?牛糞堆肥纖維素高效降解菌的篩選和應(yīng)用?

摘 要：為解決牛糞堆肥過(guò)程中纖維素難以降解的難題，通過(guò)采用羧甲基纖維素篩選平板和剛果紅染色的方法，篩選得到了1株高效降解纖維素的細(xì)菌X7，其纖維素酶活達(dá)40.02±2.87 U/mL，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。將降解菌X7配合堆肥接種劑應(yīng)用于牛糞堆肥中，檢測(cè)其降解和堆肥促進(jìn)效果，結(jié)果表明：降解菌能提升堆肥溫度，使堆肥最高溫度達(dá)74℃，堆肥高溫期持續(xù)16 d;添加降解菌X7后堆肥結(jié)束時(shí)的腐殖質(zhì)總量達(dá)69.3 g/kg，有效提升了堆肥品質(zhì)，纖維素降解率為43.51%，對(duì)照組的降解率僅為11.57%。纖維素高效降解菌X7在牛糞堆肥及纖維素降解應(yīng)用方面有較大潛力。

關(guān)鍵詞：纖維素降解;細(xì)菌;牛糞堆肥;腐殖質(zhì);堆肥品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S182;X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）02-0050-04

The Screening and Application of Efficiently Cellulose Degradation Bacteria in Cow Dung Compost

HUANG Ying-jie1， 2，ZHOU Shang-feng1，LIU Zhen-yi1，YUE Yong-zhi1，LI Zu-ren1，

WU La-mei1，WANG Li-feng1， 2

（1. Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. The High School Attached to Hunan Normal

University， Changsha 410006， PRC）

Abstract：In order to solve the problem about cellulose degradation in the process of cow dung compost， the bacteria X7 which can efficiently degrade cellulose had been screened by the method of carboxymethyl cellulose filter plate and Congo red stain. The bacteriaX7 has a cellulose enzyme activity of 40.02±2.87 U/mL， which was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Degradation bacteria X7 and compost inoculum were applied in cow dung compost to detect their degradation and compost promotion effect. The result showed that the compost temperature raised up by degradation bacteria X7， the inoculating of X7 made the highest temperature of cow dung compost to 74 ℃，

with the compost temperature period for 16 days. At the end of compost， the humus extract totaled 69.3 g/kg after adding degradation bacteria X7 which can effectively improve the quality of the compost with the cellulose degradation rate 43.51%， while the degradation rate was only 11.57% in the control group. In conclusion， the bacteria X7 which can efficiently degrade cellulose have great potential applications in cow dung compost and cellulose degradation applications.

Key words：cellulose degradation; bacteria; cow dung compost; humus extract; composting "quality

隨著我國(guó)人口的增多和養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)集約化迅猛發(fā)展的趨勢(shì)[1]，在產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益的同時(shí)，也帶來(lái)了畜禽糞便廢棄物集中大量產(chǎn)生、難以快速處理的問(wèn)題。其中，大牧場(chǎng)化條件下的牛養(yǎng)殖所產(chǎn)生的牛糞對(duì)草場(chǎng)具有較強(qiáng)的破壞作用，牛糞若不及時(shí)清理和處理，非常容易使草場(chǎng)退化或引起疫病，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

