多發(fā)性骨髓瘤患者Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)及臨床意義

鄒 健， 孫麗華， 范小紅， 孟亞紅， 王雪蓮， 化范例， 程韻楓

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科，上海 201700

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種惡性漿細(xì)胞病，多見(jiàn)于中老年人群。近年來(lái)，隨著人口老齡化，每年新增病例呈逐年上升趨勢(shì)[1]。MM患者存在免疫系統(tǒng)的多種缺陷，且患者的免疫功能缺陷是該病的一個(gè)重要特征并影響其疾病進(jìn)展。MM患者T細(xì)胞的數(shù)量和功能都存在異常[2]。較早期的研究[3-4]已顯示，MM患者CD4/CD8細(xì)胞比值降低，與疾病進(jìn)展相關(guān)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞(Thl7)是重要CD4+T細(xì)胞亞群，在多種疾病中發(fā)揮重要作用[5]。其中，Treg細(xì)胞可抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)，特異性的轉(zhuǎn)錄因子為Foxp3；Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用仍有爭(zhēng)議[2,6]，特異性轉(zhuǎn)錄因子為維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt (retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt )。這兩種細(xì)胞在分化發(fā)育中相互制衡，兩者平衡在維持免疫穩(wěn)定及抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用。本研究通過(guò)檢測(cè)MM患者不同時(shí)期外周血及骨髓中Treg細(xì)胞和Thl7細(xì)胞的比例及其特異性轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)水平，分析Treg細(xì)胞、Thl7細(xì)胞在MM各期的變化，及其與C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的關(guān)系，進(jìn)而進(jìn)一步分析Treg、Th17平衡在MM發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2015年6月至2017年11月收治的MM患者46例，診斷均符合2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》[7]中的標(biāo)準(zhǔn)。46例患者中，男性26例、女性20例，年齡45～78歲，中位年齡59歲。初發(fā)20例、平臺(tái)期16例、復(fù)發(fā)10例；ISS分期Ⅰ期10例、Ⅱ期16例、Ⅲ期20例；免疫分型IgG型23例、IgA型11 例、輕鏈型7例、其他5例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

按照《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》[7]，20例初發(fā)患者接受硼替佐米為基礎(chǔ)的化療方案；10例復(fù)發(fā)患者中，復(fù)發(fā)前接受硼替佐米(n=8)或沙利度胺(n=2)為基礎(chǔ)的方案，復(fù)發(fā)后接受硼替佐米(n=7)或來(lái)那度胺為基礎(chǔ)的方案(n=3)。另選擇行骨髓檢查的健康者20例為對(duì)照組，其中男性11例、女性9例，年齡40～70歲，中位年齡55歲，均排除近期感染、腫瘤、自身免疫性疾病或傳染性疾病。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)采集 每例對(duì)象無(wú)菌抽取靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲取PBMCs：取MM患者或健康志愿者外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝；15 mL離心管中加入3 mL Ficoll液，同時(shí)將外周血以2倍HBSS稀釋?zhuān)又罠icoll液面之上，1 000×g離心15 min；吸取PBMCs層，以10 mL HBSS洗滌2次(300×g離心10 min)后，置于1 mL含有10%DMSO的新生牛血清中-80℃過(guò)夜，液氮中保存，待測(cè)。骨髓血(2 mL)單個(gè)核細(xì)胞采集法同上。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞數(shù)

1.3.1 Treg細(xì)胞 調(diào)整上述采集的細(xì)胞濃度為1×106/100 μL，加入20 μL CD4 PE-Cy5/CD25 PE抗體(BD Biosciences, 批號(hào)：555348/562525)，混勻后室溫、暗室孵育20 min，細(xì)胞染色緩沖液洗滌1次后以250×g離心5 min，棄上清；加入1 mL Foxp3破膜固定緩沖液，混勻后室溫、暗室孵育20 min，以250×g離心5 min，棄上清；細(xì)胞染色緩沖液洗1次，1 mL FOXP3破膜緩沖液洗滌2次，250×g離心5 min，棄上清；100 μL FOXP3破膜緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Alexa Fluor○R488 FOXP3抗體(BD Biosciences, 批號(hào)：560047)或5μL Alexa Fluor○R488小鼠IgG1 k同型對(duì)照(BD Biosciences, 批號(hào)：557721)，室溫、暗室孵育30 min；細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，以0.5 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 Th17細(xì)胞 調(diào)整上述采集的細(xì)胞濃度為(0.5～1)×106/100 μL，加入0.5 mL固定緩沖液，混勻后室溫、暗室孵育20 min，以350×g離心5 min，棄上清；加入2 mL破膜緩沖液，混勻后室溫、暗室孵育20 min，以350×g離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。100 μL破膜緩沖液重懸細(xì)胞，加入20 μL Alexa Fluor○R647小鼠IgG1 k同型對(duì)照/CD3-FITC/CD4-PE抗體(BD Biosciences, 批號(hào)：555339/562281)或IL-17 Alexa Fluor○R647/CD3-FITC/CD4-PE抗體，室溫、暗室孵育30 min，2 mL破膜緩沖液洗滌2次，0.5 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及RORγt mRNA

