蘋果MdMYB32通過自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

許海峰，楊官顯，王意程，姜生輝，王楠，陳學(xué)森

?

蘋果MdMYB32通過自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

許海峰，楊官顯，王意程，姜生輝，王楠，陳學(xué)森

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】研究蘋果MYB轉(zhuǎn)錄因子家族MdMYB32的生物學(xué)信息、表達水平及其在花青苷合成中的功能，旨在為進一步完善花青苷合成代謝機理提供參考?！痉椒ā恳孕陆t肉蘋果雜種一代優(yōu)系為試材，克隆，分析其進化樹和蛋白序列；測定其在不同果實及在不同脅迫處理下的表達水平，通過轉(zhuǎn)基因驗證其在花青苷合成中的功能，并通過酵母單雜交分析其互作關(guān)系?！窘Y(jié)果】qRT-PCR分析表明在花青苷含量高的‘紅脆9號’蘋果中表達水平較低，而在花青苷含量低的‘紅脆6號’蘋果中表達水平較高，與花青苷含量呈負(fù)相關(guān)；且鹽脅迫和冷脅迫均能抑制的表達；在進化上，與，和在同一個進化枝上，且MdMYB32蛋白序列在C端含有一個EAR抑制序列；在紅肉愈傷中過表達能夠抑制的表達水平，降低花青苷含量，而過表達切除EAR抑制序列后的LES后，不能明顯改變的表達水平和花青苷含量；酵母單雜交和Chip-PCR分析表明MdMYB32和LESMdMYB32均能夠結(jié)合的啟動子?！窘Y(jié)論】MdMYB32能夠結(jié)合啟動子，并通過自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成。

蘋果；MYB轉(zhuǎn)錄因子；；EAR抑制序列；酵母單雜

0 引言

【研究意義】水果和觀賞作物器官的著色是一種重要的經(jīng)濟特性，而花青苷通常是器官著色的重要原因，如鮮紅色、紅色、藍色和紫色[1]?；ㄇ嘬兆鳛轭慄S酮的一種，具有抗氧化，預(yù)防心血管疾病以及抑制肥胖等功能[2-3]。MYB蛋白是植物較大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在花青苷合成中發(fā)揮重要的作用。因此，研究MYB家族中在花青苷生物合成中的功能，對完善花青苷合成代謝機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】花青苷合成受紫外照射、低溫、干旱等環(huán)境因素誘導(dǎo)，且涉及多種結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子[4-5]，前人研究表明MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合體能夠控制花青苷的合成，其中MYB家族和bHLH家族在調(diào)控花青苷合成中的作用在模式植物中得到了廣泛的研究[6-7]。最近，關(guān)于水果方面花青苷合成取得了一些進展，在葡萄中，與擬南芥同源的和被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控葡萄花青苷的合成[8]，類似的同源基因在草莓、梨和桃中也被發(fā)現(xiàn)，分別是、和[9-10]。在蘋果中，和參與了光誘導(dǎo)下花青苷合成[11-12]，ESPLEY等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控紅肉蘋果中花青苷合成。筆者課題組于2006年率先構(gòu)建了新疆紅肉蘋果與栽培蘋果品種的雜種分離群體[15-20]，以此群體為試驗材料，許海峰等[21]分析了雜種一代4個紅肉蘋果株系類黃酮和花青苷含量及相關(guān)基因的表達；JI等[22-23]探討了氮對愈傷組織花青苷生物合成的影響，并對紅色和黃色愈傷組織進行了RNA-seq分析；而WANG等[24]則對F1分離群體中的綠色和紅色單株各20株進行了RNA-seq分析，篩選到了與花青苷合成相關(guān)的差異表達基因；此外，XU等[25]和WANG等[26]還分別研究了和參與花青苷合成的分子機理?！颈狙芯壳腥朦c】EAR抑制序列的發(fā)現(xiàn)，為花青苷合成調(diào)控提供了新的視角。擬南芥是第一個被發(fā)現(xiàn)含有EAR抑制序列的負(fù)調(diào)控因子，它通過直接結(jié)合靶基因的啟動子來發(fā)揮抑制其表達的作用[27-28]，草莓FaMYB1蛋白也由于存在一個類似的EAR序列，對花青苷合成具有抑制作用[29]。在蘋果中，關(guān)于中EAR抑制序列對花青苷負(fù)調(diào)控研究尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以新疆紅肉蘋果雜種一代優(yōu)系‘紅脆6號’為試材，克隆了含有EAR序列的，測定其在不同果實及在不同脅迫處理下的表達水平與花青素的關(guān)系，通過酵母單雜和Chip-PCR分析其互作關(guān)系，并通過轉(zhuǎn)基因驗證其在花青苷合成中的功能，旨在為進一步完善花青苷合成代謝機理提供參考。

