GT和GATA轉(zhuǎn)錄因子對甘藍(lán)型油菜BnA5.FAD2和BnC5.FAD2啟動子功能的調(diào)控

劉芳，肖鋼，官春云

?

GT和GATA轉(zhuǎn)錄因子對甘藍(lán)型油菜和啟動子功能的調(diào)控

劉芳1，肖鋼2，官春云1

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家油料改良中心湖南分中心，長沙 410128；2湖南省水稻油菜抗病育種重點實驗室，長沙 410128）

【目的】脂肪酸去飽和酶2基因（）是控制油菜中油酸含量的重要基因，通過研究GATA和GT轉(zhuǎn)錄因子與和啟動子的互作關(guān)系及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為高油酸油菜育種提供分子理論基礎(chǔ)。【方法】通過缺失啟動子片段及生物信息學(xué)分析，預(yù)測和啟動子區(qū)潛在順式作用元件；從PlantTFDB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中篩選候選轉(zhuǎn)錄因子，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)規(guī)律，并與和表達(dá)規(guī)律對比，進一步篩選候選轉(zhuǎn)錄因子；利用酵母單雜交驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子序列的互作情況；將轉(zhuǎn)錄因子與和啟動子序列共轉(zhuǎn)入擬南芥，通過Western blot檢測報告基因GFP的蛋白表達(dá)情況，分析轉(zhuǎn)錄因子對于啟動子功能的影響?！窘Y(jié)果】單獨敲除和啟動子中的GT或GATA順式作用元件后，GFP蛋白豐度均下降，表明GT和GATA順式作用元件在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。酵母單雜交結(jié)果顯示，GATA家族轉(zhuǎn)錄因子（、和）和GT家族轉(zhuǎn)錄因子（和）可以與和啟動子相互作用。Western blot結(jié)果顯示，當(dāng)GATA家族轉(zhuǎn)錄因子與含有GATA元件的啟動子片段共轉(zhuǎn)化擬南芥時，GFP蛋白含量明顯高于無轉(zhuǎn)錄因子時，當(dāng)敲除GATA元件時，GFP蛋白含量無明顯變化；當(dāng)GT家族轉(zhuǎn)錄因子與含有GT元件的啟動子片段共轉(zhuǎn)化擬南芥時，GFP蛋白含量有明顯變化，當(dāng)敲除GT元件時，GFP蛋白含量無明顯變化?！窘Y(jié)論】GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子Bna010243-1、Bna026124-1和Bna026124-2可以與和啟動子中GATA元件相互作用，增強基因的表達(dá)水平。GT家族的轉(zhuǎn)錄因子Bna010915可以與和啟動子中的GT元件發(fā)生互作，正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)；Bna013749通過與和啟動子中的GT元件發(fā)生互作，負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