的表達(dá)水平 PBMCs于37℃水浴復(fù)蘇后，HBSS洗滌，取(1～2)×106個(gè)細(xì)胞，加入1 mL Trizol，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。檢測(cè)RNA純度及濃度，取1 μg RNA的液體量，配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，37℃ 15 min、85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。取cDNA 1 μL，配制qRT-PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃擴(kuò)增5s，60℃延伸30 s；共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，記錄Ct值，計(jì)算相對(duì)RNA含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率及Treg/Th17比值比較 結(jié)果(表1)表明：初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組Treg細(xì)胞比率較正常對(duì)照組及平臺(tái)期組升高(P<0.05)，Th17細(xì)胞比率無(wú)明顯改變；初發(fā)組與復(fù)發(fā)/難治組間Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組Treg/Thl7比值較正常對(duì)照組及平臺(tái)期組升高(P<0.05)。

2.2 各組骨髓Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率及Treg/Th17比值比較 結(jié)果(表2)表明：初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組Treg細(xì)胞比率較正常對(duì)照組及平臺(tái)期組升高(P<0.05)，Th17細(xì)胞比率無(wú)明顯改變；初發(fā)組與復(fù)發(fā)/難治組間Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組Treg/Th17比值較平臺(tái)期組及正常對(duì)照組Treg/Th17比值升高(P<0.05)。

表1 各組外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率及Treg/Thl7比值比較

*P<0.05與正常對(duì)照組相比；△P<0.05與平臺(tái)期組相比

表2 各組骨髓Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率及Treg/Thl7比值比較

*P<0.05與正常對(duì)照組相比；△P<0.05與平臺(tái)期組相比

2.3 各組外周血及骨髓中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平 結(jié)果(表3)表明：外周血及骨髓中，初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組患者Foxp3較平臺(tái)期組和正常對(duì)照組升高(P<0.05)；初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組RORγt mRNA略高于平臺(tái)期組及正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 血清IL-6、CRP水平與Treg/Th17比值的相關(guān)性 結(jié)果(表4)表明：初發(fā)組及復(fù)發(fā)/難治組血清IL-6、CRP水平較平臺(tái)期組和正常對(duì)照組升高(P<0.05)，與外周血及骨髓Treg/Th17比值變化趨勢(shì)一致。

表3 各組外周血及骨髓中Foxp3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)水平的比較

*P<0.05與正常對(duì)照組相比；△P<0.05與平臺(tái)期組相比

表4 各組血清IL-6、CRP水平比較

*P<0.05與正常對(duì)照組相比；△P<0.05與平臺(tái)期組相比

3 討 論

MM是高度異質(zhì)性疾病，存在復(fù)雜的免疫系統(tǒng)缺陷。骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源于B細(xì)胞發(fā)育終端的漿細(xì)胞，患者免疫系統(tǒng)存在多種異常，其中細(xì)胞免疫異常(如B細(xì)胞減少、CD4/CD8細(xì)胞減少)與患者生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，提示細(xì)胞免疫在疾病控制中發(fā)揮重要作用[2]。

Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞在細(xì)胞分化和功能上存在相互制衡、互相轉(zhuǎn)化的關(guān)系；在腫瘤患者體內(nèi)，Treg/Th17細(xì)胞平衡向Treg傾斜。在MM患者中，Treg細(xì)胞增多，其一方面由惡性漿細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生[8]，一方面來(lái)自于細(xì)胞間抗原傳遞(Trogocytosis現(xiàn)象)[9]。在MM患者中，Trogocytosis現(xiàn)象較為常見(jiàn)，即惡性漿細(xì)胞將細(xì)胞表面抗原傳遞給T細(xì)胞，產(chǎn)生新的T細(xì)胞表面免疫表型，由此誘導(dǎo)新的Treg細(xì)胞產(chǎn)生[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)MM和難治復(fù)發(fā)患者的外周血和骨髓中，Treg細(xì)胞比率均升高，與顏斌等[12]的結(jié)果相似。但也有研究[13]報(bào)道，Treg細(xì)胞比率在MM初發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)明顯降低，原因可能與患者接受的治療方案相關(guān)[14]。

