4-PBA通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕原代海馬神經(jīng)元的損傷*

柳秀平， 呂凌云， 李夏春

(1杭州市中醫(yī)院檢驗科， 浙江 杭州 310007; 2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 湖北 宜昌 443002)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以進行性認知障礙和記憶功能損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征是老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，同時伴有突觸丟失，樹突棘和突觸蛋白的損傷[1]。目前AD發(fā)病機制有多種假說，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說認為受基因、環(huán)境和年齡等因素的影響，AD 神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)錯誤折疊蛋白質(zhì)增多，ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡引起ER應(yīng)激(ER stress)，進而激活凋亡途徑引起神經(jīng)細胞凋亡可能與AD發(fā)病密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)在SD大鼠中ER應(yīng)激能促進tau蛋白磷酸化及突觸蛋白的喪失[3], 側(cè)腦室注射衣霉素(tunicamycin，Tm)可誘導(dǎo)大鼠空間記憶障礙[4]，因此我們可以通過抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來減輕神經(jīng)元損害。由此尋求一種具有抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，預(yù)防神經(jīng)元受損害的藥物顯得尤為必要。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)是一種具有分子伴侶作用的短鏈芳香族脂肪酸，它可以逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)分子的錯誤移位和錯誤聚集并幫助其建立正常的空間結(jié)構(gòu)，從而具有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和誘導(dǎo)分化的作用[5]。化學(xué)伴侶 4-PBA 能夠減緩用衣霉素和毒胡蘿卜素誘導(dǎo)傳代細胞產(chǎn)生的ER應(yīng)激[6]。在 Tg2576 小鼠中也發(fā)現(xiàn)，4-PBA 能夠在AD病理形成前阻止β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)形成，減少突觸丟失及認知障礙[7]。目前4-PBA對原代神經(jīng)元細胞ER應(yīng)激的作用尚未明確。本研究中，我們在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激降低原代神經(jīng)元樹突棘密度和突觸蛋白表達量，而4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減緩原代海馬神經(jīng)元的突觸蛋白丟失和樹突棘密度下降，這為預(yù)防治療阿爾茨海默病等神經(jīng)變性疾病提供了新的線索。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和質(zhì)粒

4-PBA、MTT和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)購自Sigma；衣霉素購自Alexis Biochemical；原代培養(yǎng)試劑(包括DMEM、神經(jīng)培養(yǎng)基、F12和B27)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine均購自Invitrogen；兔抗免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein, BiP)多克隆抗體和鼠抗α-微管蛋白(α-tubulin)單克隆抗體購自Abcam；兔抗突觸小泡蛋白(synaptophysin， Syp)多克隆抗體購自Sigma；兔抗突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的質(zhì)粒購于上海紐恩生物公司。

2 主要方法

2.1原代海馬神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 取孕新生大鼠，麻醉消毒取出完整腦組織，游離出雙側(cè)海馬組織，剝離腦膜及血管膜。將海馬置入解剖液(含3%～6% 葡萄糖的D-Hanks液)并剪碎(以上均在冰上進行)，0.125% 胰蛋白酶(GIBCO)37 ℃消化8 min(可以根據(jù)消化程度而調(diào)整)，加入種植培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%胎牛血清+0.5%雙抗)終止消化，滴管吹打后經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，1 500 r/min離心5 min, 去上清，加入適當?shù)姆N植培養(yǎng)液重懸，依實驗?zāi)康恼{(diào)整細胞密度，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或者玻片中，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)；4 h后全量換成維持培養(yǎng)基(95% Neurobasal+2% B27+0.2%谷氨酰胺+0.5%青鏈雙抗),以后每3 d半量換液，培養(yǎng)20 d。

2.2Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白及突觸蛋白的表達 提取細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量，將等量的蛋白利用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉，加入相應(yīng)I抗， 4 ℃孵育過夜后洗膜加入標記熒光素的的羊抗兔或羊抗鼠II抗，最后用Odyssey遠紅外成像系統(tǒng)掃描識別蛋白印跡并定量分析。

2.3培養(yǎng)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染與熒光顯微鏡成像 采用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000, 在海馬神經(jīng)元種植后5～7 d [DIV (dayinvitro) 5～7]轉(zhuǎn)染表達EGFP的質(zhì)粒。將DIV 20轉(zhuǎn)染EGFP的原代海馬神經(jīng)元分為3組: DMSO組、TM(3 mg/L)組和TM(3 mg/L)+4-PBA(1 mmol/L)組(4-PBA提前1 h加入)。將所用藥物加入到細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，21 d神經(jīng)元成熟用多聚甲醛固定，在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察樹突棘的變化。