甘藍(lán)型油菜；GATA轉(zhuǎn)錄因子；GT轉(zhuǎn)錄因子；啟動子；啟動子

0 引言

【研究意義】油酸是多種脂肪酸的前體，通常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，以油酸-CoA、油酸-PLA、油酸-DAG、油酸-PC和油酸-TAG等形式參與油酸代謝。脂肪酸去飽和酶基因（）是負(fù)責(zé)將油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸的關(guān)鍵基因，甘藍(lán)型油菜中位于A5和C5染色體上的對于油菜種子中油酸含量具有重要影響[1]。目前，高油酸育種及其形成機理已然成為各類油料作物的研究熱點[2]。通過研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為高油酸油菜育種提供分子理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前，植物脂肪酸去飽和酶主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控[3]，而且的轉(zhuǎn)錄水平受外界刺激影響。例如，在低溫誘導(dǎo)下，棉花轉(zhuǎn)錄物水平增加[4]；釀酒酵母中油酸調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平會被外源性不飽和脂肪酸抑制，但在缺氧條件下轉(zhuǎn)錄水平會增加[5]。真核生物的轉(zhuǎn)錄過程十分復(fù)雜，需要多種轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子多與啟動子上的特異序列結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平。GATA家族轉(zhuǎn)錄因子通過識別并結(jié)合GATA元件調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平。GATA家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于動、植物和真菌中，對（T/A）GATA（A/G）序列具有很高的親和力。1991年首次發(fā)現(xiàn)GATA-1，與GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5、GATA-6組成GATA家族[6]。GATA元件通常位于啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點的上游和增強子中[7]。在植物中，發(fā)現(xiàn)含有GATA序列的I-box元件存在于rbcs、cab和nia啟動子的上游，對光和晝夜節(jié)律有響應(yīng)[8]。GT轉(zhuǎn)錄因子通常與GT元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)以響應(yīng)內(nèi)、外部刺激。目前，僅在植物中發(fā)現(xiàn)GT轉(zhuǎn)錄因子[9]，與之結(jié)合的GT元件通常是富含T和A的核心序列[10]。GT轉(zhuǎn)錄因子最初在豌豆核中被發(fā)現(xiàn)，與GT-1元件結(jié)合[11]。研究表明GT元件可以參與光調(diào)節(jié)[12-13]，參與野生大麥水分脅迫的調(diào)節(jié)[14]。GT元件的拷貝數(shù)以及拷貝之間的間隔對啟動子的轉(zhuǎn)錄功能都有影響[15]。不同的GT轉(zhuǎn)錄因子與GT元件結(jié)合后，會發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能[16]。Le Gourrierec等[17]發(fā)現(xiàn)GT-1轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合并穩(wěn)定酵母細(xì)胞中的TF IIA-TBP-TATA復(fù)合物以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，認(rèn)為GT-1轉(zhuǎn)錄因子可以與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)合直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，高油酸育種已成為研究熱點，對于的研究也較普遍，但對于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過敲除部分啟動子片段來研究2個啟動子和的同源區(qū)域，并找到控制基因表達(dá)的關(guān)鍵啟動子區(qū)域。通過PlantCARE網(wǎng)站分析，獲得潛在的調(diào)控元件，借助PlantTFDB網(wǎng)站篩選可能與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，繼而分別在酵母和擬南芥中驗證啟動子序列和轉(zhuǎn)錄因子的互作關(guān)系，為高油酸油菜育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍(lán)型油菜湘油15種在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地大田，于2017年3月至5月取不同生長時期的種子。擬南芥（，Col-0）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所提供，種在培養(yǎng)箱內(nèi)，24℃/16 h光照，22℃/8 h黑暗培養(yǎng)。pEASY-T1載體、大腸桿菌T1感受態(tài)購于北京全式金公司。酵母菌種Y187（-Trp/-Leu/-His）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室饋贈，酵母單雜交報告載體pHIS2、pGADT7載體、PRI101載體為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料研究所保存。本研究中所用引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.2 BnA5.FAD2和BnC5.FAD2啟動子同源區(qū)的分析

啟動子區(qū)分為4個不同的區(qū)域，分別命名為A（-1—-213 bp）、B（-214—-225 bp）、C（-226—-314 bp）和D（-315—-685 bp），分別構(gòu)建載體HM-DCBA：GUS/GFP（-685—-1 bp+內(nèi)含子）、HM-CBA：GUS/GFP（-314—-1 bp+內(nèi)含子）、HM-BA：GUS/GFP（-225—-1 bp+內(nèi)含子）和HM-A（-213—-1 bp +內(nèi)含子）（圖1-a）。啟動子區(qū)分為4個不同的區(qū)域，分別命名為A′（-1—-215 bp）、B′（-216—-227 bp）、C′（-228—-312 bp）和D′（-313—-671 bp），分別構(gòu)建載體HM-D′C′B′A′：GUS/GFP（-671—-1 bp+內(nèi)含子）、HM-C′B′A′：GUS/GFP（-312—-1 bp+內(nèi)含子）、HM-B′A′：GUS/GFP（-227—-1 bp+內(nèi)含子）和HM-A′（-215—-1 bp+內(nèi)含子）（圖1-b）。分別敲除C、C′區(qū)域，構(gòu)建植物表達(dá)載體（圖1-c和圖1-d）。分別敲除GT元件和GATA元件核心序列，構(gòu)建植物表達(dá)載體（圖2-a和圖2-b）。載體構(gòu)建中所用引物見電子附表1。所有構(gòu)建的載體通過凍融法[18]轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中。然后通過花序浸染法轉(zhuǎn)化野生擬南芥[19]。在含有50 mg·L-1潮霉素B的MS平板上篩選轉(zhuǎn)基因植株，然后移植到土壤中培養(yǎng)。從T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中提取總蛋白質(zhì)，通過Western blot檢測GFP蛋白含量，具體操作參考劉睿洋等[20]方法。

