Thermoascus aurantiacus產(chǎn)耐熱木聚糖酶水解活性的培養(yǎng)條件優(yōu)化

■管國強(qiáng) 方 華 王美娟 畢 芳 崔鳳杰* 孫中超 朱校適 郭子好

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇鹽城源耀生物科技有限公司，江蘇鹽城224000；3.北京中醫(yī)大學(xué)東方學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床教研室，河北廊坊065001）

嗜熱細(xì)菌和真菌是潛在的生產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株[4-5]。如熱袍菌屬的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)可產(chǎn)生分子量分別為120 000和40 000的耐熱β-1,4-木聚糖酶[6]。另外，嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilium）、嗜熱棉毛菌（Thermomyces lanuginosus）、嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）和嗜熱側(cè)孢霉（Thermophilic sporotrichum）等嗜熱真菌也已被證實可產(chǎn)耐熱木聚糖酶[7-8]。通常，營養(yǎng)成分（如培養(yǎng)基的組成、濃度水平等）和培養(yǎng)條件（如發(fā)酵溫度、時間、接種量、通氣、攪拌等）直接影響真菌木聚糖酶的表達(dá)和分泌[9]。因此，為提高嗜熱真菌產(chǎn)酶水平，了解菌株生長和產(chǎn)酶效率之間的關(guān)系，需對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。在木質(zhì)纖維素原料中，由于木聚糖酶與半纖維素木聚糖分子間存在著空間位阻，使得木聚糖酶與底物不能充分接觸，當(dāng)同時存在纖維素酶與木聚糖酶時，木聚糖酶的空間阻礙明顯減小，因此可顯著提高半纖維素的水解效率[10]。

目前國內(nèi)外關(guān)于嗜熱子囊菌產(chǎn)木聚糖酶的文獻(xiàn)主要集中在其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化與控制等方面。例如，Jain等[11]在德里大學(xué)南校區(qū)土壤中篩選得到T.aurantiacusRCKK，在優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)條件下，CMC酶活、FPA、β-葡萄糖苷酶酶活和Xyn酶活均達(dá)到最大值，分別為88、15.8、25.3 U/g和6 543 U/g。周秀梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，T.aurantiacus的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Xyn最大活性可達(dá)10 321 U/g；而龐宗文等[13]篩選到T.aurantiacusQS7-2-4在優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵條件下，Xyn活性達(dá)到27 952 U/g。

本課題組前期采用稀釋涂布、剛果紅染色以及胞外酶活測定等步驟篩選到產(chǎn)耐熱木聚糖酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、ITS序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹等分析確定其為嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacusCGMCC11334）[14-15]，并單因素實驗優(yōu)選其產(chǎn)木聚糖酶的條件為：初始pH值4.5、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)溫度45℃、培養(yǎng)時間8 d。然而，關(guān)于嗜熱子囊菌深層發(fā)酵產(chǎn)耐熱木聚糖酶及其水解能力的條件仍需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。因此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用正交實驗和主成分分析構(gòu)建綜合水解能力指數(shù)，并優(yōu)化所產(chǎn)木聚糖酶最大水解玉米芯能力時的培養(yǎng)基組成，以期為獲得最大化產(chǎn)酶條件及其應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)物水解生產(chǎn)寡聚木糖等方面提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

T.aurantiacusCGMCC11334由江蘇大學(xué)生物工程研究所選育，專利保存中國普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖15.0、小麥蛋白胨4.0、KH2PO41.0、Na2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、微量元素1.0 ml/l[微量元素營養(yǎng)液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、Mn-SO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]，自然pH值。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/l）：麩皮10.0、小麥蛋白胨1.0、酵母膏1.0、KH2PO42.0、CaCl20.3、(NH4)2SO41.4、MgSO4·7H2O 0.3、吐溫-80 1.0 ml，微量元素1.0 ml/l[微量元素營養(yǎng)液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、MnSO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]。

1.2 培養(yǎng)方法

T.aurantiacus經(jīng)活化后，切取5 mm×5 mm的新鮮菌塊置于PDA培養(yǎng)基上，于45℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；接入5塊5 mm×5 mm菌塊于種子培養(yǎng)基（裝液量為100 ml/250 ml）中，45 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，制得種子液；將種子液按10%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床（45℃，180 r/min）培養(yǎng)8 d。

1.4 正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果[14-15]，選取麩皮、微晶纖維素、牛肉浸膏、玉米漿、小麥蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、FeSO4和VB1作為自變量，設(shè)計一個10因素5水平共50組實驗的正交實驗表L50(510)，分別測定Xyn、FPA、CMC活性和總的還原糖得率，實驗設(shè)計的因素水平見表1，采用正交實驗設(shè)計助手和SPSS17.0對正交實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 實驗設(shè)計的因素水平(g/l)