高溫好氧堆肥是解決畜禽糞便較為經(jīng)濟(jì)有效的處理方法之一[3]，不僅能解決環(huán)境污染問(wèn)題，還能夠?qū)U棄物堆制成肥料或土壤調(diào)節(jié)劑從而產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。畜禽糞便經(jīng)過(guò)堆肥所制成的有機(jī)肥肥力強(qiáng)，對(duì)土壤改良作用[4]。在人工條件下通過(guò)添加外源菌劑可提高堆肥堆體中微生物數(shù)量，達(dá)到加速堆肥反應(yīng)進(jìn)程，縮短堆肥周期的效果，可使牛糞等畜禽糞便得到快速處理[5]。牛糞中含有大量未能消化的纖維素，且纖維素在堆肥過(guò)程中難以降解，有研究結(jié)果表明，木質(zhì)纖維素的降解是限制牛糞等畜禽糞便堆肥腐熟進(jìn)程，并影響其堆肥產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素[6]。因此，篩選纖維素高效降解菌添加入糞便堆肥中是提升堆肥技術(shù)、解決糞便帶來(lái)的污染問(wèn)題的有效途徑[7-8]。通過(guò)羧甲基纖維素鈉平板和酶活測(cè)定的方法篩選出具有高效降解纖維素能力的芽孢桿菌，并將降解菌接種于牛糞堆肥中，為牛糞堆肥接種菌劑的開(kāi)發(fā)和堆肥效率的提高提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)[9-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛糞（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供），水稻秸稈（湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供），堆肥接種劑（湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供）。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 DNS（3，5-二硝基水楊酸）試劑 將6.3 g 3，5-二硝基水楊酸和262 mL濃度為2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.2.2 磷酸緩沖液 稱取磷酸二氫鈉31.2 g，定容至1 000 mL，配置濃度為0.2 mol/L的A液;稱取磷酸氫二鈉71.63 g，定容至1 000 mL，配置0.2 mol/L的B液。

取A液43.5 mL和B液56.5 mL，混合均勻，pH計(jì)測(cè)定校正pH 值6.7±0.02。

1.2.3 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液 稱取CMC-Na

固體6.670 g，緩慢加入0.2 mol/L pH值6.7的磷酸緩沖液600 mL，邊加熱邊磁力攪拌直至全部溶解，冷卻后補(bǔ)加蒸餾水600 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.7，再以pH 值6.7磷酸緩沖液定容至1 000 mL，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取1.000 g分析純葡萄糖 （預(yù)先在105℃烘干至恒重），然后加水定容至1 L，即得1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 培養(yǎng)基配方

1.3.1 LB培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH值7.0～7.2 g/L;固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g/L。

1.3.2 纖維素篩選培養(yǎng)基 微晶纖維素鈉10.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH值7.2。

1.3.3 麩皮發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 麩皮3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，

用0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.7。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 纖維素高效降解菌篩選 從牛糞堆肥取樣10 g，放入裝有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在搖床上180 r/min 振蕩30 min，梯度稀釋，取稀釋液涂布在LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較快的細(xì)菌純化至新的LB平板中保藏。

將保藏的菌株用牛津杯法接種于纖維素篩選平板培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)2～3 d，通過(guò)1 mg/mL剛果紅溶液染色30 min，1 mol/L NaCL溶液清洗30 min，測(cè)定相應(yīng)水解圈直徑（D）。選擇水解圈大的菌株測(cè)定纖維素酶活。

纖維素酶活測(cè)定：酶活定義：1 mL粗酶液在pH值6.7，37℃條件下，1 min水解CMC-Na產(chǎn)生1 μg葡萄糖為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。操作方法參見(jiàn)QB2583—2003《纖維素酶制劑》中CMC-Na-DNS法測(cè)定纖維素酶活。

選擇纖維素酶活高菌株進(jìn)行菌種鑒定[11]，最終得到纖維素高效降解菌X7。

16S rDNA基因序列分析：細(xì)菌DNA提取按參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。以提取菌株的基因組為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，參照天根生化科技有限公司的DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，純化后的產(chǎn)物測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司的ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀完成。所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，利用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬[13]。

1.4.2 牛糞堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)CK、A、B共3 組。每組均用新鮮牛糞與稻草秸稈按體積比6∶4 進(jìn)行配比，C/N調(diào)節(jié)至25～30 之間，水分控制在55%左右，其中CK組為對(duì)照，接種0.5%無(wú)菌水;A組接種0.5%堆肥接種劑;B組接種0.25%堆肥接種劑和0.25%纖維素降解菌X7。

