?一株產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的嗜酸紅假單胞菌的研究?

摘 要：為了檢驗(yàn)嗜酸紅假單胞菌合成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的能力，測定發(fā)酵液中5-ALA的含量，首先對5-ALA的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化;其次對嗜酸紅假單胞菌合成5-ALA的時(shí)間和產(chǎn)量進(jìn)行了試驗(yàn)，并對5-ALA在其發(fā)酵液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在Ehrlich’s試劑比色法的基礎(chǔ)上，采取70℃水浴顯色5 min，便能較好地滿足檢測要求;5-ALA的最佳合成時(shí)期處于菌株的對數(shù)生長期，5-ALA的產(chǎn)量最高可達(dá)50.2 mg/L;發(fā)酵液pH值為4.2，室溫避光保存可以使5-ALA在嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中穩(wěn)定保存。

關(guān)鍵詞：嗜酸紅假單胞菌;光合細(xì)菌;5-氨基乙酰丙酸

中圖分類號：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）02-0004-03

Study on 5-aminolevulinic Acid from Rhodopseudomonas Acidophila

WANG Zhong-yong1， 2， 3，CHENG Ju-e1， 2，LUO Yuan-hua1， 2， 3，LIU Yong1， 2，CHENG Fei-xue1， 2，ZHANG De-yong1， 2

（1. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 2. Hunan Key Laboratory of

Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops， Changsha 410125， PRC; 3. Changsha Agri

Bio-Sci-Technology Co.， Lit.， Changsha 410125， PRC）

Abstract：In order to test the ability of synthesizing 5-ALA by Rhodopseudomonas acidophila， and determine the content of 5-ALA in fermentation broth， we first optimized the test method of 5-ALA; secondly， the time and yield of 5-ALA synthesized from Rhodopseudomonas acidophila were tested， and the stability of 5-ALA in the fermentation broth was studied. The results showed that， on the basis of Ehrlich’s reagent colorimetric method， using 70 ℃ water bath to show color 5 min， it can meet the testing requirements well.

The optimal period of synthesis of 5-ALA was in the logarithmic growth period of the strain， and the highest yield of 5-ALA could reach 50.2 mg/L. The pH value of the fermentation broth is 4.2， and the room temperature preservation can keep 5-ALA stable in the fermentation broth of Rhodopseudomonas acidophila.

Key words： Rhodopseudomonas cidophila; hotosynthetic bacteria; 5- aminolevulinic acid

5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid，簡稱為5-ALA）作為生物體內(nèi)葉綠素、亞鐵血紅素、維生素B12等四吡咯化合物的前體物質(zhì)，為生物生命活動(dòng)所必須。5-ALA在生物可降解除草劑、殺蟲劑、肥料等方面具有較大的應(yīng)用潛力。研究表明，低濃度的5-ALA能夠提高作物抗逆性、促進(jìn)作物生長、提高產(chǎn)量，而較高濃度的5-ALA可殺滅多種雜草[1]。

鑒于5-ALA在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力，5-ALA的合成方法成為學(xué)者們爭相研究的課題，取得了一定的進(jìn)展，但是經(jīng)濟(jì)高效的合成途徑依然是阻礙其商業(yè)化應(yīng)用的最大障礙。其中，化學(xué)合成法的能耗和成本較高，合成產(chǎn)量卻低于60%;基因工程菌合成法還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，同樣需要添加昂貴的化學(xué)試劑，技術(shù)條件要求高，不適合商業(yè)化應(yīng)用[2]。微生物合成特別是利用光合細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)5-ALA，技術(shù)路線同常規(guī)微生物發(fā)酵相似，是比較理想的合成方法，也是現(xiàn)階段研究較多的合成途徑之一[3-5]。

嗜酸紅假單胞菌（Rhodopseudomonas acidophila）

為光能自養(yǎng)（光合細(xì)菌）紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）細(xì)菌，具備光合細(xì)菌的共有特性，因此也具備合成5-ALA的能力。同時(shí)，嗜酸紅假單胞菌的發(fā)酵技術(shù)條件要求不高，使用方便，為實(shí)現(xiàn)5-ALA的高效合成及其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的商業(yè)化應(yīng)用提供了有效途徑[6-7]。