關(guān)于MM患者中Th17細(xì)胞比率的研究結(jié)論并不一致。研究[15]報(bào)道，MM患者骨髓中Th17細(xì)胞增多；也有研究[16]發(fā)現(xiàn)，MM患者中Th17細(xì)胞較正常對(duì)照無(wú)明顯改變，本研究結(jié)果與之相似。

Foxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。本研究MM患者中，F(xiàn)oxp3呈現(xiàn)與Treg細(xì)胞數(shù)量相同的變化趨勢(shì)，從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)Treg細(xì)胞在MM患者初發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)增加，治療有效后恢復(fù)正常水平；Th17細(xì)胞關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RORγt在各期MM患者中無(wú)顯著變化，與Th17細(xì)胞數(shù)量水平變化趨勢(shì)一致，從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)Th17細(xì)胞在MM患者中無(wú)明顯變化。

Treg與Th17在自身免疫中發(fā)揮相反的作用，但分化密切相關(guān)：CD4+T幼稚細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)下表達(dá)Foxp3或RORγt，分別誘導(dǎo)CD4+T向Treg和Th17細(xì)胞雙向分化。CD4+T細(xì)胞由所在環(huán)境中的細(xì)胞因子決定其分化方向，例如：在前炎癥因子和低濃度TGF-β存在時(shí)，RORγt表達(dá)上調(diào)、Foxp3表達(dá)受到抑制，使細(xì)胞具有Th17特性；高濃度TGF-β則有助于Foxp3表達(dá)，使細(xì)胞具有Treg特性。因此，Treg/Th17比值可以反映細(xì)胞免疫異常情況。本研究發(fā)現(xiàn)，Treg/Th17細(xì)胞比值與MM病情相關(guān)，新診斷、病情復(fù)發(fā)時(shí)升高，有效控制病情后恢復(fù)正常水平， 提示Treg/Th17比值與MM預(yù)后相關(guān)。研究證實(shí)，Treg/Th17比值升高的患者預(yù)后不良[17]；長(zhǎng)期存活患者的Treg/Th17比值正常甚至低于正常[18]。因此，Treg/Th17比值較Treg和Th17細(xì)胞比率更具有MM預(yù)后價(jià)值[9]。

IL-6是MM細(xì)胞重要的生長(zhǎng)因子，其相關(guān)信號(hào)通路可調(diào)控MM細(xì)胞的增殖、程序性死亡[19]。MM患者IL-6升高與預(yù)后不良、生存時(shí)間短密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)組、復(fù)發(fā)/難治組IL-6水平高于平臺(tái)期組和正常對(duì)照組，與既往文獻(xiàn)[20]報(bào)道符合。IL-6是Th17細(xì)胞分化中重要的誘導(dǎo)炎癥因子，即在IL-6存在下，Treg/Th17平衡向Th17傾斜。但本研究中，Th17細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯改變，且Treg/Th17平衡向Treg傾斜。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能為：首先，本研究檢測(cè)的是外周血血清IL-6水平，不能準(zhǔn)確反映MM腫瘤微環(huán)境的情況，骨髓中可能存在其他影響Th17分化的因素；其次，MM患者Treg細(xì)胞升高更為明顯。

CRP是急性相蛋白，在IL-6刺激下由肝細(xì)胞合成。研究[21-22]表明，CRP水平能反映IL-6相關(guān)信號(hào)通路的活性。本課題組前期研究[21]發(fā)現(xiàn)，CRP升高水平與MM患者療效差相關(guān)；本研究顯示，CRP水平與Treg/Th17比值變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明CRP可用于預(yù)測(cè)MM預(yù)后。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)MM各期患者外周血及骨髓中Treg、Th17細(xì)胞比率，以及患者外周血血清IL-6和CRP水平的分析，證實(shí)Treg/Th17平衡在MM活動(dòng)期向Treg細(xì)胞傾斜，有效治療后恢復(fù)，提示Treg/Th17比值具有MM預(yù)后判斷作用。此外，本研究中，經(jīng)過(guò)治療后，部分患者Treg/Th17比值仍較高，可能與治療效果不佳相關(guān)。在MM患者中，Treg/Th17平衡是否受到其他細(xì)胞亞群或因子的影響，有待于更深入的研究來(lái)明確。