1 材料與方法

試驗于2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院進行。

1.1 植物材料和處理

植物材料為從新疆紅肉蘋果（f.）中的‘塔爾阿爾瑪’與‘煙富3號’（cv. Fuji）雜種一代選育出的‘紅脆6號’‘紅脆8號’和‘紅脆9號’優(yōu)株及‘紫紅3號’蘋果誘導(dǎo)的紅肉愈傷組織（MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)）。紅肉蘋果愈傷組織誘導(dǎo)、培育方法參照J(rèn)I等[22]。取繼代生長16 d的紅肉愈傷組織，分別用4℃和150mmol?L-1NaCl處理24 h，每隔6 h取樣一次，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取與qRT-PCR

RNA提取及qRT-PCR參考XU等[25]方法。RNA提取試劑盒（DP432）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR106）、SYBR染料（FP205）均購自北京天根公司，熒光定量每個樣品設(shè)3個重復(fù)，以蘋果為內(nèi)參，每個基因擴增均伴有內(nèi)參同時擴增，默認(rèn)條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析[30]。熒光定量引物為5′-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3′和5′-TA CTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3′，熒光定量引物為5′-CTGGAACACTCACGTCAAGC-3′，熒光定量引物為5′-GGAAACAGGTGGTC ATTGATTG-3′和5′-GGCTGAGGTCTTATCACATTG GT-3′，熒光定量引物為5′-GATAGGGTTTGA GTTCAAGTA-3′和5′-TCTCCTCAGCAGCCTCAGT TTTCT-3′，熒光定量引物為5′-GTGTCATGCA CCTTGTGAACC-3′和5′-GTAGTCCTCCCACTCAAG CTG-3′，熒光定量引物為5′-CCGCCCTTCC AAACACTCT和5′-GAGCTCTATGTCCTCCTGCG-3′。

1.3 花青苷提取和吸光度測定

花青苷提取參照J(rèn)I[22]等方法，并略作改動。稱取0.5 g植物材料在液氮中研磨成粉，用20 mL 1%（v/v）HCl-甲醇在4℃黑暗條件下萃取24 h，12 000 r/min離心10 min后保留上清液，用紫外分光光度計測定上清液在530 nm處吸光度，最后花青苷的相對含量用Abs/g（吸光度/質(zhì)量）來表示。

1.4 overlap PCR技術(shù)敲除MdMYB32蛋白C端EAR抑制序列

參考XU等[25]方法，通過overlap PCR技術(shù)敲除MdMYB32蛋白C端EAR（GDLNLDLSIG）抑制序列。具體引物設(shè)計如下，

F1：5′-ATGGGGAGAGCACCTTGTT-3′

R1：5′-ACGGCTCTAAACACTTGTATTTCTGCT GTT-3′

F2：5′-AATACAAGTGTTTAGAGCCGTTTCAG TCCAA-3′

R2：5′-TCAACCTGGCAGCACAAA-3′

以‘紅脆6號’蘋果cDNA為模板，用F1和R1引物通過PCR擴增獲得序列，用F2和R2引物通過PCR擴增獲得序列，將擴增獲得的和產(chǎn)物1﹕1混合，以它們?yōu)槟０逵肍1和R2引物通過PCR擴增獲得的產(chǎn)物即為沒有EAR抑制序列的，暫命名為LES。