研究對5-ALA經(jīng)典檢測方法的部分條件進(jìn)行了優(yōu)化，并探索了嗜酸紅假單胞菌合成5-ALA的過程及其在嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中的穩(wěn)定性條件，為含有5-ALA的嗜酸紅假單胞菌菌劑的穩(wěn)定保存及商業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供式菌株和試劑 嗜酸紅假單胞菌（Rhodopseudomonas acidophila）為實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定、保存[8];5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid，簡稱為5-ALA）標(biāo)樣購自美國Promega公司;常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析級試劑，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器 酶聯(lián)免疫儀（美國GEN公司）;nanoDrop紫外—可見光分光光度計(jì)（美國ThermoFisher公司）;移液槍（德國eppendorf公司）;水浴鍋（國產(chǎn)設(shè)備）。

1.1.3 培養(yǎng)基 PSB-1培養(yǎng)基：（NH）4SO4 1 g/L，CH3

COONa 1 g/L， Yeast Extract 2 g/L，自然pH值，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。乙酰丙酸鈣溶液經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾滅菌，使用前加入PSB-1培養(yǎng)基中，終濃度為1 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 5-ALA紫外-可見光分光光度檢測方法的優(yōu)化 5-ALA常規(guī)檢測依照Mauzerall等[9]1956年提出的Ehrlich’s試劑顯色、紫外-可見光分光光度法檢測，在此基礎(chǔ)上使用5-ALA標(biāo)樣配制了0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/L 5個(gè)濃度梯度，每組濃度梯度分別在50、60、70、80、90℃ 5個(gè)溫度中水浴15 min;水浴后冷卻至室溫，分別取2 mL添加等體積Ehrlich’s試劑分別顯色5、10、15 min;考察不同水浴溫度和不同顯色時(shí)間對5-ALA溶液吸光值的影響。具體的檢測方法和試劑參照文獻(xiàn)。

1.2.2 嗜酸紅假單胞菌的生長與5-ALA合成的關(guān)系 使用500 mL玻璃吊口瓶，裝PSB-1培養(yǎng)基450 mL，接種嗜酸紅假單胞菌新鮮菌種10 mL，置于普通日光燈下光照培養(yǎng)，每天于固定時(shí)間檢測培養(yǎng)基的OD600值和5-ALA的濃度，連續(xù)檢測記錄10 d。

1.2.3 5-ALA在嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中的穩(wěn)定性 由于嗜酸紅假單胞菌含有5-ALA水解酶基因，因此發(fā)酵過程中5-ALA在合成的同時(shí)也會被水解。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束停止光照后，菌體處于休眠狀態(tài)，此時(shí)發(fā)酵液中的5-ALA穩(wěn)定性主要受環(huán)境因素影響，因此穩(wěn)定性試驗(yàn)需額外添加標(biāo)準(zhǔn)5-ALA進(jìn)行。（1）發(fā)酵液pH值對5-ALA穩(wěn)定性影響：用磷酸緩沖液將嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液的pH值分別調(diào)整為4.2、6、7，添加5-ALA標(biāo)樣于裝有500 mL 發(fā)酵液的HDPE塑料瓶中（終濃度為4 g/L），充分溶解混合均勻，25℃避光保存10 d，每天檢測不同pH值發(fā)酵液中5-ALA的含量。（2）儲存溫度對5-ALA穩(wěn)定性影響：添加5-ALA標(biāo)樣于裝有

500 mL 發(fā)酵液的HDPE塑料瓶中（終濃度為4 g/L），充分溶解混合均勻，分別于10、20、25℃環(huán)境中避光保存，每天檢測各溫度處理的5-ALA含量，連續(xù)記錄10 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-ALA經(jīng)典檢測方法的優(yōu)化

5個(gè)濃度梯度處理組經(jīng)過不同溫度水浴后，分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，水浴溫度為70、80、90℃時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線與60℃時(shí)的重合（圖1），斜率不再增加，說明水浴溫度60℃已經(jīng)滿足檢測要求。

對顯色時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果（圖2）表明，顯色反應(yīng)5 min后，不同濃度5-ALA溶液的吸光度差值較明顯，區(qū)分效果較好;而隨著顯色時(shí)間的延長，不同濃度5-ALA溶液的吸光度差值越來越不明顯，顯色不穩(wěn)定。

2.2 嗜酸紅假單胞菌生長與5-ALA合成的關(guān)系

培養(yǎng)過程中測量了各生長階段的菌密度，繪制了菌生長曲線及對應(yīng)時(shí)期的5-ALA合成量。如圖3所示，5-ALA在菌對數(shù)生長期合成量最高，最高濃度為50.2 mg/L;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，5-ALA合成量降低同時(shí)逐漸被降解，培養(yǎng)到第9天時(shí)幾乎檢測不到5-ALA。

