?10種植物精油對藍(lán)莓病原菌的體外抑菌活性初篩?

摘 要：為了開發(fā)應(yīng)用于藍(lán)莓保鮮的天然保鮮劑，采用牛津杯法和試管二倍稀釋法對10種植物精油的抑菌活性進(jìn)行鑒定，研究了植物精油對2種代表性革蘭氏細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）及藍(lán)莓中3種有害真菌（鏈格孢霉、指狀青霉、灰霉）的抑制能力。結(jié)果顯示：肉桂精油、百里香精油對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）抑制效果較好，肉桂精油、馬尾松精油對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）有較好抑制;10種植物精油中有7種精油對3種真菌均有抑制作用，其中肉桂精油、丁香精油、八角精油、百里香精油等精油均有較強的抑真菌能力;其中，肉桂精油對真菌以及革蘭氏陰性和陽性菌均有強烈抑制效果，最小抑菌濃度在0.039 1～0.156 0 μL/mL之間;植物精油對真菌的抑菌效果優(yōu)于細(xì)菌，可以用肉桂精油作為復(fù)配基油，添加其他精油應(yīng)用于藍(lán)莓的天然保鮮，以達(dá)到更好的抑菌防腐效果。

關(guān)鍵詞：植物精油;藍(lán)莓病原菌;體外抑菌;篩選

中圖分類號：TS255.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）02-0073-03

The Initial Screening of Ten Plant Essential Oils in Vitro Antibacterial Activity of

Blueberry Pathogens

LIN Shu-hua，WANG Wei，ZHANG Ju-hua，YANG Xiu-lian

（Hunan Agricultural Sciences Academy of Agricultural Products Processing Institute， Changsha 410125， PRC）

Abstract：In order to develop natural antistaling agent for blueberries preservation， the bacteriostatic activity of 10 kinds of plant essential oils were conducted by Oxford cup method and tube double dilution method， and their inhibitory ability to two kinds of representative gram-negative bacteria （Escherichia coli， Staphylococcus aureus） and three kinds of harmful fungus （Alternaria alternata， Penicillium digitatum， Botrytis cinerea） in blueberries were studied. The results showed that seven kinds of essential oil have antibacterial ability to three kinds of fungi， cinnamon oil， clove essential oil， anise oil and thyme essential oil have strong antibacterial effect. Cinnamon essential oil，and thyme essential oil have strong inhibitory to gram positive bacteria （Staphylococcus aureus）; cinnamon oil and masson pine essential oil have strong inhibitory to gram negative bacteria （E. coli）. Cinnamon essential oil has broad-spectrum antibacterial ability to fungi， gram-negative and positive bacteria， with the minimum inhibitory concentration by 0.039 1-0.156 0 L/mL. With strong inhibition effect on fungi， cinnamon oil can be used as a compound base oil， added other essential oils to retain freshness of blueberries， which can achieve better antibacterial and anti-corrosion effects.

Key words：plant essential oil; blueberry pathogen; bacteriostasis in vitro; screen

藍(lán)莓（Vaccinium Spp）學(xué)名越橘，屬于杜鵑花科越橘屬植物，因其果味獨特且含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、花青素和抗氧化物，被譽為“世界第三代水果之王”[1]。藍(lán)莓屬于漿果類，含水率高、果皮薄，鮮果特別容易受機(jī)械損傷和微生物侵染;同時，其果實成熟于高溫多水的夏季，采摘期比較集中，采后極不耐貯藏，常溫下放置2～4 d就開始腐爛變質(zhì)。這些因素對藍(lán)莓采后的貯藏、運輸及銷售產(chǎn)生了較大影響。