1.5 MdMYB32和LESMdMYB32紅肉蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化

用引物5′-gtcgacATGGGGAGAGCACCTTGT T-3′和5′-ggatccTCAACCTGGCAGCACAAA-3′擴增得到的編碼框序列，用上述overlap-PCR方法擴增得到LES的編碼框序列，瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，連接到PLB零背景克隆載體。用I和HI對克隆載體和植物表達載體pRI101分別進行雙酶切，構(gòu)建重組表達載體pRI101-和pRI101-LES。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，在28℃下，用30 mL含50 μg·mL-1卡那霉素和50 μg·mL-1利福平的YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組農(nóng)桿菌至OD600=0.6，12 000 r/min離心收集菌體，用30 mL ddH2O懸浮，加入乙酰丁香酮并使其濃度為100 μmol·L-1，得到侵染液。取生長16 d的紅肉蘋果愈傷組織浸到侵染液中，室溫振蕩25 min，取愈傷組織置于含1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA的MS固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2 d。隨后轉(zhuǎn)移到含1 mg·L-16-BA+ 0.3 mg·L-1NAA+50 μg·m L-1卡那霉素+250 μg·mL-1羧芐青霉素的MS固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)5周左右。

1.6 酵母單雜交

用引物5′-catatgATGGGGAGAGCACCTTGT T-3′和5′-ggatccTCAACCTGGCAGCACAAA-3′擴增的編碼框序列，用引物5′-gaattcGGC TAGTTCTGTATTATGGTTGATA-3′和5′-gagctcT GATAATGTAACGTTGATTTTATAGTAG-3′擴增的啟動子序列，分別連接PLB零背景載體。用I和H I對-PLB和pGADT7分別進行雙酶切，用R I和I對-PLB和pHIS2分別進行雙酶切，構(gòu)建pGADT7-和pHIS2-重組載體。按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒（Clontech）說明書方法，將pHIS2-重組載體轉(zhuǎn)化到酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在-T-H+3-AT培養(yǎng)基中（-Trp/His，Clontech），篩選抑制酵母生長的3-AT濃度，然后將這兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在-T-H-L+3-AT培養(yǎng)基中（-Trp/ His/Leu，Clontech），觀察酵母生長情況。

1.7 Chip-PCR

Chip-PCR試驗根據(jù)HE等[31]方法，并略作改動。按照Chip Kit（Upstate，Lake Placid，NY，USA）里說明書方法進行交聯(lián)、解交聯(lián)、免疫沉淀和洗脫，免疫抗體使用GFP抗體（Abmart，Shanghai，China），最后用PCR檢測。PCR引物為：5′-CTGGTATGTACCATTCA CTTGTTG-3′和5′-CGATCATCCTCCGAGTGTC-3′。

1.8 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)用Excel 2007進行作圖和標(biāo)準(zhǔn)差分析，用DPS 7.05軟件（http://www.chinadps.net）進行顯著性檢驗，用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析方法采用Construct/Test Neighbor-Joining Tree，用Clustal X軟件分析蛋白序列。

2 結(jié)果

2.1 MdMYB32在不同蘋果果實中的表達水平

圖1為‘紅脆6號’（HC6）‘紅脆8號’（HC8）和‘紅脆9號’（HC9）優(yōu)株果實成熟期橫截面圖。由圖2和圖3可得，果實成熟期花青苷相對含量和花青苷合成結(jié)構(gòu)基因及的相對表達水平高低順序為‘紅脆9號’>‘紅脆8號’>‘紅脆6號’，控制紅肉蘋果花青苷合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的相對表達水平也是‘紅脆9號’>‘紅脆8號’>‘紅脆6號’，但的表達水平卻與之相反，為‘紅脆6號’>‘紅脆8號’>‘紅脆9號’。

2.2 MdMYB32的進化樹和蛋白序列分析

如圖4所示，促進花青苷合成的AtMYB75、FaMYB10、PpMYB10、MdMYB10和PyMYB10都在同一個進化枝上，抑制花青苷合成的AtMYB4、PhMYB4、MdMYB16、AtMYB32和FaMYB1在同一個進化枝上，而與等在同一個進化枝，推測其可能具有抑制花青苷合成的功能（圖4中比例尺0.1代表每10個氨基酸有1個不同）。由圖5可看出在MdMYB32蛋白C端存在一個10個氨基酸長度的EAR抑制序列。

圖1 蘋果果實成熟期橫截面圖

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.3 冷脅迫和鹽脅迫處理紅肉愈傷MdMYB32的表達水平分析

由圖6可知，4℃和150 mmol?L-1NaCl處理均能抑制的表達，其中4℃低溫處理后的表達水平逐漸降低，而150 mmol?L-1NaCl處理后的表達水平先降低后又輕微回升。

