一起多血清型副溶血性弧菌聚集性腹瀉事件的病原分析*

施怡茹，陳洪友，盧曉蕓，趙錦江，高紅梅，馬 英，徐秋芳△

(1.上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心 201700；2.上海市疾病預(yù)防控制中心 200336)

副溶血性弧菌(Vp)主要分布于近海海水、海河交界處、海產(chǎn)品和腌制產(chǎn)品中，是夏、秋季沿海地區(qū)引起腹瀉性疾病的主要食源性病原菌，其主要致病因子為耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TRH)，攜帶有TDH或(和)TRH的菌株被稱(chēng)為產(chǎn)毒株[1-3]。2016年8月上海市某區(qū)發(fā)生一起聚集性腹瀉事件,在某賓館就餐的人員中，陸續(xù)有29人出現(xiàn)惡心、腹痛和腹瀉等不適癥狀，均前往醫(yī)院就診并采取肛拭樣品。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查，該29例患者均在27日于該賓館就餐，膳食由賓館食堂燒制，發(fā)病前5 d內(nèi)均無(wú)其他集體性聚餐活動(dòng)。28日03:00出現(xiàn)首發(fā)病例，最后1例出現(xiàn)于29日04:00。患者主要癥狀為不同程度的惡心、嘔吐、水樣便腹瀉、上腹或臍周痛(絞痛或陣發(fā)痛)，個(gè)別病例伴有頭暈、頭痛。相關(guān)工作人員現(xiàn)場(chǎng)采集可疑樣品，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離檢測(cè)和溯源分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 29例患者肛拭樣品、6份留存食品樣品、6份餐具樣品和5份餐廳從業(yè)人員肛拭樣品，均嚴(yán)格無(wú)菌采樣，并于2 h內(nèi)送檢。

1.2主要儀器 德國(guó)艾本德Reaiper4(Eppendorf)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀；美國(guó)Bio-Rad CHEF Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀；美國(guó)Applied Maths公司BioNumerics7.1分析軟件；美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad GEL DocTMXR凝膠成像儀；法國(guó)生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)VITEK_2_Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。

1.3主要試劑 Vitek 2 GN生化鑒定板條[法國(guó)生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)]；Proteinase K、XbaⅠ、NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶(Takara生物工程有限公司)；SeaKem Gold Agarose(美國(guó)Cambraex Bio Rockland公司)；Gelred染色液(美國(guó)BIOTIUM公司)；副溶血性弧菌血清(Denka Seiken，日本)；革蘭陰性需氧菌藥敏試驗(yàn)檢測(cè)板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)；Premix ExTaq Version20、DL2000TM DNA Maeker(Takara生物工程有限公司)。所有增菌液和培養(yǎng)基均由上海華康科技公司和上?？岂R嘉科技公司提供。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.4方法

1.4.1菌株分離及鑒定 肛拭樣品按照《感染性腹瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)》WS271-2007進(jìn)行分離檢測(cè)，食品樣品按照GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2010、GB 4789.4-2010、GB 4789.5-2013、GB/T4789.6-2003等標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)全自動(dòng)微生物生化鑒定確證。

1.4.2菌株血清分型 用Vp 11種O抗原(O1～O11)及65種K抗原(K1、K3～K13、K15、K17～K26、K28～K34、K36～K61、K63～K71)進(jìn)行血清分型[4]。

1.4.3PCR檢測(cè)TRH、TDH、toxRS-new、toxRS-old和orf8-up基因 熱裂解法提取VpDNA，PCR檢測(cè)目的基因，引物序列參考文獻(xiàn)[2,5]，見(jiàn)表1。各引物分別進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：PREmix TaqTM(TaKaRa Code：RR901A)為12.5 μL，DNA模板為1.5 μL，按表1所示的引物終濃度加入相應(yīng)體積的各種引物，加無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)足總體積為25.0 μL；PCR循環(huán)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 60 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)25次，各PCR反應(yīng)體系的退火溫度見(jiàn)表1[4]。最后取5.0 μL產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳30 min。

表1 引物名稱(chēng)、序列及預(yù)期產(chǎn)物大小

1.4.4藥敏試驗(yàn) 選取氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、氯霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、萘啶酸、頭孢唑啉、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛等17種抗生素，選用肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度，按照藥敏試驗(yàn)檢測(cè)板試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作和結(jié)果判斷。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.4.5PFGE分子分型 參考美國(guó)疾病預(yù)防控制中心PulseNet USA的方法。作為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考菌株為H9812，由上海市疾病預(yù)防控制中心提供，用XbaⅠ酶切；Vp用NotⅠ酶切；圖譜用BioNumerics7.1軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1分離培養(yǎng)結(jié)果 從20例患者肛拭樣品和1例餐廳從業(yè)人員肛拭樣品中分離出疑似Vp，其在弧菌顯色平板上為圓形、扁平、濕潤(rùn)、不透明、紫色的大菌落。未檢出其他致病菌(金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌、志賀菌、致瀉性大腸桿菌)。

2.1.2菌體形態(tài)與生化結(jié)果 經(jīng)革蘭染色鏡檢，該21株可疑菌均為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，在3%氯化鈉三糖鐵斜面上均為斜面紅色、底層黃色、不產(chǎn)氣、硫化氫陰性。經(jīng)Vitek 2 GN生化鑒定板條確證，該21株可疑菌均為Vp，生化結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2血清分型結(jié)果 該21株Vp可分為4種血清型別，分別為O3:K6型15株，占71.43%，O4:K8型4株，占19.05%，另有2株K抗原不可分型的菌株，即O3:KUT和O4:KUT 各1株，KUT為O和(或)K不可分型者，見(jiàn)表3。