目前，藍(lán)莓的貯藏保鮮方法繁多，例如冷藏、輻照、氣調(diào)、涂膜、高壓靜電場等[2-6]，但利用天然植物源保鮮劑對藍(lán)莓進(jìn)行貯藏保鮮的研究鮮見報道。近年來，隨著人們對食品安全越來越關(guān)注，新型果蔬貯藏保鮮技術(shù)的研究也日益深入。植物精油作為天然植物提取物，含有抑制病原微生物、抗菌、抗炎、抗癌等生物活性成分[7-9]，具有顯著的抑菌活性和廣泛的抗菌譜范圍;同時，與化學(xué)抑菌劑相比，其副作用小、殘留毒性低，已成為當(dāng)下研究的熱點。試驗以椪柑、臍橙、丁香等10種植物為材料，從中提取植物精油，研究植物精油對藍(lán)莓貯藏保鮮過程中致腐病菌的抑制效果，以期為植物精油天然保鮮劑的開發(fā)提供理論

依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗精油 10種精油均為實驗室提取保存的樣本，均采用水蒸氣蒸餾法提取，提取部位見表1。

1.1.2 供試菌株 灰霉（Botrytis cinerea）、鏈格孢霉（Alternaria alternata）和指狀青霉（Penicillium digitatum），是從采后貯藏的藍(lán)莓果實中分離得到的3種主要病原真菌，均已經(jīng)過鑒定。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱）、PDB培養(yǎng)基（青島海博）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA（廣東環(huán)凱）、MH肉湯（青島海博）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將菌種在平板上復(fù)壯后，液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期。根據(jù)其生長曲線，細(xì)菌一般培養(yǎng)至對數(shù)生長期的時間約為8～10 h，真菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期的時間約為12～16 h [10]。挑取1接種環(huán)（φ=3 mm）對數(shù)期菌種于10 mL無菌生理鹽水中，旋渦振蕩器上振蕩混勻制成菌懸液。用平板計數(shù)法計數(shù)，（真菌同時用血球計數(shù)板計數(shù)[11]），用無菌水稀釋菌懸液，使細(xì)菌菌懸液濃度在106～107 CFU/mL之間，真菌菌懸液濃度在105 CFU/mL。

1.2.2 精油抑菌試驗（牛津杯法） 吸取200 μL菌懸液，注于NA培養(yǎng)基（真菌用PDA培養(yǎng)基）平板上，涂布均勻，每個平皿放置牛津杯[12]（內(nèi)徑6 mm，外徑7.8 mm，高10 mm）1～3個，往牛津杯中加入200 μL精油原液，以無菌生理鹽水作對照，36℃（真菌25℃），培養(yǎng)24 h（真菌培養(yǎng)2～10 d），測量抑菌圈直徑。每種精油重復(fù)3次試驗。抑菌圈試驗判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于20 mm，極敏;16～20 mm，高敏;11～15 mm中敏;8～10 mm，低敏;小于8 mm，不敏感[13]。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 取9支試管，編號1～9，每管加入MH肉湯（真菌用PDB）培養(yǎng)基3 mL（其中1號管加入6 mL）。往1號管中加入30 μL精油原液，漩渦混勻，然后二倍梯度稀釋，由此1～9號管的精油濃度分別約是5.000 0、2.500 0、1.250 0、0.625 0、0.313 0、0.156 0、0.078 1、0.039 1和0.019 5 μL/mL。向每個試管中加入菌懸液50 μL，以培養(yǎng)基+菌懸液作為陰性對照。細(xì)菌37℃培養(yǎng)24 h;真菌25℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液明顯渾濁的說明有菌生長，此濃度的精油無抑菌效果;透明清澈的說明無菌生長，此濃度的精油有抑菌效果;對于臨界情況可傾倒平板培養(yǎng)查看[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 10種植物精油的抑菌活性研究

