IL-17A通過上調(diào)ABCA1的表達減少RAW264.7巨噬細胞脂質(zhì)的積聚*

馬望歌， 周 棟， 王麗君， 劉 艷， 陳小莉， 郭 寧， 周 娟△

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西 西安710061; 2漢中市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西 漢中 723000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的重要致病因素之一，且已被認定為一種慢性炎癥性疾病[1]，AS的進展與動脈壁的炎癥及免疫反應(yīng)息息相關(guān)。在AS進程中，巨噬細胞可以通過攝取氧化修飾的低密度脂蛋白引起胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?，從而最終在AS的形成過程中發(fā)揮著重要的推動作用[2]。巨噬細胞膜上的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 A1(adenosine triphosphate binding cassette transporter A1，ABCA1)[3]可以介導(dǎo)細胞內(nèi)脂質(zhì)的流出，維持細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，因而是體內(nèi)重要的抗AS的蛋白之一。

已證實在AS斑塊中存在水平較高的白細胞介素家族新型細胞因子白細胞介素17A(interleukin-17A, IL-17A)[4]，但其在AS發(fā)展進程中的作用尚存爭議。有文獻報道IL-17A具有一定的抗AS作用[5]，但機制不清。本研究旨在探索細胞因子IL-17A對RAW264.7巨噬細胞ABCA1表達的影響，進而明確IL-17A在AS進程中的作用及其發(fā)生機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

RAW264.7細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；TRIzol購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa；RIPA 裂解液購自碧云天生物有限公司；抗ABCA1抗體購自Novus；抗β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；引物由上海生工公司合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM基本培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)。2～3 d換液 1 次，待細胞長滿后進行胰酶消化、傳代。取生長狀態(tài)良好的細胞種植于6孔板中。細胞干預(yù)處理前，使用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞18～24 h。

2.2細胞干預(yù)方法 本實驗中，我們根據(jù)具體情況分別給予終濃度為0、10、20和50 μg/L的IL-17A進行干預(yù)6和24 h，再檢測ABCA1的mRNA和蛋白表達水平；在時間梯度實驗中，我們給予終濃度為20 μg/L的IL-17A分別干預(yù)細胞1、3、6、12及24 h，并檢測ABCA1的mRNA和蛋白表達水平。

2.3Western blot實驗 吸盡培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS漂洗2次，加入蛋白裂解混合液(RIPA)裂解細胞，并提取蛋白進行蛋白定量。采用SDS-PAGE分離等量蛋白，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入I抗孵育、4 ℃過夜，孵育 II 抗后化學(xué)發(fā)光法顯色。β-actin作為內(nèi)參照。

2.4RT-qPCR實驗 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，RT-qPCR進行擴增。ABCA1的正向引物序列為5’-GCGGCAACAAACGAAAGCTC-3’，反向引物序列為5’-GGCACCTGAACCTTCCATTG-3’；β-actin的正向引物序列為5’-GTGACGTTGACATCCGTAAA-3’，反向引物序列為5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACA-3’。PCR擴增條件為: 95 ℃預(yù)變性10 s； 95 ℃變性5 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。讀取樣本中 ABCA1 和 β-actin的Ct值。β-actin作為內(nèi)參照，目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.5NBD-膽固醇流出測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，在含0.5% FBS的DMEM 中分別加入20 μg/L IL-17A或等體積ddH2O培養(yǎng)18 h，而后加入NBD-膽固醇(1 mg/L)孵育6 h，PBS 漂洗2次后，2組分別加入含 0.2% BSA的DMEM及載脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA-1; 15 mg/L)+0.2% BSA，收集細胞上清并裂解細胞，在Victor X多標(biāo)記酶標(biāo)儀上讀取熒光強度值并進行分析。

2.6油紅O染色細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的測定 將RAW264.7細胞培養(yǎng)在放置有消毒蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi), 細胞經(jīng)IL-17A干預(yù)處理后, 再加入ox-LDL 30 mg/L繼續(xù)孵育8 h， PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，油紅O工作液染色15 min，蘇木素染色30 s，甘油明膠封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的脂滴含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計軟件采用SPSS 18.0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計以單因素方差分析檢驗方法進行多組間比較，組間差異比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表繪制采用GraphPad Prism 5.0軟件。

結(jié) 果

2.1 RAW264.7巨噬細胞的一般情況觀察

RAW264.7細胞呈扎堆生長，正常的狀態(tài)是成片地生長，并會疊加成層。生長狀態(tài)良好的細胞RAW264.7細胞剛貼壁時呈圓形，折光度很好，鏡下觀察明亮如小珍珠狀一個個地散落于瓶底面。生長一段時間后，部分細胞會變?yōu)轭愃扑慕切位蚨噙呅?，同時伸出偽足，見圖1。

2.2 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞ABCA1蛋白的表達

與未經(jīng)IL-17A干預(yù)的細胞相比，給予20 μg/L的IL-17A干預(yù)1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，RAW264.7巨噬細胞的ABCA1蛋白表達顯著增加，在6 h時達到峰值，24 h時仍然保持較高水平(P<0.05),見圖2。

Figure 1.Observation of RAW264.7 macrophage growth under microscope (×40).