圖3 三個蘋果株系中花青苷合成結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相對表達水平

圖4 MYB32和相關(guān)MYB蛋白系統(tǒng)進化樹分析

圖5 MYB32和相關(guān)蛋白序列分析

圖6 冷脅迫（A）和鹽脅迫（B）處理下MdMYB32的相對表達水平

2.4 MdMYB32和LESMdMYB32在紅肉愈傷中過表達分析

紅肉愈傷組織（Rc）、過表達的紅肉愈傷（OEMYB32）和過表達LES（敲除EAR抑制序列的MdMYB32）的紅肉愈傷（OELESMYB32）如圖7所示。由圖8和圖9可知，在紅肉愈傷中過表達能夠抑制花青苷的合成和的表達，對和表達水平?jīng)]有影響，但敲除MdMYB32的EAR抑制序列后，在紅肉愈傷中過表達LES不能夠抑制花青苷的合成，且對、和的表達水平?jīng)]有影響。

Rc：紅肉愈傷組織；OEMYB32：過表達MdMYB32的紅肉愈傷；OELESMYB32：過表達LESMdMYB32（敲除EAR抑制序列的MdMYB32）的紅肉愈傷。下同 Rc: Red-fleshed callus; OEMYB32: Overexpressing MdMYB32 in red-fleshed callus; OELESMYB32: Overexpressing LESMdMYB32 (Lost EAR inhibitory sequence of MdMYB32) in red-fleshed callus. The same as below

圖8 3種愈傷花青相對苷含量

2.5 MdMYB32和LESMdMYB32與MdANS啟動子的酵母單雜交和Chip-PCR分析

由圖10酵母單雜交可知，pHIS2+ANS pro單轉(zhuǎn)Y187后培養(yǎng)在-T-H培養(yǎng)基中，通過3-AT篩選抑制酵母生長的濃度，最后在80 mmol?L-13-AT中酵母不能生長，因此啟動子的自激活濃度為80 mmol?L-13-AT，將pHIS2+ANS pro分別和pGADT7空載體、pGADT7+MYB32、pGADT7+LESMYB32共轉(zhuǎn)Y187后培養(yǎng)在-T-H-L+80 mmol?L-13-AT中，共轉(zhuǎn)pHIS2+ ANS pro和pGADT7空載體的不能生長，而共轉(zhuǎn)pHIS2+ANS pro和pGADT7+MYB32以及pHIS2+ ANS pro和pGADT7+LESMYB32的均能生長，因此，MdMYB32和LESMdMYB32均能結(jié)合的啟動子。

HARTMANN等[32]研究表明花青苷合成結(jié)構(gòu)基因啟動子上的MRE（MYB recognition element）能夠被MYB轉(zhuǎn)錄因子識別。為了進一步驗證MdMYB32和LESMdMYB32與啟動子的互作關(guān)系，在啟動子上-1 365到-1 371處，發(fā)現(xiàn)了一個MRE元件，因此，選取包含MRE元件的一段序列（-1 302到-1 475）用作Chi-PCR分析。由圖11可知，在Input中，GFP、MYB32-GFP和LESMYB32-GFP都有條帶，而在Ip中，只有MYB32-GFP和LESMYB32-GFP有條帶，因此，MYB32和LESMYB32均能結(jié)合的啟動子。

3 討論

3.1 MdMYB32能夠結(jié)合MdANS啟動子抑制花青苷的合成

在煙草中異源表達草莓時能抑制花青苷合成，是第一個被發(fā)現(xiàn)抑制花青苷合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子[29]。在矮牽牛中，能夠結(jié)合bHLH蛋白，作用于MBW復(fù)合體抑制花青苷的合成[33]，類似的作用模式在FaMYB1、VvMYBC2和MtMYB2中也被發(fā)現(xiàn)[34-36]，它們不能結(jié)合靶基因的啟動子，但它們能夠與bHLH蛋白結(jié)合，作用于MBW復(fù)合體從而發(fā)揮抑制作用。AtMYB4和PhMYB4與上述不同，它們能夠直接結(jié)合靶基因的啟動子從而發(fā)揮抑制作用[28,37]，Xu等[25]將MYB類抑制因子分為兩類，一種作用于MBW復(fù)合體發(fā)揮功能，類似于FaMYB1等；另一種能直接結(jié)合靶基因啟動子發(fā)揮功能，類似于AtMYB4。在本文中，發(fā)現(xiàn)在花青苷含量高的蘋果中表達水平較低，而在花青苷含量較低的蘋果中表達水平較高，這暗示著MdMYB32可能參與調(diào)控花青苷合成，且冷脅迫和鹽脅迫能夠抑制的表達，在紅肉愈傷中過表達發(fā)現(xiàn)，它能夠抑制的表達和花青苷的合成，進一步通過酵母單雜和Chip-PCR分析，MdMYB32能夠結(jié)合的啟動子，暗示著MdMYB32能直接結(jié)合花青苷合成結(jié)構(gòu)基因的啟動子從而抑制花青苷的合成，這與AtMYB4等類似。

