右形成白色絨狀菌落;48 h左右從菌落中部開始形成綠色孢子，菌落外圍逐漸產(chǎn)生孢子，整個菌落慢慢變成綠色，隨著孢子漸漸成熟，菌落變?yōu)樯罹G色，無黃色色素分泌;菌落背面也為綠色（見圖1a）。分生孢子梗以相對主軸90°或接近90°伸出，通常對生。瓶梗（見圖1b）安瓿瓶形，分生孢子（見圖1c）球形或橢球形，（2.5～3） μm×（3～4） μm，表面粗糙，布滿小突起。生長后期散發(fā)椰子香味。這些形態(tài)特點與木霉菌的形態(tài)特征相同。

2.2.2 菌株ITS基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 BLAST比對分析結(jié)果表明，HD228的ITS序列與棘孢木霉（Trichoderma asperellum）相應(yīng)序列同源性達100%，用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），確證了HD228與木霉屬的系統(tǒng)進化關(guān)系非常接近。結(jié)合形態(tài)觀察和分子生物學(xué)分析結(jié)果，初步鑒定HD228為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）[13]，該菌現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏號：CGMCC No.12870）。

2.3 菌株HD228鎘吸附能力

HD228菌絲添加量為1.5 g時，鎘吸附率為79.88%。

由圖3可知，菌絲添加量為1.5 g和1.0 g時鎘吸附率差異不顯著。HD228的Cd吸附率不隨菌絲體質(zhì)量的增加持續(xù)顯著升高。

2.4 菌株HD228的鎘耐性及其他重金屬耐性

HD228能在22 mmol/L的Cd2+平板上勉強生長，當(dāng)Cd2+濃度為23 mmol/L時，無菌落形成，由此得出Cd對HD228的MIC值為23 mmol/L。由圖4看出，隨重金屬離子濃度升高，各菌落直徑均減小，說明各重金屬對菌株HD228生長均有抑制作用。在Cu2+濃度為40 mmol/L時，HD228未長出，Pb2+、Zn2+為80 mmol/L時，菌落均能生長，但受到明顯抑制，少量菌絲長出，未形成菌落，Zn2+對其抑制作用略小于Pb2+，Cu、Zn、Pb對HD228的MIC值分別為gt;30 mmol/L、gt;80 mmol/L、gt;80 mmol/L（見圖4）。以上所有重金屬的MIC值均遠高于土壤環(huán)境質(zhì)量二級標準濃度（pH值≤6.5、Pb：250 mg/kg、Zn：200 mg/kg、Cu：50 mg/kg、Cd：0.3 mg/kg），說明菌株HD228對這幾種重金屬均有耐性。MIC值與耐性成正比，所以HD228對以上幾種重金屬的耐性強弱順序為：Zn2+gt;Pb2+gt;Cu2+gt;Cd2+。

2.5 HD228菌落對不同濃度Cd2+壓力的響應(yīng)

HD228生長5 d的菌落差異明顯（見圖5）：無Cd2+培養(yǎng)基中，菌絲延伸迅速，從菌落中心開始形成孢子;10 mmol/L Cd2+存在條件下，菌絲明顯減少，菌落邊緣堆積形成孢子堆;20 mmol/L時，形成不規(guī)則菌落，產(chǎn)生淡黃色色素。

菌落徑向生長直徑受Cd2+抑制。不同Cd2+對HD228直徑影響差異較大（Plt;0.05，下同）（見圖6），20 mmol/L時，HD228菌落生長2 d直徑很短。

2.6 溫度和pH值對菌株HD228生長和耐鎘的影響

在微生物的生長過程中，溫度影響酶的活性、細胞質(zhì)膜的流動性以及物質(zhì)的溶解等，從而導(dǎo)致其生長速率發(fā)生改變。由圖7可知，HD228在20～35 ℃均能生長;有、無Cd2+ 條件下，溫度對HD228的影響差異較大，30 ℃是其最適生長溫度和耐鎘溫度;有、無Cd2+培養(yǎng)基中，溫度對其生長影響趨勢相似，溫度不影響其耐鎘能力。