在堆肥的第1、4、7、11、18、21和25 d進(jìn)行翻堆，并于翻堆前采集樣品，整個(gè)堆肥周期為25 d。每次采樣分別從堆體的上、中和下部多點(diǎn)取樣，并測(cè)定溫度、有機(jī)質(zhì)含量、腐殖質(zhì)含量及纖維素降解率[14]，方法如下：

（1）溫度：將溫度計(jì)插入堆料中部，每天早上9：00點(diǎn)讀數(shù)，并記錄環(huán)境溫度;（2）有機(jī)質(zhì)：馬弗爐灼燒差重法;（3）全氮：濃H2SO4-H2O2消化凱氏定氮法（國(guó)標(biāo)NY 525—2012）;（4） 腐殖質(zhì)：采用0.1 mol/L焦磷酸鈉和0.1 mol/L氫氧化鈉浸提劑提取腐殖質(zhì)，腐殖質(zhì)在強(qiáng)堿性的介質(zhì)中具有極強(qiáng)的絡(luò)合能力，能將土壤中的難溶于水的結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)，一次結(jié)合成易溶于水的腐殖酸鈉鹽，從而比較完全地將腐殖質(zhì)浸出到溶液中來(lái)。浸出液測(cè)定其含碳量（%），作為腐殖質(zhì)含量[15];（5）纖維素降解率的測(cè)定：纖維素降解率的測(cè)定參照GB/T744—2004的測(cè)定方法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素高效降解酶篩選

以纖維素為底物的篩選培養(yǎng)基篩選纖維素降解菌，篩選部分結(jié)果如表1所示（只選擇降解圈較大的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定）。

結(jié)果表明：7株菌株有較高的纖維素降解能力，在羧甲基纖維素鈉篩選平板上的降解圈均達(dá)3 cm以上，其中菌株X7的降解能力最強(qiáng)，降解圈達(dá)6.09±0.26 cm，纖維素酶活達(dá)40.02±2.87 U/mL。故選擇菌株X7為最終篩選菌株，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化、保存和鑒定。

2.2 纖維素高效降解酶鑒定

將菌株X7的16S rDNA基因序列與Genebank的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（Blastn）結(jié)果如圖1所示，菌株X7同 Bacillus amyloliquefaciens（AB255669）的相似度達(dá)到99%。使用軟件mega4.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并結(jié)合各菌株菌落形態(tài)和生理生化特征，菌株X7分別被鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。

2.3 牛糞堆肥溫度變化

在堆肥開(kāi)始前，對(duì)堆肥原料：牛糞及水稻秸稈進(jìn)行含水率、有機(jī)碳、全氮、pH值進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算C/N，結(jié)果如表2所示。堆肥堆體C/N 應(yīng)調(diào)節(jié)至25～30 之間，水分控制在55%至65%左右[17]，計(jì)算得出新鮮牛糞與稻草秸稈應(yīng)按體積比6∶4 進(jìn)行配比。

根據(jù)溫度的變化，堆肥可分為升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期4個(gè)不同階段，高溫環(huán)境可使堆體中腐熟菌快速繁殖，使堆體有機(jī)質(zhì)降解速度加快，因此堆溫的變化決定了堆肥腐熟化進(jìn)程，是高溫堆肥腐熟的重要參數(shù)之一[18]。

牛糞堆肥溫度變化如圖2所示。在升溫階段，B組升溫最快，經(jīng)1 d時(shí)間溫度便以達(dá)到50℃以上，比A組和CK分別提前1 d和2 d;A和B堆體最高溫度分別達(dá)到71℃和74℃，而CK組堆體最高溫度僅為51℃，且A和B組高溫期持續(xù)時(shí)間為14 d和16 d;而CK組溫度在堆肥周期內(nèi)保持較低水平，其腐熟程度不完全;進(jìn)入降溫期，各試驗(yàn)組溫度下降明顯。堆肥接種劑對(duì)牛糞堆肥前期溫度有較強(qiáng)提升作用，能加快牛糞有機(jī)質(zhì)的降解，從而提升堆體溫度。在接種堆肥接種劑的基礎(chǔ)上接種纖維素降解菌可使牛糞中的纖維素快速降解，進(jìn)一步提升堆體溫度和有機(jī)質(zhì)降解速率。

