Nodosin通過Apaf-1和caspase-3誘導HepG2細胞凋亡*

海廣范， 張 慧， 馬 敬， 郭蘭青， 王海燕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 1藥學院， 2第二附屬醫(yī)院， 3護理學院， 4第一附屬醫(yī)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

惡性腫瘤是由于各種原因導致細胞生長和增殖失控而誘發(fā)的一種疾病，其發(fā)病率和死亡率均呈上升態(tài)勢[1]，肝細胞癌是發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤之一[2]，而對肝癌的治療尚缺乏安全有效的藥物。目前發(fā)現一些植物性抗腫瘤藥對肝癌具有較好的防治作用，并且具有不良反應少、安全有效等特點，因此，植物性抗腫瘤藥成為科研工作者的研究熱點。溪黃草為唇形科(Labiatae)香茶菜屬 (Isodon)植物，具有涼血散瘀、退黃去濕和清熱解毒等功效，nodosin是從溪黃草中提取出來的貝殼杉烷型二萜化合物。 我們在前期研究中發(fā)現nodosin對HepG2、HL60、LoVo、SGC7901和U87等多種細胞都有一定程度的抑制作用[3]，但具體作用機制尚不清楚。鑒于大多數植物性提取藥物對腫瘤細胞的殺傷性作用與誘導細胞凋亡作用密切相關，我們以HepG2細胞為研究對象，探討nodosin對HepG2細胞凋亡的影響及其機制，為研發(fā)新的治療肝癌的藥物提供依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑材料

新生小牛血清購自鄭州博興生物科技有限公司；DMSO和Hoechst 33258購自廣州威佳生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液購自GIBCO；抗caspase-3抗體購自Santa Cruz; nodosin由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院提供，高效液相色譜法測定其純度為95.5%。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院藥理學教研室提供，在-196 ℃液氮中凍存，由本實驗室體外傳代培養(yǎng)。按照貼壁細胞的培養(yǎng)方法把HepG2細胞于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每2 d換液1次，3 d左右傳代1次。

2.2熒光染色 取對數生長期的HepG2細胞，按照每孔3×105的細胞量把細胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、 2.5、 5、 10和20 μmol/L，同時設置陰性對照(control)組，24 h后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗后加入10 μg/L Hoechst 33258染色10 min，PBS沖洗后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.3電鏡觀察 取對數生長期的HepG2細胞，按照每孔3×106的細胞量把細胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為2.5、5和10 μmol/L，同時設置陰性對照組，每個濃度設置3個復孔，24 h后收集細胞，在4 ℃ 4%戊二醛溶液中固定4 h，然后用磷酸緩沖液洗滌24 h，用鋨酸固定液固定1 h，磷酸緩沖液洗滌2次，然后依次用50%、70%、80%、90%、95%和100%的丙酮梯度脫水，每次10 min，再用樹脂812浸透24 h，定向包埋聚合96 h，Leica UC6超薄切片機切成50 nm超薄切片，再用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，日立H-7500透射電鏡觀察、拍照。

2.4凋亡率的檢測 取對數生長期的HepG2細胞，按照每孔2×106的細胞量把細胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、 2.5、5、10和20 μmol/L，同時設置陰性對照組，24 h后收集細胞，PI染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率。

2.5RT-qPCR檢測凋亡蛋白酶激活因子1(apopto-tic protease-activating factor-1, Apaf-1) mRNA的表達 用1.25、2.5、 5、10和20 μmol/L的nodosin共培養(yǎng)HepG2細胞，同時設置陰性對照HepG2細胞組，24 h后收集細胞，提取RNA,用逆轉錄酶和引物合成cDNA, 反應條件： 94 ℃變性40 s、61 ℃復性40 s、70 ℃延伸60 s，共32個循環(huán)。Apaf-1的上游引物序列為 5’-TTGCTGCCCTTCTCCATGAT-3’,下游引物序列為 5’-TCCCAACTGAAACCCAATGC-3’,內參照GAPDH的上游引物序列為5’-AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-3’，下游引物序列為5’-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3’，擴增產物長度為490 bp。PCR條件： 93 ℃變性； 93 ℃ 60 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 2 min順序循環(huán)30次； 72 ℃延伸10 min。

2.6Western blot 檢測pro-caspase-3、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平 將經2.5、5和10 μmol/L nodosin處理24 h后的HepG2細胞提取蛋白，并用SDS-PAGE辨別pro-caspase-3和caspase-3蛋白，然后以3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙的順序排好，4 ℃、 300 mA條件下轉移100 min，然后取出PVDF膜用PBS洗膜3次，用含有5%脫脂奶粉的PBS封閉60 min，用PBS緩沖液將PVDF膜洗3次后,用anti-pro-caspase-3、anti-caspase-3和anti-cleaved caspase-3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗膜2次并用羊抗鼠IgG-HRP(1∶100)室溫緩慢振蕩1.5 h后，PBS洗膜2次后顯色，并拍照記錄。

3 統(tǒng)計學處理

數據均用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用方差分析進行組間差異比較，并使用LSD-t檢驗對各組均數進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 熒光染色結果

陰性對照組HepG2細胞胞核染色均勻，細胞核飽滿； nodosin處理后細胞染色出現染色不均勻，細胞核出現切跡或者不規(guī)則的形狀，該形態(tài)在1.25和2.5 μmol/L 劑量組較為明顯，隨著用藥劑量的增加，在5、10和20 μmol/L劑量組可見細胞核濃縮成小塊狀，凋亡小體清晰可見，見圖1。

Figure 1.The effect of nodosin at different concentrations on the HepG2 cells observed by microscopy with Hoechst 33258 staining (×200).