2.3tdh、trh、toxRS-new、toxRS-old、orf8-up基因檢測(cè) 結(jié)果顯示，所有菌株均不含毒力基因trh；僅1株血清型O3:KUT的菌株tdh基因?yàn)殛幮?，其余菌株tdh基因均為陽(yáng)性，攜帶率為95.24%。血清型O3:K6菌株均為toxRS-new、orf8-up陽(yáng)性，toxRS-old陰性；其余血清型別的菌株該3種基因攜帶情況與O3:K6相反，見(jiàn)表3。

表2 21株疑似菌株生化鑒定結(jié)果

注：+為陽(yáng)性，-為陰性

表3 毒力基因、血清分型結(jié)果

續(xù)表3 毒力基因、血清分型結(jié)果

注：+為陽(yáng)性，-為陰性

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表4。21株Vp藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致，氨芐西林和頭孢唑啉耐藥率為100.00%，復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥率為95.24%，萘啶酸耐藥率為19.05%，頭孢西丁耐藥率為9.52%，四環(huán)素耐藥率為4.76%，其余11種抗生素敏感率均為100.00%。

表4 21株Vp藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.5PFGE分型結(jié)果 21株Vp的PFGE圖譜采用Bio Numerics7.1軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，以Dice系數(shù)計(jì)算相似度，UPGMA法建樹(shù)，差異<4的菌株可歸為同一聚類(lèi)。分析結(jié)果顯示，基因組DNA片段得到較好的分離。按照100%相似度可分為7種帶型，不同血清型別的菌株互為不同的帶型，且同源性較低，見(jiàn)圖1。血清型O3:K6有3種帶型：VP16001、VP16002、VP16003，其之間的同源性分別為96.30%和81.70%，其中VP16003為主要優(yōu)勢(shì)型別，有9株，占42.86%，VP16001次之，有4株，占19.05%；血清型為O4:K8有兩種帶型：VP16004和VP16005，其之間的同源性為90.0%；相同血清型的不同PFGE帶型之間條帶差異均<4。

圖1 Vp PFGE聚類(lèi)分析圖

3 討 論

Vp主要引起人體以發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等癥狀為主的急性腸胃炎，其引發(fā)的食源性發(fā)病案例分布世界各地[6-7]。全國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，在總體食物中毒原因中，Vp位居第2[4]；在上海地區(qū)導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)病率為76.5人次/10萬(wàn)[8-9]。

本次聚集性腹瀉事件分離得到21株Vp，從患者肛拭樣品中檢出的20株Vp均攜帶tdh基因，不攜帶trh基因，分離自餐廳從業(yè)人員的1株Vp不含毒力基因tdh和trh，即為不產(chǎn)毒株，不具備傳染、侵襲他人的毒力。

MATSUMOTO等[10]利用toxRS基因序列建立了toxRS-new用于檢測(cè)O3:K6，以區(qū)分大流行菌株與非流行菌株。toxRS-new陽(yáng)性菌株可判為大流行菌株，具有致病性強(qiáng)、tdh陽(yáng)性、trh陰性等特點(diǎn)，其中超過(guò)96%的菌株攜帶f237噬菌體的orf8片段[11]。O3:K6是上海地區(qū)腹瀉人源性Vp的優(yōu)勢(shì)血清型[1]。O3:K6也是環(huán)太平洋地區(qū)、歐洲地區(qū)大流行菌株的優(yōu)勢(shì)血清型[4-5]。此次聚集性腹瀉事件Vp的優(yōu)勢(shì)血清型別為O3:K6，與上海地區(qū)一致；毒力基因攜帶情況符合大流行菌株特點(diǎn)；其余3種血清型別(O4:K8、O3:KUT、O4:KUT)是O3:K6關(guān)系相近的血清型變種[5]。

根據(jù)學(xué)者提出的有關(guān)菌株同源性的判斷標(biāo)準(zhǔn)及同源性≥85%的菌株可被認(rèn)為是來(lái)源同一克隆株的理論，該起事件檢出的21株Vp中，相同血清型的不同PFGE帶型之間存在1～3個(gè)條帶差異，具有高度同源性，為同一聚類(lèi)，可能來(lái)自同一污染源。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，21株Vp的抗生素耐藥情況基本一致，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道基本一致，對(duì)氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率最高，達(dá)100.00%，對(duì)頭孢他啶、四環(huán)素、阿莫西林/克拉維酸等均敏感。近年來(lái)，濫用抗生素及細(xì)菌之間耐藥基因傳遞等原因使細(xì)菌耐藥情況愈發(fā)嚴(yán)重，進(jìn)而受到廣大醫(yī)務(wù)人員的重視[13-14]。因此，需密切關(guān)注Vp的耐藥情況及變化，以期有效指導(dǎo)臨床合理使用抗生素。

綜上所述，此次聚集性腹瀉事件是由O3:K6和O4:K8兩種血清型為主的5種不同克隆株Vp混合感染引起的。而分離自餐廳從業(yè)人員的菌株為非產(chǎn)毒株，與分離自患者的Vp，可視為無(wú)相關(guān)性。因此，引起此次事件的病原菌來(lái)源尚未確定，不排除由于此次送檢的可疑樣品不全，未采集到致病菌污染樣品。建議相關(guān)部門(mén)在處理此類(lèi)事件時(shí)，應(yīng)擴(kuò)大可疑食物或相關(guān)環(huán)節(jié)樣品的采樣范圍。此次事件可懷疑為該賓館食堂用具被多種血清型Vp污染，或是食品在烹煮過(guò)程中存在尚未熟透的現(xiàn)象，或是食堂廚房存在用具生熟未嚴(yán)格分開(kāi)、食品儲(chǔ)存保管不當(dāng)?shù)龋窃斐蒝p迅速繁殖、多重污染并引起聚集性腹瀉事件的可能原因。