2.3 5-ALA在嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中的穩(wěn)定性

2.3.1 pH值對5-ALA的影響 從圖4中可以看出，發(fā)酵液pH值越低，5-ALA在發(fā)酵液中越穩(wěn)定;隨著pH值的增加，5-ALA降解得越快;當(dāng)發(fā)酵液pH值為4.2時(shí)，10 d后5-ALA降解了0.25 g/L，并從第四天開始趨于穩(wěn)定;當(dāng)發(fā)酵液pH值為8時(shí)，第8天就已經(jīng)檢測不到5-ALA。

2.3.2 儲存溫度對5-ALA的影響 由圖5可知，不同溫度對5-ALA的影響不明顯，當(dāng)儲存溫度為25℃，發(fā)酵液pH值為4.2時(shí)，10 d后5-ALA降解了0.4 g/L，并從第七天開始趨于穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 紫外-可見光分光光度檢測方法的優(yōu)化

與高效液相色譜檢測方法相比，紫外-可見光分光光度檢測方法具有操作簡單、技術(shù)設(shè)備要求不高、用時(shí)短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此目前5-ALA常采用Mauzerall等[9]1956年發(fā)明的Ehrlich’s試劑顯色紫外-可見光分光光度法進(jìn)行檢測。該方法是在pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中沸水浴15 min，使5-ALA與乙酰丙酮縮合，再使用Ehrlich’s試劑顯色15 min，在553 nm波長下檢測吸光值。

在沸水浴過程中，由于反應(yīng)液含有高濃度乙酸、乙酰丙酮等易揮發(fā)物質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)試管漲破、溶液泄漏等影響檢測準(zhǔn)確度的情況，當(dāng)一次檢測樣過多時(shí)，沸水浴也不是很安全。該研究在60、70、80、90℃條件下制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率沒有差別，標(biāo)曲完全重合，說明60℃已經(jīng)能夠滿足反應(yīng)要求，為謹(jǐn)慎起見，最終確定水浴溫度為70℃。而顯色時(shí)間以5 min的效果最佳，也便于實(shí)際操作。

3.2 菌體生長與5-ALA合成的關(guān)系

嗜酸紅假單胞菌合成5-ALA的高峰期處于對數(shù)生長期，這與Sato等[10]1985年提出的結(jié)論一致。由于嗜酸紅假單胞菌也含有5-ALA水解酶基因，因此5-ALA會隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，最終完全被降解。利用5-ALA在對數(shù)生長期合成這一特性，工藝上可以使用連續(xù)發(fā)酵技術(shù)，及時(shí)收集提取發(fā)酵液中的5-ALA，減少菌體5-ALA水解酶和環(huán)境因素對5-ALA的快速降解。

3.3 5-ALA在嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中的穩(wěn)定性

5-ALA在發(fā)酵液中除了有被菌水解酶降解的風(fēng)險(xiǎn)以外，其穩(wěn)定性還會受到發(fā)酵液pH值、溶氧、溫度、光照等因素的影響，其中pH值和溶氧的影響較顯著[11]。

該研究中使用的嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液在嚴(yán)格厭氧環(huán)境下發(fā)酵而成，排除了溶氧帶來的降解影響;工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵液產(chǎn)品使用HDPE塑料瓶灌裝在紙箱中保存，因此也排除了光照的影響;所以發(fā)酵液的pH值成為了影響5-ALA在發(fā)酵液中穩(wěn)定存在的一個(gè)最重要的因素。在pH值為4.2的嗜酸紅假單胞菌發(fā)酵液中，5-ALA能夠穩(wěn)定存在;隨著pH值的升高，5-ALA的降解速度加快;當(dāng)pH值為4.2時(shí)，10、20、25℃這3個(gè)溫度環(huán)境中的5-ALA降解不顯著。這表明酸性、室溫的條件有利于5-ALA在發(fā)酵液中長期保存。以上結(jié)論與范理[11]提出的結(jié)論也是一致的。

由于嗜酸紅假單胞菌的厭氧發(fā)酵特性，在菌對數(shù)生長期發(fā)酵液的pH值和菌水解酶是分解5-ALA的主要因素。如果通過技術(shù)手段敲除菌體中5-ALA的水解酶基因，再采取連續(xù)發(fā)酵的方式，可獲得含高濃度5-ALA的發(fā)酵液，進(jìn)一步將發(fā)酵液pH值調(diào)整至4.2，于HDPE塑料瓶中避光保存，便能獲得5-ALA高含量的嗜酸紅假單胞菌菌劑，這為解決5-ALA低成本商業(yè)化應(yīng)用的瓶頸提供了新思路。

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