2.4 腐殖質(zhì)含量

對(duì)堆肥樣品腐殖質(zhì)（humic extract，HE）總量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。在堆肥結(jié)束時(shí)，A處理的腐殖質(zhì)總量為53.81 g/kg，B處理的腐殖質(zhì)總量為69.3 g/kg，CK處理的腐殖質(zhì)總量為30.64 g/kg，表明試驗(yàn)所選用的堆肥接種劑有利于腐殖質(zhì)在牛糞堆肥降溫腐熟期的轉(zhuǎn)化聚合，所篩選的纖維素降解菌可有效降解牛糞堆肥堆體中的纖維素，有利于腐殖質(zhì)的累積和轉(zhuǎn)化。由于堆肥不完全，CK組腐殖質(zhì)含量最低，腐熟不完全;在纖維素降解菌和堆肥接種劑的共同作用下，B組處理的有機(jī)質(zhì)降解程度最高，難以降解的纖維素被分解轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，因此其腐殖質(zhì)總量最高，腐熟程度高使其堆肥物化產(chǎn)品肥效更好、價(jià)值更高[19]。

2.5 纖維素降解率的變化

對(duì)不同時(shí)間不同處理牛糞堆肥樣品纖維素含量變化進(jìn)行測(cè)定，纖維素降解率結(jié)果如圖4所示。由圖可知，盡管對(duì)照組CK沒(méi)有添加降解菌和堆肥接種劑，其堆體纖維素降解率仍有11.57%，這是由于堆肥堆體中含量土著微生物，對(duì)牛糞和水稻秸稈中的纖維素有一定降解效果;添加纖維素降解菌X7和堆肥接種劑使牛糞堆肥堆體纖維素降解率大幅提升，其中A處理添加堆肥接種劑使堆體纖維素降解率達(dá)24.29%，B處理添加堆肥接種劑和纖維素降解菌降解了堆肥堆體43.51%的纖維素。此外，纖維素降解在堆肥后期速度加快，這是由于纖維素降解酶在較低溫度下酶活高，在堆肥高溫期不能快速降解纖維素所致[20]。

3 結(jié) 論

研究采用羧甲基纖維素鈉篩選平板和剛果紅染色法從自然發(fā)酵的牛糞中獲得1株高效纖維素降解菌X7，經(jīng)鑒定菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。降解菌X7為增殖快、降解能力強(qiáng)的芽孢桿菌，其纖維素降解圈達(dá)6.09±0.26 cm，粗酶液纖維素酶活達(dá)40.02±2.87 U/mL，能快速降解纖維素，適用于牛糞等纖維素含量高的物料堆肥。接種纖維素降解菌X7后，牛糞堆肥堆體溫度與對(duì)照組相比大幅提高，最高溫度達(dá)到74℃，高溫期持續(xù)時(shí)間為16 d，而CK組堆體最高溫度僅為51℃;纖維素降解菌的添加使堆肥結(jié)束時(shí)的腐殖質(zhì)總量達(dá)69.3 g/kg，而CK處理的腐殖質(zhì)總量為30.64 g/kg，提升對(duì)牛糞堆肥品質(zhì);纖維素降解率的測(cè)定表明。添加降解菌X7的確是牛糞堆肥中的纖維素得到降解，其降解率為43.51%，對(duì)照組的降解率僅為11.57%。

研究篩選得到纖維素高效降解菌X7，并在牛糞堆肥中進(jìn)行了應(yīng)用，結(jié)果表明：降解菌在配合堆肥接種劑使用下，能有效提高堆肥溫度，加快堆肥進(jìn)程;在大幅提升纖維素降解的同時(shí)，提高了堆肥中腐殖質(zhì)的含量，從而提高堆肥品質(zhì)。

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