1.5 分析方法

1.5.1 酶活測定

FPA活性的測定[16]。設(shè)空白組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液；底物對照組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液+50 mg濾紙條；酶對照組：1.0 ml pH值4.8的緩沖液+0.5 ml粗酶液；實驗組：1.0 ml pH值4.8的緩沖液+50 mg濾紙條+0.5 ml粗酶液。將空白組、對照組和實驗組同時放入50oC水浴鍋中保溫60 min，反應(yīng)結(jié)束后，立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫。取0.2 ml反應(yīng)物加2.5 ml水稀釋，在540 nm處測吸光度值，用空白組調(diào)零。

CMC酶活的測定。設(shè)空白組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液；底物對照組：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml pH值4.8的緩沖液；酶對照組：0.5 ml酶液+1.0 ml pH值4.8的緩沖液；實驗組：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml酶液。將底物對照組、酶對照組和實驗組三組試管同時放入50oC水浴鍋中水浴30 min，水浴結(jié)束后，立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫。取0.2 ml混合物加2.5 ml水稀釋，然后在540 nm處測吸光度值，用空白管調(diào)零。

Xyn活性的測定[17]。設(shè)空白組：2.0 ml pH值5.3的緩沖液；底物對照組：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml pH值5.3的緩沖液；酶對照組：1.0酶液+1.0 ml pH值5.3的緩沖液；實驗組：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml粗酶液；將底物對照組、酶對照組和實驗組3組試管同時置于50℃水浴30 min，水浴結(jié)束后。立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至25 ml。然后在540 nm處測吸光度，用空白管調(diào)零。

在一定的溫度及pH值條件下，每毫升酶液，每分鐘水解相應(yīng)底物，產(chǎn)生1 μmol還原糖（葡萄糖/木糖），定義為一個酶活力單位(U)。

1.5.2 糖得率的測定

甜玉米（黃色）購自江蘇旅游超市（鎮(zhèn)江江大店），去除籽粒，將玉米芯置于60℃的烘箱中烘至恒重，用小型的粉碎機(jī)將烘干后的玉米芯粉碎，過40目篩保存?zhèn)溆谩＝?jīng)測定[18]，玉米芯含有38%的半纖維素，35%的纖維素，22%的木質(zhì)素以及少量的灰分。

發(fā)酵液水解玉米芯糖得率的測定步驟主要包括：將粉碎后的玉米芯在60℃的熱水中浸泡12 h，使其充分的溶脹，取殘渣烘干；將烘干的玉米芯按1∶25（w/v）加入水解反應(yīng)體系（24 ml pH值5.3的檸檬酸鹽緩沖液和1.0 ml酶液），于50 ℃、200 r/min反應(yīng)4 h；采用DNS法測定上清液中還原糖的含量（以木糖計，mg/ml）[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗的數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，采用Excel 2007統(tǒng)計分析軟件處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示；利用Origin 8.6繪制曲線。

2 .結(jié)果與分析

2.1 主成分提取法構(gòu)建木聚糖酶綜合水解能力指數(shù)

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計了以麩皮、微晶纖維素、牛肉浸膏、玉米漿、小麥蛋白胨、KH2PO4、Mg-SO4、CuSO4、FeSO4和VB1等10個因素為自變量，Xyn、CMC和FPA酶活這3個指標(biāo)為因變量的正交實驗L50(510)，實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果L50(510)

表2 （續(xù)） 正交實驗結(jié)果L50(510)

玉米芯的主要成分包括木聚糖、纖維素和少量的木質(zhì)素。纖維素的水解可以增加木聚糖酶和木聚糖的接觸面積，同時降低纖維素對木聚糖酶的非反應(yīng)性吸附，從而增加木聚糖的水解，因此在制備高活性的木聚糖酶時，同時適當(dāng)增加纖維素酶的活性有利于提高以玉米芯為底物的還原糖得率。下面以Xyn、CMC和FPA酶活性及其交互作用為變量，采用主成分提取法構(gòu)建木聚糖酶綜合水解能力指數(shù)（XCHI）。

首先利用SPSS軟件對三種酶的獨(dú)立作用及交互作用等9個變量進(jìn)行相關(guān)性分析，得到各變量之間的相關(guān)系數(shù)矩陣。由表3可知，有多個變量間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，因此可以進(jìn)行主成分分析，對9個變量進(jìn)行縮減。

表3 變量間相關(guān)系數(shù)矩陣

為了進(jìn)一步確證主成分分析的可行性，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了KMO檢驗和Bartlett球形度檢驗。由表4可知，取樣足夠度的Kaiser-Meyer-Olkin，KMO值為0.774，大于0.7；Bartlett球形度檢驗結(jié)果顯示，近似卡方值為1 043.246，說明取樣量充足，差異極顯著(P＜0.01)，這兩項檢驗結(jié)果證明這9個變量間存在著相關(guān)關(guān)系，因此適合做主成分分析。