從表2可以看出，大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）在精油抑菌試驗中表現(xiàn)出了低敏感度，對大腸桿菌有抑菌效果的精油只有4種，分別是椪柑、肉桂、黑胡椒、馬尾松;對金黃色葡萄球菌有抑菌效果的精油有7種，分別是椪柑、丁香、肉桂、百里香、迷迭香、黑胡椒、馬尾松;通常來講，革蘭氏陽性菌對植物精油的敏感性要大于革蘭氏陰性菌[15]。這是因為革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外側(cè)含有一層脂多糖，它能夠阻止疏水性的化合物進(jìn)入菌體細(xì)胞體內(nèi)，從而降低了精油的抑菌效果[16]。該試驗也驗證了這一規(guī)律，革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑普遍比革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑大將近1倍，椪柑、肉桂、黑胡椒、馬尾松等精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是12.1±0.1、21.5±1.0、24.9±0.7、30.8±0.8 mm，而對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為22.5±0.4、40.2±0.5、59.7±0.5、60.5±0.4 mm，均遠(yuǎn)大于大腸桿菌的抑菌圈直徑。濃度高于85%的精油對革蘭氏陽性菌的抑制效果達(dá)到極敏程度，而且較多的精油對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，卻對大腸桿菌無抑制效果。

從總體上看，植物精油對真菌的抑菌效果比對細(xì)菌的更好。10種植物精油中有6種精油對3種真菌均有抑制作用，其中肉桂、丁香、百里香、迷迭香等精油的抑真菌能力較強?？梢种浦笭钋嗝沟木陀?種，可抑制灰霉菌的精油有6種，值得一提的是幾乎所有的精油都對鏈格孢霉有不同程度的抑菌作用，而且鏈格孢霉對百里香、迷迭香、薄荷、肉桂極其敏感，整個平皿都無菌生長;另外，有將近70%的精油對真菌的抑制效果達(dá)到極敏程度。

2.2 植物精油的最小抑菌濃度研究

由圖1可知，對大腸桿菌有抑菌效果的4種精油中，其抑菌能力由強到弱依次為肉桂精油>馬尾松精油>黑胡椒精油>椪柑精油。肉桂對大腸桿菌的抑菌效果最為明顯，濃度為0.156 μL/mL時都還有明顯的抑菌效果;黑胡椒精油在濃度為0.625 μL/mL時有明顯抑菌作用，0.313 μL/mL濃度時有極少量菌生長，但仍然較為清澈;馬尾松精油在濃度0.313 μL/mL時有明顯抑菌效果，當(dāng)濃度為0.156 μL/mL時底部有少量沉淀狀渾濁;椪柑精油濃度為2.5 μL/mL時可明顯抑制大腸桿菌的生長，其余濃度均有渾濁。這也與表1的結(jié)果相一致。精油對金黃色葡萄球菌的抑制作用更明顯，這再次證明了革蘭氏陽性菌對植物精油的敏感性要大于革蘭氏陰性菌[15]。

由圖2可知，植物精油對真菌的抑菌效果比對細(xì)菌的更好。10種植物精油中有7種精油對3種真菌均有抑制作用，其余精油至少都能對2種真菌產(chǎn)生作用。其中，肉桂精油、丁香精油、八角精油、百里香精油等

均表現(xiàn)了較強的抑真菌能力。這表明植物精油對真菌的抑制較為廣泛和敏感，真菌不僅對多種植物精油有反應(yīng)，甚至對于低濃度精油仍然表現(xiàn)敏感，肉桂精油的濃度甚至只需要0.039 1 μL/mL就能完全抑制真菌。

3 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，植物精油對于革蘭氏陽性、陰性菌，特別是真菌等都有極好的抑制效果。與低溫、輻照、氣調(diào)、涂膜、高壓靜電場等防腐手段相比，利用植物精油防腐具有安全、環(huán)保、成本低、易操作、效果顯著等優(yōu)點。導(dǎo)致藍(lán)莓等水果腐敗的微生物多為真菌類群，根據(jù)真菌對植物精油敏感這一特性，研發(fā)以植物精油為原料的水果天然保鮮劑切實可行。肉桂精油對真菌以及革蘭氏陰性和陽性菌均有強烈抑制效果，具有較為廣譜的抑菌能力，最小抑菌濃度在0.039 1～0.156 0 μL/mL之間。同時，還可以用肉桂精油作為復(fù)配基油，添加其他精油應(yīng)用于藍(lán)莓的天然保鮮，以達(dá)到更好的抑菌防腐效果。該試驗研究為精油復(fù)配在藍(lán)莓等水果保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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