2.4Tm和4-PBA對神經(jīng)元細胞活力的影響 原代海馬神經(jīng)元種植于96孔板，DIV20用不同濃度Tm處理24 h或4-PBA處理25 h或4-PBA預(yù)處理1 h再加入Tm處理24 h后加入PBS清洗后加入MTT(5 g/L)溶液于無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育3 h，輕輕吸去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解甲臜，用酶標儀 (BioTek) 在560 nm波長測定吸光度(A)值。以各組吸光度與DMSO組吸光度的百分比值表示各組的細胞活力。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示；采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計突觸數(shù)目，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 4-PBA減弱 Tm誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

首先用Tm誘導(dǎo)ER應(yīng)激,通過檢測細胞中BiP的蛋白水平來反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。我們選取了2個不同濃度的Tm, Western blot結(jié)果顯示, 3 mg/L和10 mg/L的Tm處理后，原代神經(jīng)元中的BiP蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，見圖1A，說明Tm使原代神經(jīng)元細胞發(fā)生明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，由于3 mg/L Tm已經(jīng)誘導(dǎo)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因此后續(xù)實驗我們選擇3 mg/L Tm。提前1 h加入不同濃度的4-PBA預(yù)處理，結(jié)果顯示細胞中的BiP蛋白水平與處理組相比顯著下降(P<0.05)，在濃度為1 mmol/L和5 mmol/L時效果明顯，見圖1B，說明Tm誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，4-PBA可減輕Tm誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

Figure 1.Tm induced ER stress in the primary hippocampal neurons and 4-PBA reduced the level of BiP after Tm exposure. A: the images of Western blot and quantitative analysis for determiming the protein expression of BiP normalized by α-tubulin in the primary hippocampal neurons treated with Tm (3 and 10 mg/L); B: the images of Western blot and quantitative analysis for determiming the protein expression of BiP in the primary hippocampal neurons exposed to 3 mg/L Tm with or without 4-PBA pretreatment. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

2 4-PBA抑制Tm誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細胞樹突棘密度降低

DIV 5～7的原代神經(jīng)元經(jīng)EGFP轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)到DIV 20,分組給藥24 h后熒光顯微鏡下可觀察到原代神經(jīng)元細胞樹突棘。我們的結(jié)果顯示Tm誘導(dǎo)24 h后海馬神經(jīng)元樹突棘密度與對照組相比明顯減少，而1 mmol/L 4-PBA預(yù)處理組的樹突棘密度顯著升高(P<0.05)，見圖2。這說明Tm誘導(dǎo)樹突棘密度下降，4-PBA可抑制Tm誘導(dǎo)的樹突棘密度降低。

3 4-PBA抑制Tm誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細胞突觸蛋白表達下降

用Western blot法檢測突觸相關(guān)蛋白的蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tm誘導(dǎo)24 h后海馬神經(jīng)元突觸前蛋白Syp及突觸后蛋白PSD95的蛋白水平下降，而1 mmol/L 4-PBA預(yù)處理組可使這2種突觸蛋白的表達水平上升(P<0.05)，見圖3。說明Tm誘導(dǎo)突觸蛋白表達下降，4-PBA可抑制Tm誘導(dǎo)突觸蛋白表達下降的作用。

Figure 2.Tm reduced the dendritic spine density of primary hippocampal neurons and 4-PBA increased the dendritic spine density after Tm treatment. A and B: dendritic spine density after Tm exposure was detected by laser confocal microscope; C: the quantitative analysis of A (16, 18 and 19 dendrites were analyzed in DMSO group, Tm group and Tm+4-PBA group, respectively). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

Figure 3.The levels of BiP and synaptic proteins measured by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

4 4-PBA減輕Tm對原代神經(jīng)元細胞活力下降的影響

用MTT分析4-PBA和Tm對原代神經(jīng)元細胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.01、 0.1、 1和5 mmol/L 4-PBA單獨處理25 h細胞活力均無顯著變化； Tm(3 mg/L)和Tm(10 mg/L)處理原代神經(jīng)元24 h, 3 mg/L Tm引起神經(jīng)元活力輕度降低(84.29%±2.25%vs100%,P<0.05)， 10 mg/L Tm引起神經(jīng)元活力顯著降低(66.5%±3.5%vs100%,P<0.05);用上述各濃度4-PBA預(yù)處理1 h后再加入Tm 3 mg/L處理24 h, 發(fā)現(xiàn)0.1、 1和5 mmol/L 4-PBA預(yù)處理1 h后再用Tm處理24 h細胞活力明顯改善(P<0.05)，見圖4。這些結(jié)果提示4-PBA可顯著改善低濃度Tm處理引起的細胞活力降低。

討 論

AD是一種以進行性、海馬依賴性記憶和認知功能障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。腦突觸功能障礙在AD疾病進展機制中占有重要地位，突觸的數(shù)量和功能的改變可引起突觸可塑性的改變，進而影響學(xué)習(xí)記憶能力，與疾病認知功能障礙明顯相關(guān)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與突觸功能障礙密切相關(guān)。

Figure 4.The effects of Tm and 4-PBA on viability of primary hippocampal neurons detected by MTT assay. A: the effect of Tm on cell viability was detected by MTT assay; B: the effect of 4-PBA on cell viability was by MTT assay; C: the effect of 4-PBA on cell viability reduction induced by Tm was by MTT assay. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs Tm group.