圖9 3種愈傷花青苷生物合成相關(guān)基因相對表達水平

圖10 MdMYB32和LESMdMYB32與MdANS啟動子的酵母單雜交分析

圖11 MdMYB32和LESMdMYB32與MdANS啟動子的Chip-PCR分析

3.2 MdMYB32通過自身C端EAR抑制序列發(fā)揮功能

EAR基序是EAR型轉(zhuǎn)錄抑制子的共同特征，EAR基序內(nèi)氨基酸殘基的變化會導(dǎo)致抑制功能減少或喪失[38-40]。擬南芥AtERF3通過其C末端的EAR基序能抑制AtERF5與植物中GCC box的結(jié)合，然而，當(dāng)EAR基序（LDLNLAP）中D突變成A時，這種抑制功能就喪失了[39]；在擬南芥中過表達能增加鹽脅迫抗性，而ZAT7蛋白的EAR基序突變或缺失降低了轉(zhuǎn)基因植物中這種增加的抗性[41]；近年來，根據(jù)EAR型轉(zhuǎn)錄抑制子的結(jié)構(gòu)和功能，開發(fā)了一種嵌合抑制基因沉默技術(shù)，將EAR基序添加到活化劑的C末端作為嵌合蛋白融合，通過轉(zhuǎn)基因?qū)胫参飦韺崿F(xiàn)定性功能缺失[42-43]。本研究通過overlap PCR技術(shù)敲除MdMYB32蛋白C端的EAR基序（GDLNLDLSIG），暫命名為LESMdMYB32，酵母單雜交和Chip-PCR實驗表明MdMYB32和LESMdMYB32都能夠結(jié)合的啟動子，說明EAR序列的存在與否不影響MdMYB32與啟動子的結(jié)合，然而在紅肉愈傷中過表達LES后，發(fā)現(xiàn)它不能夠抑制花青苷的合成，因此，MdMYB32通過自身的EAR抑制基序來發(fā)揮功能。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)MdMYB32蛋白C端存在一個EAR抑制序列，鹽脅迫和冷脅迫均能夠抑制其表達，酵母單雜和Chip-PCR分析表明MdMYB32能夠結(jié)合的啟動子。在紅肉愈傷中過表達，能通過自身的EAR抑制基序抑制花青苷的合成。

[1] 張學(xué)英, 張上隆, 駱軍, 葉正文, 李世誠. 果實花色素苷合成研究進展. 果樹學(xué)報, 2004, 21(5): 456-460.ZHANG X Y, ZHANG S L, LUO J, YE Z W, LI S C. Advances in research on fruit anthocyanin synthesis., 2004, 21(5): 456-460. (in Chinese)

[2] ZHANG W S, LI X, ZHENG J T, WANG G Y, SUN C D, FERGUSON I B, CHEN K S. Bioactive components and antioxidant capacity of Chinese bayberry（Sieb. and Zucc.）fruit in relation to fruit maturity and postharvest storage., 2008, 227(4): 1091-1097.

[3] SUN C D, HUANG H Z, XU C J, LI X, CHEN K S. Biological activities of extracts from Chinese bayberry (Sieb. et Zucc.): A review., 2013, 68(2): 97-106.

[4] KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids, a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways., 2005, 10: 236-242.

[5] BAI S L, SAITO A, HONDA C, HATSUYAMA Y, ITO A, MORIGUCHI T. An apple B-box protein, MdCOL11, is involved in UV-Band temperature-induced anthocyanin biosynthesis., 2014, 240: 1051-1062.