表5顯示有3個主成分的特征根大于1，因此可以提取三個主成分，這三個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到98.821%，因此說明這三個主成分的解釋率達(dá)到98.8%。

表4 KMO和Bartlett檢驗

表5 因子的特征值與累積貢獻(xiàn)率

經(jīng)過方差最大正交旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣見表6。旋轉(zhuǎn)后，矩陣結(jié)構(gòu)簡化，含義明確。主成分1主要用于解釋Xyn、CMCXyn、FPAXyn和XynXyn；主成分 2在CMC、FPACMC、CMCXyn和CMCCMC上有較大的載荷；而主成分3則可以用來代替FPA和FPAFPA的作用，說明提取的這三個主成分完全可以用來解釋9個變量。

表6 旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣

根據(jù)成分得分系數(shù)矩陣（表7），可得到每個主成分的方程式：

其中，X1是指FPA酶活的作用，X2指CMC酶活的作用，X3指Xyn酶活的作用，X4指FPA酶活與CMC酶活間的交互作用，X5指FPA酶活與Xyn酶活間的交互作用，X6指CMC酶活與Xyn酶活間的交互作用，X7指FPA酶活內(nèi)部的交互作用，X8指CMC酶活內(nèi)部的交互作用，X9指Xyn酶活內(nèi)部的交互作用。

根據(jù)每個主成分的貢獻(xiàn)率以及總的貢獻(xiàn)率可得到關(guān)于綜合水解能力的方程XCHI=(66.848×F1+18.762×F2+13.217×F3)/98.821=0.676×F1+0.190×F2+0.134×F3。將每組實驗得到的9個變量的數(shù)值代入方程即可用XCHI表示。

表7 成分得分系數(shù)矩陣

2.2 XCHI適用性驗證

為了檢驗XCHI的適用性，實驗以XCHI為自變量，發(fā)酵液水解玉米芯的總還原糖得率為因變量，進(jìn)行回歸分析（見表8）。模型擬合的結(jié)果見表9，相關(guān)系數(shù)R為0.937，說明綜合水解能力A可以很好的解釋最終的總還原糖得率，解釋率高達(dá)97.3%。R2與調(diào)整R2的值很接近，分別為0.878和0.873，說明模型擬合的較好。

方差分析結(jié)果見表10，F(xiàn)值為169.119，P＜0.05，說明該回歸模型達(dá)到極顯著水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表8 綜合水解能力

表9 模型的構(gòu)建

表10 擬合模型方差分析結(jié)果

表11 模型中各系數(shù)的檢驗結(jié)果

由表11可知，常數(shù)項和各系數(shù)項均顯著，最終得到糖得率與綜合水解能力XCHI的回歸方程，Y=10.824+0.032XCHI+(-7.328×106)XCHI2，而二次項系數(shù)極小，因此可以忽略。該結(jié)果說明XCHI可以作為指數(shù)用于優(yōu)化木聚糖酶水解玉米芯能力的綜合指數(shù)。

2.3 以XCHI為指標(biāo)優(yōu)化合成最大木聚糖酶活性的最適條件(見表12)

驗證結(jié)果表明，建立的模型具有良好的可行性。因此，以XCHI為響應(yīng)值，對50組正交實驗進(jìn)行直觀分析，得到10個因素的影響力大小依次為D＞A＞J＞F＞E＞G＞H＞B＞C，確定木聚糖酶水解活性最大的培養(yǎng)基組成為A5B2C5D4E5F3G5H1I2J4，即麩皮16 g/l、微晶纖維素7 g/l、牛肉浸膏4 g/l、玉米漿3 g/l、小麥蛋白胨4 g/l、KH2PO41.0 g/l、MgSO42.0 g/l、CuSO40.00 g/l、FeSO40.05 g/l、VB10.15 g/l。在優(yōu)化的條件下，Xyn、CMC和FPA的酶活分別為135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml；分別比優(yōu)化前提高了291.3%、33.8%和165.4%，經(jīng)計算XCHI為1 649.44。

表12 綜合水解能力的直觀分析

3 結(jié)論

本文利用單因素實驗優(yōu)選了耐熱菌株產(chǎn)木聚糖酶的條件，在此基礎(chǔ)上，比較系統(tǒng)地采用正交實驗和主成分分析構(gòu)建綜合水解能力指數(shù)和優(yōu)化所產(chǎn)木聚糖酶最大水解玉米芯能力時的培養(yǎng)基組成為（g/l）：麩皮16、微晶纖維素7、牛肉浸膏4、玉米漿3、小麥蛋白胨4、KH2PO41.0、MgSO42.0、CuSO40.00、FeSO40.05 和VB10.15。在此條件下，Xyn、CMC和FPA的活性分別為135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml，XCHI為1 649.44，為獲得最大化產(chǎn)酶條件及其應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)物水解生產(chǎn)寡聚木糖等方面提供一定的技術(shù)支持。