真菌生長狀況與環(huán)境酸堿性密切相關(guān)，而鎘污染環(huán)境pH值通常較低，故研究此菌株是否具備適應(yīng)酸性環(huán)境的能力。從圖8可看出，HD228菌落在酸性條件下和中性條件下生長較好，HD228在pH值4.0～8.0都能良好生長，因而酸性至中性土壤都具有適應(yīng)鎘污染的可能。有Cd2+培養(yǎng)基中菌落直徑與pH值對其菌落直徑的影響呈相似關(guān)系，說明pH值不影響其耐鎘能力。酸性環(huán)境適宜HD228生長，pH值不影響其耐鎘能力。

2.7 菌株HD228對水稻生長的影響

添加HD228發(fā)酵液處理的水稻在生長過程中未出現(xiàn)病征，所有水稻種均正常出苗，出苗率均為100%，即HD228不影響水稻種出苗。如表1所示，HD228發(fā)酵液20～40 mL能顯著促進苗長增加;20～60 mL顯著促進苗鮮重增加，80 mL用量苗長增加不顯著;60～80 mL顯著促進根鮮重增加，20 mL時根鮮重顯著低于對照。根系吸收營養(yǎng)物質(zhì)供地上部分生長使用，地上部分的增長是植物生物量增加的重要體現(xiàn)，因而HD228發(fā)酵液施用量為40 mL/（200 g土壤）時對水稻的促生作用最佳。

當(dāng)添加Cd2+ 200 mg/kg時，水稻生長受到明顯抑制，但添加耐鎘真菌發(fā)酵液后，水稻生長狀況有所改變：HD228 發(fā)酵液20～40 mL顯著增加苗長，40 mL顯著增加苗鮮重，40～80 mL顯著增加根鮮重，80 mL對苗鮮重有顯著抑制作用，因而40 mL劑量對鎘脅迫水稻的植株生物量的增加效果最佳。

3 結(jié)論與討論

鎘吸附試驗中，在Cd2+濃度一定時，菌絲量增加后鎘吸附力增強，到一定的吸附率后不再升高，可能是由于增加菌絲量后吸附位點增多，增大了Cd2+與菌體表面接觸的機會，能吸附更多Cd2+，隨著菌量的繼續(xù)增加，吸附位點漸趨飽和，吸附率趨平穩(wěn);另外一種可能是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分有限，菌株不能無限繁殖，菌絲量不再大幅增加，菌體與Cd2+接觸面積不再顯著增大，因此鎘吸附率不再顯著提高。菌絲量相同，Cd2+初始濃度越大，鎘吸附率越高，可能是菌絲體與鎘離子接觸面積越大，有利于菌絲體吸收更多Cd2+。

菌株HD228對Cd2+的最高耐性達22 mmol/L，可進一步研究其具有如此高鎘耐性的機制。由于鎘污染源中常常含有多種其他重金屬，導(dǎo)致鎘污染土壤常常是多種重金屬復(fù)合污染。Pb、Zn、Cu的MIC值分別為gt;80 mmol/L、gt;80 mmol/L、gt;30 mmol/L，MIC值均遠高于中國土壤環(huán)境質(zhì)量二級標準濃度，說明此菌株對這幾種重金屬均有很強的耐性。木霉菌屬于絲狀真菌，很可能是其絲狀結(jié)構(gòu)有利于其抵抗高濃度鎘等重金屬的脅迫。此耐鎘真菌耐鎘污染稻田土壤中常見的多種其他重金屬，具備用于鎘污染環(huán)境修復(fù)時可能需要抵抗多種重金屬脅迫的潛力。

