重癥甲型H1N1流感患者核酸檢測(cè)和特異性抗體檢測(cè)的診斷價(jià)值分析

張群 劉超 李蕾

【摘 要】 目的：探討重癥甲型H1N1流感患者中流感病毒核酸檢測(cè)和特異性抗體檢測(cè)的診斷價(jià)值。方法：2016年3月～2018年4月 期間流感實(shí)驗(yàn)室收集的40例重癥甲型H1N1流感病例血清和鼻咽拭子標(biāo)本，并采用血凝抑制法和巢式RT-PCR對(duì)患者血清中特異抗體及鼻咽拭子中流感病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：急性期和恢復(fù)期血清效價(jià)比較，抗體差異顯著。25%患者兩種方法檢測(cè)均表現(xiàn)為陽(yáng)性，45%患者兩種檢測(cè)方法均表現(xiàn)為單獨(dú)抗-甲型H1N1陽(yáng)性，30%患者均表現(xiàn)為單獨(dú)甲型H1N1RNA陽(yáng)性；甲型H1N1流感病例血清中特異性抗體，發(fā)病時(shí)間越長(zhǎng)陽(yáng)性檢出率越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，在發(fā)病早期更容易檢出流感病毒的RNA，差異明顯。結(jié)論：核酸檢測(cè)與特異性抗體檢測(cè)結(jié)合使用有助于提高流感病例檢測(cè)準(zhǔn)確性，提高治療效果。

【關(guān)鍵詞】 甲型H1N1流感；流感病毒；特異性抗體；RNA；診斷價(jià)值

【中圖分類號(hào)】 R365 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）17-044-02

一般流感病毒不同，甲型H1N1流感經(jīng)禽流感、豬流感、人流感三種病毒重組，屬于新型的流感病毒[1]。本文旨在探討重癥甲型H1N1流感患者中甲型H1N1流感病毒RNA和特異性抗體的診斷價(jià)值，收集40例重癥甲型H1N1流感病毒患者為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月～2018年4月期間流感參比實(shí)驗(yàn)室收集的40例甲型H1N1流感病例，所有病例均符合《甲型 H1N1流感診療方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)，男25例，女15例，年齡15～76歲，平均年齡（45.5±4.2）歲，其中14例病例伴隨著基礎(chǔ)疾病，4例病例為孕產(chǎn)婦。

1.2 檢測(cè)方法 使用生理鹽水對(duì)鼻咽拭子進(jìn)行稀釋，再吸取0.5ml放置在無菌管中，保存在-20℃環(huán)境中，如有使用需求，需提前30分鐘標(biāo)本放入95℃水中進(jìn)行滅活，才能提取RNA。靜脈血液樣本離心2小時(shí)內(nèi)，必須進(jìn)行血清分離，保存在4℃環(huán)境中，并在一周內(nèi)檢測(cè)甲型 H1N1流感特異性抗體。檢測(cè)試劑選用Promgeag公司的AMV Erverse Transcriptase，TaKaRa 寶生物工程（大連）公司的Dntp和Ex Taq DNA聚合酶，上海生物工程有限公司的總RNA提取試劑盒，Sigma公司的受體破壞酶以及長(zhǎng)春生物制品研究所的甲型 H1N1流感標(biāo)準(zhǔn)抗原。采用巢式RT-PCR技術(shù)對(duì)鼻咽拭子樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，通過A型流感通用物MP1、MP2、ANP1、ANP2及甲型H1N1流感特異性鑒定引物 H1HAP1、H1HAP2鑒定PCR擴(kuò)增。采取血凝抑制法對(duì)血清樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，使用受體酶按4：1比例加入血清中，將血清樣本水浴（37℃）14小時(shí)，再放置滅活（56℃）30分鐘，配置4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位/25ul抗原，將微量板中加入PBS，每個(gè)孔25ul，在第一例微量板中加入處理好的血清25ul，按照倍比稀釋依次進(jìn)行添加，最后一個(gè)孔空留，加入4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位/25ul抗原，并在溫室放置20分鐘進(jìn)行孵育，每個(gè)孔加入新鮮雞蛋紅細(xì)胞懸液（0.75%），再孵育30分鐘后觀察結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定 甲型H1N1 RNA陽(yáng)性病例對(duì)最后1次陽(yáng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，抗-甲型H1N1陽(yáng)性病例對(duì)最早1次陽(yáng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件對(duì)本次研究數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示計(jì)量資料；以百分比表示計(jì)數(shù)資料，P<0.05時(shí)提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲型H1N1流感病毒病例血清檢測(cè)結(jié)果 40例甲型H1N1流感病毒血清樣品檢測(cè)表明，所有抗體>1：320，抗體有效價(jià)>1：5120樣品19份，特異性抗體陽(yáng)性，28例，陽(yáng)性檢出率70.00%，急性期和恢復(fù)期血清效價(jià)比較，抗體差異顯著。25%病例兩種方法檢測(cè)均表現(xiàn)為陽(yáng)性，45%病例兩種檢測(cè)方法均表現(xiàn)為單獨(dú)抗 -甲型H1N1陽(yáng)性，30%病例均表現(xiàn)為單獨(dú)甲型H1N1RNA陽(yáng)性。