[6] BALLESTER A R, MOLTHOFF J, DE VOS R, TE LINTEL H B, ORZAEZ D, FERNANDEZMORENO J P, TRIPODI P, GRANDILLO S, MARTIN C, HELDENS J, YKEMA M, GRANELL A, BOVY A. Biochemical molecular analysis of pink tomatoes, deregulated expression of the gene encoding transcription factor SlMYB12 leads to pink tomato fruit color., 2010, 152: 71-84.

[7] ALBERT N W, LEWIS D H, ZHANG H, SCHWINN K E, JAMESON P E, DAVIES K M. Members of an R2R3-MYB transcription factor family in Petunia are developmentally and environmentally regulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning., 2011, 65: 771-784.

[8] AZUMA A, KOBAYASHI S, MITANI N, SHIRAISHI M, YAMADA M, UENO T, KONO A, YAKUSHIJI H, KOSHITA Y. Genomic and genetic analysis of Myb-related genes that regulate anthocyanin biosynthesis in grape berry skin., 2008, 117: 1009-1019.

[9] WANG L K, BOLITHO K, GRAFTON K, KORTSTEE A, KARUNAIRETNAM S, MCGHIE T K, ESPLEY R V, HELLENS R P, ALLAN A C. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae., 2010, 10: 50.

[10] FENG S Q, WANG Y L, SONG Y, XU Y T, CHEN X S. Anthocyanin biosynthesis in pears is regulated by a R2R3-MYB transcription factor PyMYB10., 2010, 232: 245-255.

[11] TAKOS A M, JAFFé F W, JACOB S R, BOGS J, ROBINSON S P, WALKER A R. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples., 2006, 142(3): 1216-1232.

[12] BAN Y, HONDA C, HATSUYAMA Y, IGARASHI M, BESSHO H, MORIGUCHI T. Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin., 2007, 48: 958-970.

[13] ESPLEY R V, HELLENS R P, PUTTERILL J, STEVENSON D E, KUTTY-AMMA S, ALLAN A C. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor MdMYB10., 2007, 49: 414-427.

[14] ESPLEY R V, BRENDOLISE C, CHAGNé D, KUTTY-AMMA S, GREEN S, VOLZ R, PUTTERILL J, SCHOUTEN H J, GARDINER S E, HELLENS R P, ALLAN A C. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples., 2009, 21: 168-183.

[15] 張小燕, 陳學(xué)森, 彭勇, 王海波, 石俊, 張紅. 新疆野蘋果酚類物質(zhì)組分的遺傳多樣性. 園藝學(xué)報, 2008, 35(9): 1351-1356.ZHANG X Y, CHEN X S, PENG Y, WANG H B, SHI J, ZHANG H. Genetic diversity of phenolic compounds in., 2008, 35(9): 1351-1356. (in Chinese)

[16] 張小燕, 陳學(xué)森, 彭勇, 王海波, 石俊, 張紅. 新疆野蘋果礦質(zhì)元素與糖酸組分的遺傳多樣性. 園藝學(xué)報, 2008, 35(2): 277-280.ZHANG X Y, CHEN X S, PENG Y, WANG H B, SHI J, ZHANG H. Genetic diversity of mineral elements, sugar and acid components in(Ldb.) Roem., 2008, 35(2): 277-280. (in Chinese)

[17] ZHANG C Y, CHEN X S, HE T M, LIU X L, FENG T, YUAN Z H. Genetic structure ofpopulation from Xinjiang, China, revealed by SSR markers., 2007, 34(10): 947-955.

[18] 張艷敏, 馮濤, 張春雨, 何天明, 張小燕, 吳傳金, 劉遵春, 王艷玲, 束懷瑞, 陳學(xué)森. 新疆野蘋果研究進展. 園藝學(xué)報, 2009, 36(3): 447-452.ZHANG Y M, FENG T, ZHANG C Y, HE T M, ZHANG X Y, WU C J, LIU Z C, WANG Y L, SHU H R, CHEN X S. Advances in research of the(Lebed.) Roem., 2009, 36(3): 447-452. (in Chinese)

[19] 馮濤, 張紅, 陳學(xué)森, 張艷敏, 何天明, 馮建榮, 許正. 新疆野蘋果果實形態(tài)與礦質(zhì)元素含量多樣性以及特異性狀單株. 植物遺傳資源學(xué)報, 2006, 7(3): 270-276.FENG T, ZHANG H, CHEN X S, ZHANG Y M, HE T M, FENG J R, XU Z. Genetic diversity of fruit morphological traits and content of mineral element in(Ldb.) Roem and its elite seedlings., 2006, 7(3): 270-276. (in Chinese)