由于過量的重金屬非微生物生活所必需，微生物通常對重金屬脅迫予以響應(yīng)，包括外觀形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)改變、產(chǎn)生分泌物等[14]。能適應(yīng)重金屬污染環(huán)境的微生物可能是通過這些響應(yīng)行為來增強耐性。據(jù)報道耐鎘微生物在一定濃度Cd2+ 培養(yǎng)基上的菌落顏色不同于對照，可能是Cd2+抑制或促進了耐鎘微生物色素的分泌，這可能是其重金屬耐性原因之一。研究表明微生物在其生長過程與土壤環(huán)境因素相互作用時會釋放出許多代謝產(chǎn)物等，這些代謝產(chǎn)物能與重金屬發(fā)生反應(yīng)從而吸附固定重金屬，因而可利用微生物的代謝產(chǎn)物吸附、固定土壤中的重金屬。

真菌能在有毒重金屬環(huán)境中生存，主要依靠固有的生化和結(jié)構(gòu)性能，生理或遺傳適應(yīng)，包括形態(tài)學(xué)改變或改變重金屬形態(tài)、生物有效性和毒性[7]。有研究者表示菌落直徑變化的原因可能是由于菌絲內(nèi)部積累了重金屬有毒物質(zhì)或是重金屬進入了孢子從而減少或抑制了孢子的萌發(fā)[15]。當(dāng)Cd2+ 濃度達到一定值時，HD228菌落形態(tài)發(fā)生改變，這可能與其具有重金屬耐性有關(guān)[16]。幾丁質(zhì)的生物合成是一種被誘導(dǎo)作為真菌細胞抵抗壓力的反應(yīng)機制，而使真菌細胞抗性增強。當(dāng)過高濃度Cd2+使幾丁質(zhì)合成受到抑制時，菌絲裂解，突起形成;有毒Cd2+細胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞而使細胞裂解，菌落形態(tài)發(fā)生改變[16]。

環(huán)境溫度和pH值是與微生物生長密切相關(guān)的因素，得到最適生長溫度和pH值可為其實驗室培養(yǎng)及大量生產(chǎn)提供理論依據(jù)。酸性環(huán)境適宜HD228生長，pH值為5時，HD228生長最旺盛，此時的pH值明顯低于分離篩選耐鎘真菌時培養(yǎng)基的pH值，說明此種耐鎘真菌的選擇主要是受Cd2+影響而不是酸堿性影響。鎘污染土壤通常呈酸性，而此耐鎘真菌能夠在此酸性范圍內(nèi)良好生長，研究表明青霉屬真菌是特殊環(huán)境（比如低pH值）下突出的高效生物地球化學(xué)因子和可溶性、微粒狀重金屬的生物“蓄電池”[17]，因而，HD228很可能也具備這種特性，具備應(yīng)用于鎘污染稻田治理中的潛力。

添加HD228發(fā)酵液處理的水稻在生長過程中未出現(xiàn)病征，且水稻出芽率未受影響;20～60 mL HD228發(fā)酵液具有促進水稻幼苗生長的作用。Hamayun[18]等也研究發(fā)現(xiàn)一種青霉菌對水稻和茼蒿具有顯著促生作用，且分泌9種赤霉素，HD228對水稻很可能也具有促生作用。40 mL發(fā)酵液處理受200 mg/kg Cd2+脅迫水稻苗長、苗鮮重、根鮮重都顯著增長，說明HD228發(fā)酵液對鎘脅迫水稻具有解毒作用。而80 mL用量時苗長增加不顯著，苗鮮重顯著降低，根長顯著增加，可能的原因是高劑量發(fā)酵液吸附了絕大部分Cd2+，減輕Cd2+對水稻根的脅迫，從而充分吸收土壤中營養(yǎng)元素如P[19]和N而發(fā)揮壯根作用。HD228發(fā)酵液對水稻無致病作用，適量發(fā)酵液對水稻出苗率和生長無抑制作用，甚至有促進作用，滿足其應(yīng)用于鎘污染水稻田土壤修復(fù)時的基本條件。

從鎘污染水稻田篩選到的土著耐鎘微生物HD228更容易適應(yīng)鎘污染水稻田特殊環(huán)境，生長速率快，易于培養(yǎng)，可大規(guī)模培養(yǎng);且對水稻生長具有促進作用，對鎘脅迫水稻具有解毒作用。綜合以上優(yōu)點，此菌株具有作為微生物肥料用于水稻田土壤鎘污染治理的潛力。

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