我們進一步給予濃度為10、20和50 μg/L的IL-17A分別干預(yù)RAW264.7細胞6 h及24 h，結(jié)果顯示，細胞ABCA1蛋白的表達水平均隨干預(yù)濃度的增加而升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at 20 μg/L for different time. Mean±SEM. n=5. * P<0.05 vs 0 h.

Figure 3.The protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at different doses for 6 h (A) and 24 h (B). Mean±SEM. n=3～4. *P<0.05 vs 0 μg/L.

3 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞ABCA1蛋白的含量，但不影響其mRNA的表達

為了探究IL-17A增加巨噬細胞ABCA1蛋白表達的分子機制，我們進一步檢測IL-17A干預(yù)條件下細胞ABCA1的mRNA表達水平。RT-qPCR結(jié)果示，與對照組相比，給予濃度為10、20和50 μg/L的IL-17A干預(yù)RAW264.7細胞1 h、3 h和6 h，ABCA1的mRNA表達水平均無顯著變化，見圖4。

4 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞ApoA-1介導(dǎo)的膽固醇流出

我們進一步測定了由IL-17A介導(dǎo)的ABCA1蛋白表達增加對巨噬細胞膽固醇流出的影響，正常對照組細胞在加入NBD-膽固醇后，其流出率約為20%，而當(dāng)20 μg/L的IL-17A與細胞共孵育18 h，細胞NBD-膽固醇的流出率大幅增加(P<0.05)，見圖5。

5 IL-17A可以減少巨噬細胞ox-LDL的積聚

為了觀察IL-17A增加巨噬細胞ABCA1蛋白的表達是否會影響細胞脂質(zhì)的積聚，我們將RAW264.7細胞與ox-LDL共同孵育，同時采用油紅O染色法檢測細胞脂質(zhì)含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，ox-LDL與細胞共孵育可以明顯增加細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，但IL-17A預(yù)處理卻可以顯著降低細胞脂質(zhì)含量，見圖6。

Figure 4.The mRNA expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at different dose for 1 h (A), 3 h (B) and 6 h (C). Mean±SEM. n=3.

Figure 5.The cholesterol efflux to ApoA-1 of RAW264.7 macrophages treated with or without IL-17A. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

AS是心血管疾病的重要致病因素之一，是冠心病的主要病因，而巨噬細胞所形成的泡沫細胞[6]又是AS的主要病因。在AS中，巨噬細胞脂質(zhì)代謝的紊亂，吞噬超負荷脂質(zhì)，引起泡沫化是AS進程中至關(guān)重要的一步，促使泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)外流即膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)[7]對防治AS具有重要意義。研究證實，外周組織細胞與胞外膽固醇受體之間至少有3種膽固醇流動途徑[8]：(1)細胞內(nèi)外膽固醇水相擴散；(2)SR-BI介導(dǎo)的雙向被動轉(zhuǎn)運；(3)ABCA1與ABCG1介導(dǎo)的單向主動轉(zhuǎn)運，其中ABCA1和ABCG1介導(dǎo)的單向膽固醇流出是外周組織膽固醇流出的主要途徑。ABCA1主要介導(dǎo)細胞內(nèi)膽固醇流出至ApoA-1，它可有效減少外周組織脂質(zhì)的蓄積。

Figure 6.Lipid accumulation in the RAW264.7 macrophages treated with or without IL-17A (×40).

現(xiàn)今，IL-17A在動脈粥樣硬化中的作用還具有較大爭議[5]。有研究證實，IL-17A的表達在人群及小鼠的AS斑塊病損區(qū)顯著增多[9]，在給予小鼠IL-17A中和抗體后，AS的嚴重程度得到了明顯的改善，提示IL-17A在AS斑塊的形成中具有促進作用；但另一方面，有資料顯示高脂飲食所誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除的AS小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇提取物可使該小鼠模型IL-17A表達水平增高進而表現(xiàn)出AS病變明顯被抑制。本研究從IL-17A入手，重點探討其對巨噬細胞ABCA1表達的影響。我們的研究證實，IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞膽固醇代謝關(guān)鍵性因子ABCA1蛋白的表達。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運是機體內(nèi)排出過多膽固醇的唯一途徑，對維持生物體膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運也被認為是機體抗動脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟之一。ABCA1可以促進胞內(nèi)膽固醇和磷脂的流出，隨后與細胞表面apoA-I相結(jié)合，最終形成新的HDL[10]。我們的研究表明IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞ABCA1的表達，說明IL-17A可能具有一定的抗AS作用，這一作用可能與其促進巨噬細胞脂質(zhì)的逆向運輸，從而抑制巨噬細胞的泡沫化，阻礙泡沫細胞的形成有關(guān)(這一作用在我們的油紅O染色實驗中也得到了初步的證實)。有關(guān)IL-17A促進ABCA1表達的具體機制，我們的實驗也進行了初步的探討。結(jié)果表明，IL-17A不影響ABCA1的mRNA表達水平，說明IL-17A并不是通過增加ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄而促進其表達的。那么，IL-17A是否會通過減少ABCA1蛋白質(zhì)的降解從而促使其表達升高？我們也將在后續(xù)的實驗中進一步證實。

本實驗結(jié)果表明，IL-17A可以增加RAW264.7巨噬細胞ABCA1蛋白的含量，但卻不影響其mRNA的表達水平。IL-17A可以減少RAW264.7巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚從而抑制泡沫細胞的形成，這一作用可能與其具有一定的抗AS效能有關(guān)。