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中最重要的細胞器之一，是脂類和固醇合成、維持 Ca2 +動態(tài)平衡、蛋白質(zhì)合成與折疊及其翻譯后修飾的場所，其功能紊亂則引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，造成一系列細胞反應(yīng)，參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。AD的一個顯著特征是錯誤折疊蛋白的積累[9]。已有報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AD 患者學(xué)習(xí)記憶障礙有密切關(guān)系。神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，不僅會引起神經(jīng)細胞一系列形態(tài)生理功能的變化，如Ca2+代謝紊亂導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性和使突觸丟失、記憶損害[10]以及導(dǎo)致PS 突變和Aβ沉積[11]、抑制反應(yīng)元件和蛋白因子的結(jié)合阻止記憶形成[12]。因此研究神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機制對于了解 AD學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)病機制以及治療AD具有重要意義。

據(jù)報道學(xué)習(xí)記憶障礙患者在神經(jīng)元凋亡之前就能觀察到突觸丟失和突觸功能異常[13]。神經(jīng)元間的通信主要發(fā)生在突觸，其中包括突觸前成分、突觸間隙和突觸后成分。樹突棘是樹突分支上常見的棘狀興奮性突觸，這種棘狀小突起是神經(jīng)元之間形成突觸聯(lián)系的主要部位，是突觸后成分主要組成部分。學(xué)習(xí)記憶過程常與樹突棘的形成、脫落、擴張和萎縮等形態(tài)以及數(shù)目和組成相關(guān)，并且突觸相關(guān)蛋白對其功能的發(fā)揮起著決定性作用，突觸相關(guān)蛋白在學(xué)習(xí)和記憶中扮演著重要角色[14]。因此我們推測，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙與樹突棘密度降低及與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的突觸蛋白的表達下降有關(guān)。我們用Tm處理原代海馬神經(jīng)元24 h后，發(fā)現(xiàn)其表達 BiP 蛋白水平明顯升高，樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白表達下降;同時我們發(fā)現(xiàn)在Tm處理1 h前給予4-PBA 預(yù)處理，BiP的表達較Tm組明顯下降，樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白表達增加,這說明Tm引起了明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白下降，4-PBA預(yù)處理顯著減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白下降。因為樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白的表達也受線粒體密度和功能的影響，所以我們也用MTT檢測細胞活力來反映線粒體密度和功能，結(jié)果顯示Tm(3 mg/L)處理只輕度降低細胞活力，不同濃度4-PBA單獨使用不改變細胞活力，但是用4-PBA預(yù)處理可減輕Tm引起的細胞活力輕度降低,這說明低濃度Tm引起顯著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致樹突棘密度下降和突觸相關(guān)蛋白表達下降的主要原因。最近也有研究報道Tm可在SD大鼠引起以尋找新目標潛伏期延長為主的認知功能障礙，并且可引起樹突棘密度顯著下降，樹突頭部直徑變小，海馬長時程增強減弱，GluR1表達水平顯著下降[15]。4-PBA 是一種短鏈芳香族脂肪酸，有報道發(fā)現(xiàn)用衣霉素、毒胡蘿卜素誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加入分子伴侶 4-PBA 能夠減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)4-PBA可減輕原代背根神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元高糖血癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡，但并不改變細胞活力和鈉通道的表達[16]。在 Tg2576 小鼠, 也發(fā)現(xiàn)4-PBA 能夠在AD病理形成前阻止Aβ形成，減少突觸丟失及認知障礙[7],這些結(jié)果都表明 4-PBA 主要可能通過降低Tm引起的神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白表達，起到減輕原代海馬神經(jīng)元損傷的作用。

綜上所述，我們的研究證實在原代海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使樹突棘密度和突觸相關(guān)蛋白表達下降，而4-PBA預(yù)處理可顯著抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的樹突棘密度下降和突觸蛋白表達量下降，減輕原代海馬神經(jīng)元損傷。因此，4-PBA作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，有望作為一種新型的靶點來治療阿爾茨海默病。