[20] 王延玲, 張艷敏, 馮守千, 宋楊, 徐玉亭, 張友朋, 陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋果果皮果肉呈色差異機理. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2771-2778.WANG Y L, ZHANG Y M, FENG S Q, SONG Y, XU Y T, ZHANG Y P, CHEN X S. The mechanism of red coloring difference between skin and cortexf.(Dieck) Langenf., 2012, 45(13): 2771-2778. (in Chinese)

[21] 許海峰, 王楠, 姜生輝, 王意程, 劉靜軒, 曲常志, 王得云, 左衛(wèi)芳, 張晶, 冀曉昊, 張宗營, 毛志泉，陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋果雜種一代4個株系類黃酮含量及其合成相關(guān)基因表達分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(16): 3174-3187.XU H F, WANG N, JIANG S H, WANG Y C, LIU J X, QU C Z, WANG D Y, ZUO W F, ZHANG J, JI X H, ZHANG Z Y, MAO Z Q, CHEN X S. Content and analysis of biosynthesis-related genes of flavonoid among four strains off.F1population., 2016, 49(16): 3174-3187. (in Chinese)

[22] JI X H , WANG Y T , ZHANG R, WU S J , AN M M, LI M, WANG C Z , CHEN X L , ZHANG Y M , CHEN X S. Effect of auxin, cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red-fleshed apple (f.)., 2015, 120: 325-337.

[23] JI X H, ZHANG R, WANG N, YANG L, CHEN X S. Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus (f.)., 2015, 123: 389-404.

[24] WANG N, ZHENG Y, DUAN N B, ZHANG Z Y, JI X H, JIANG S H, SUN S S, YANG L, BAI Y, FEI Z J, CHEN X S.Comparative transcriptomes analysis of red and white-fleshed apples in an F1populationoff.crossed with‘Fuji’., 2015. Doi:10.1371/journal.pone. 0133468, 2015.

[25] XU H F, WANG N, LIU J X, QU C Z, WANG Y C, JIANG S H, LU N L, WANG D Y, ZHANG Z Y, CHEN X S. The molecular mechanism underlying anthocyanin metabolism in apple using theandgenes., 2017, 94: 149-165.

[26] WANG N, XU H F, JIANG S H, ZHANG Z Y, LU N L, QIU H R, QY C Z, WANG Y C, WU S J, CHEN X S. MYB12 and MYB22 play essential roles in proanthocyanidin and flavonol synthesis in red-fleshed apple (f.)., 2017, 90: 276-292.

[27] JIN H L, COMINELLI E, BAILEY P, PARR A, MEHRTENS F, JONES J, TONELLI C. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in., 2000, 19: 6150-6161.

[28] HEMM M R, HERRMANN K M, CHAPPLE C. AtMYB4: A transcription factor general in the battle against UV., 2001, 6(4): 135-136.

[29] AHARONI A, DE VOS C, WEIN M, SUN Z, GRECO R, KROON A, MOL J N, O’CONNELL A P. The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco., 2001, 28(3): 319-332.

[30] KENNETH J L, THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod., 2001, 25: 402-408.

[31] HE J X, GENDRON J M, SUN Y, GAMPALA S S L, GENDRON N, SUN C Q, WANG Z. BZR1 is a transcriptional repressor with dual roles in brassinosteroid homeostasis and growth responses., 2005, 307: 1634-1638.

[32] HARTMANN U, SAGASSER M, MEHRTENS F, STRACKE R, WEISSHAAR B. Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by R2R3-MYB，BZIP，and BHLH factors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes., 2005, 57(2): 155-171.

[33] ALBERT N W, DAVIES K M, LEWIS D H, ZHANG H, MONTEFIORI M, BRENDOLIS C, BOASE M R, NGO H, JAMESON P E, SCHWINN K E. A conserved network of transcriptional activators and repressors regulates anthocyanin pigmentation in eudicots., 2014, 26: 962-980.