2 電鏡觀察結果

電鏡觀察可見，未用nodosin處理過的細胞飽滿，細胞核圓潤，核仁居中； 2.5 μmol/L nodosin處理過的細胞形態(tài)不均，細胞核出現切跡；5 μmol/L 劑量組細胞核染色質固縮、邊集，呈新月形，核膜皺褶，細胞器集中，細胞核呈現月牙形，核仁偏移；10 μmol/L 劑量組細胞胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡，凋亡小體清晰可見，見圖2。

3 細胞凋亡率的檢測結果

不同濃度nodosin對HepG2細胞凋亡率的影響示,陰性對照組、1.25 μmol/L 劑量組、2.5 μmol/L 劑量組、5 μmol/L劑量組、10 μmol/L 劑量組和 20 μmol/L 劑量組凋亡率隨著nodosin濃度的增加凋亡率隨之增加(P<0.05或P<0.01),見圖3。

4 Nodosin對Apaf-1 mRNA相對表達量的影響

與陰性對照組相比，Apaf-1的mRNA相對表達量在5 μmol/L劑量組、10 μmol/L 劑量組和 20 μmol/L 劑量組顯著增加(P<0.05),見圖4。

Figure 2.The effect of nodosin at different concentrations on the HepG2 cells observed under electron microscope.

5 Nodosin對caspase-3蛋白水平的影響

不同濃度nodosin作用于HepG2細胞24 h后，用Western blot法檢測caspase-3的蛋白水平。結果顯示，pro-caspase-3和caspase-3的蛋白水平逐漸增加，呈現一定的量效關系(P<0.05或P<0.01)。Cleaved caspase-3的蛋白水平隨著nodosin濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

討 論

肝癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康，肝癌的治療主要依賴于手術和化療藥物的應用，但目前患者所使用的化療藥物，選擇性較差，作用范圍廣泛，副作用較多，并且腫瘤細胞耐藥性日益嚴重，因此，新型高效低毒抗腫瘤藥物的開發(fā)和研究，日益受到重視。

中藥作為中華民族的魂寶，具有毒性作用小、調理作用強和價格便宜等優(yōu)點，因此，中藥對腫瘤的治療和預防作用日益受到國內外研究者的重視。香茶菜屬植物具有廣泛的抗腫瘤活性，如肝癌、胃癌和白血病等，溪黃草作為香茶菜屬植物也具有類似的抗腫瘤特性。已有大量的資料證明，該類植物除了具有抗菌、消炎和抗風濕等作用外，還能明顯地縮小多種實體瘤的體積，具有防病、治病腫瘤的功效。Nodosin屬于二萜類化合物，是溪黃草的重要抗癌活性成分[4]，在前期研究報道中nodosin具有良好的拮抗HepG2細胞生長增殖的活性[5]。Nodosin的基本化學結構為剛性骨架的四環(huán)二萜，具有不飽和環(huán)戊酮結構，對腫瘤細胞增殖的抑制效果明顯。Nodosin對腫瘤細胞增殖的抑制主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現的。

Figure 3.The effect of nodosin at different concentrations on the apoptotic rates of HepG2 cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L.

Figure 4.The effect of nodosin at different concentrations on the mRNA expression of Apaf-1 in the HepG2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L.

細胞凋亡是細胞死亡的一種自然生理學過程，這種死亡方式受到生理或者病理條件下細胞內特定基因操縱和調控，因此又稱為程序性細胞死亡[6]。凋亡小體的形成是細胞凋亡的主要特征之一。本論文中熒光顯微鏡和電鏡觀察結果顯示,不同濃度nodosin作用于HepG2細胞24 h后，細胞皺縮，細胞核偏移，細胞核呈現新月形，凋亡小體清晰可見，并且凋亡細胞數量隨著nodosin濃度的增加而增加，提示nodosin對HepG2細胞的抑制作用是通過誘導細胞凋亡實現的。流式細胞術結果顯示， HepG2細胞的凋亡率隨著nodosin濃度的增加而增加，進一步提示nodosin對HepG2細胞的細胞毒作用是通過誘導細胞凋亡實現的。細胞凋亡的途徑主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑[7-8]，上述2個途徑的共同終末途徑是caspase家族蛋白[9]。Apaf-1[10]在線粒體途徑中發(fā)揮重要作用，它與細胞色素C和dATP形成凋亡小體，進而切割caspase-9前體，使其激活pro-caspase-3轉變?yōu)閏aspase-3，進而誘導細胞的凋亡。本次實驗結果表明Apaf-1 mRNA表達增加，提示其切割功能的增強，pro-caspase-3 和caspase-3表達量隨著藥物濃度的增加而增加，提示nodosin誘導HepG2細胞的凋亡最終激活了凋亡的終端途徑，而該效應的發(fā)揮與Apaf-1的激活密切相關。在前期研究中我們還發(fā)現，nodosin可以通過增加Bax的表達，減少Bcl-2的表達誘導HepG2細胞的凋亡[11]。Bcl-2和Bax是線粒體途徑中的2個調控因子，因而證實了nodosin對HepG2細胞誘導凋亡的作用是通過內源性途徑即線粒體途徑實現的。本次研究結果與前期研究結果一致。但nodosin是否在激活內源性途徑同時激活外源性細胞凋亡途徑，尚需進一步研究。

Figure 5.The effects of nodosin at different concentrations on the protein levels of pro-caspase-3, caspase-3 and cleaved caspase-3 in the HepG2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L.