2.2 不同時(shí)間陽(yáng)性檢出率分析 甲型H1N1流感病例血清中特異性抗體，發(fā)病時(shí)間越長(zhǎng)陽(yáng)性檢出率越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，在發(fā)病早期更容易檢出流感病毒的RNA，差異明顯，詳見表1.

3 討論

甲型H1N1流感屬于急性呼吸道疾病，主要由甲型H1N1流感病毒所致，好發(fā)于青少年群體[2]。該疾病具有一定的傳染性，且潛伏期較長(zhǎng)，主要通過飛沫、體液、分泌物、鼻腔、口腔、眼睛黏膜直接或間接傳播。發(fā)病后病例出現(xiàn)發(fā)熱、咽喉疼痛、渾身乏力、酸痛、惡心、嘔吐、腹瀉、咳嗽咳痰等臨床癥狀，嚴(yán)重者甚至引起肺炎、肺出血、呼吸窘迫綜合征、腎功能衰竭等并發(fā)癥[3]。由于甲型H1N1流感病毒中NP蛋白和M蛋白含量較高，且保守性好，因此，甲型H1N1流感檢查時(shí)可作為通用引物進(jìn)行鑒定。而血凝素HA變異性較高，可作為特異性鑒定引物。國(guó)外相關(guān)資料研究結(jié)果表明[4]，HIV感染會(huì)破壞患者自身免疫系統(tǒng)，繼而感染甲型 H1N1流感病毒，感染7天后對(duì)患者采取RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性率為29%，且患者體內(nèi)血清特異性抗體滴度均處于低下水平。如患者在14～30天后RT-PCR檢測(cè)血清特異性抗體滴度仍處于低下水平時(shí)，可能與患者基礎(chǔ)疾病所服免疫抑制藥物有關(guān)。因此，在甲型 H1N1流感診斷過程中，如患者自身免疫力較低，應(yīng)將隔離期限適當(dāng)延長(zhǎng)，直至核酸檢測(cè)表現(xiàn)為陰性時(shí)方可解除隔離，以免造成疾病傳播。

為提高甲型 H1N1流感病毒檢驗(yàn)準(zhǔn)確率，可將核酸檢測(cè)和血清傳播結(jié)合使用，前期采取核酸檢測(cè)，后期采取血清檢測(cè)，這種有助于提高臨床檢驗(yàn)準(zhǔn)確性，提高治療效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 李玉香，汪楊，鮑萬國(guó)等.重癥甲型 H1N1流感病毒基因與特異性抗體檢測(cè)的診斷意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，（12）：2641-2643.

[2] 李玉香，汪楊，高玉偉等.甲型H1N1流感病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2016，（8）：1098-1100.

[3] 白志軍，吳新偉，伍業(yè)建等.廣州地區(qū)新型甲型H1N1流感患者病毒RNA檢出率與病程關(guān)系的研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，29（11）：2313-2315.

[4] 王文靜，何菡，趙秀英等.甲型H1N1流感患者血液與尿液樣本病毒核酸檢測(cè)與分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，20（6）：805-806.