[34] PAOLOCCI F, ROBBINS M P, PASSERI V, HAUCK B, MORRIS P, RUBINI A, ARCIONI S, DAMIANI F. The strawberry transcription factor FaMYB1 inhibits the biosynthesis of proanthocyanidins in Lotus corniculatus leaves., 2011, 62(3): 1189-1200.

[35] JUN J Y, LIU C G, XIAO X R, DIXON R A. The Transcriptional repressor MYB2 regulates both spatial and temporal patterns of proanthocyandin and anthocyanin pigmentation in., 2015. doi:10.1105/tpc.15.00476.

[36] CAVALLINI E, MATUS J T, FINEZZO L, ZENONI S, LOYOLA R, GUZZO F, SCHLECHTER R, AGEORGES A, ARCE-JOHNSON P, TORNIELLI G B. The phenylpropanoid pathway is controlled at different branches by a set of R2R3-MYB C2 repressors in grapevine., 2015, 167: 1448-1470.

[37] COLQUHOUN T A, KIM J Y, WEDDE A E, LEVIN L A, SCHMITT K C, SCHUURINK R C, CLARK D G. PhMYB4 fine-tunes the floral volatile signature of×through PhC4H., 2011, 62: 1133-1143.

[38] OHTA M, MATSUI K, SHINSHI H, OHME-TAKAGI M. Repression domains of class II ERF transcriptional repressors share an essential motif for active repression., 2001, 13: 1959-1968.

[39] TIWARI S B, WANG X J, HAGEN G, GUILFOYLE T J. Aux/IAA proteins are active repressors and their stability and activity are modulated by auxin., 2001, 13: 2809-2822.

[40] TIWARI S B, HAGEN G, GUILFOYLE T J. Aux/IAA proteins contain a potent transcriptional repression domain., 2004, 16: 533-543.

[41] CIFTCI-YILMAZ S, MORSY M R, SONG L H, COUTU A, KRIZEK B A, LEWIS M W, WARREN D, CUSHMAN J, CONNOLLY E L, MITTLER R. The EAR-motif of the Cys2/His2-type zinc finger protein Zat7 plays a key role in the defense response ofto salinity stress., 2007, 282: 9260-9268.

[42] MITSUDA N, TODAKA D, NAKASHIMA K, YAMAGUCHI- SHINOZAKI K, OHME-TAKAGI M. Efficient production of male and female sterile plants by expression of a chimeric repressor inand rice., 2006, 4: 325-332.

[43] KAM J, GRESSHOFF P M, SHORTER R, XUE G P. The Q-type C2H2 zinc finger subfamily of transcription factors inis predominantly expressed in roots and enriched with members containing an EAR repressor motif and responsive to drought stress., 2008, 67(3): 305-322.

Apple MdMYB32 Inhibits the Anthocyanin Biosynthesis by Its Own EAR Inhibitory Sequence

XU HaiFeng, YANG GuanXian, WANG YiCheng, JIANG ShengHui, WANG Nan, CHEN XueSen

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology,Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】In order to improve the metabolic mechanism of anthocyanin synthesis, several aspects of apple MdMYB32 in MYB transcription factors were studied, including the bio-informatics, the expression level and the function in the anthocyanin synthesis.【Method】 We cloned thef.F1 population and analyzed its phylogenetic tree and protein sequence. The expression level of【Result】qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwas negatively correlated with the content of anthocyanin. Both salt stress and cold stress could inhibit the expression of. The phylogenetic tree indicated that,,andwere located in the same evolutionary branch, and MdMYB32 protein contained an EAR inhibitory sequence at the C-terminus. Overexpressingand reduce the anthocyanin content. However, when we overexpressed LES(knocked out the EAR sequence of) in red-fleshed callus, we found that it could not affect the expression ofand the anthocyanin content. Yeast one-hybrid and Chip-PCR analyses showed that MdMYB32 and LESMdMYB32 could bind the promoter of.【Conclusion】MdMYB32 could bind the promoter ofand inhibit the anthocyanin biosynthesis by its own EAR inhibitory sequence.

apple; MYB transcription factors;; EAR inhibitory sequence; yeast one-hybrid

2018-06-22；

2018-07-16

國家自然科學(xué)基金（31572091，31730080）、國家重點研發(fā)計劃（SQ2016YFSF030011）

許海峰，E-mail：997524744@qq.com。

陳學(xué)森，E-mail：chenxs@sdau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.009

（責(zé)任編輯 趙伶俐）