1.3 GATA家族和GT家族基因的篩選及克隆

利用PlantTFDB網(wǎng)站分析，從甘藍(lán)型油菜中獲得31個GATA轉(zhuǎn)錄因子基因，其中19個完整序列，與油菜數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org/brad/）保持高度同源性的序列共16個。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表達(dá)模式，以cDNA為模板，選擇作為內(nèi)參基因，每個模板3個重復(fù)，進行qRT-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq 9 μl、引物各0.5 μl、模板1 μl，ddH2O補齊20 μl。PCR反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以甘藍(lán)型油菜基因組為模板，克隆GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子基因（、、和）和GT家族轉(zhuǎn)錄因子（和）。

1.4 酵母單雜交鑒定啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的互作

根據(jù)Infusion試劑盒（TaRaKa，Japan）說明書，將和啟動子克隆到pHIS2.0載體中的GAL4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，將GATA家族和GT家族轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列與pGADT7載體中的GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合。

將pHIS2-A5-promoter和pHIS2-C5-promoter載體分別轉(zhuǎn)化到營養(yǎng)缺陷型酵母菌株Y187，篩選出陽性菌株后將其涂布到SD-Trp固體平板和含不同濃度3-AT（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 mmol·L-1）的固體SD-Trp-His培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3—5 d，觀察其生長情況，篩選最適3-氨基-1,2,4-唑（3-AT）生長濃度。按照電子附表2的組合進行酵母轉(zhuǎn)化，驗證GATA和GT家族基因的功能。將含有轉(zhuǎn)化子的酵母菌涂在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上（SD-Trp、SD-Trp-Leu-His+適當(dāng)濃度的3-AT），30℃培養(yǎng)3—5 d。觀察酵母生長情況。

1.5 在擬南芥中的分析轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的互作情況

為了鑒定轉(zhuǎn)錄因子基因、、、和的功能，將其分別克隆并與pRI101載體連接，篩選標(biāo)記為卡那霉素，構(gòu)建載體時將血細(xì)胞凝集素（HA）標(biāo)簽與轉(zhuǎn)錄因子基因融合，同時轉(zhuǎn)入載體pRI101，便于進一步檢測是否轉(zhuǎn)化成功。構(gòu)建載體命名為pRI101-Bna010243-1∷HA、pRI101-Bna026124-1∷HA、pRI101-Bna026124- 2∷HA、pRI101-Bna010915∷HA和pRI101-Bna013749∷HA。將以上載體分別轉(zhuǎn)化已含有和啟動子片段的擬南芥。經(jīng)50 mg·L-1潮霉素B+70mg·L-1卡那霉素的MS平板篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥，然后移植到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。從T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中提取總蛋白質(zhì)通過Western blot檢測HA蛋白含量，用于判斷轉(zhuǎn)錄因子是否成功轉(zhuǎn)化擬南芥，通過Western blot檢測GFP蛋白含量用于判斷轉(zhuǎn)錄因子對于啟動子功能的影響，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否與啟動子序列互作，具體操作同1.2。

2 結(jié)果

2.1 GT和GATA順式作用元件在調(diào)節(jié)BnA5.FAD2和BnC5.FAD2轉(zhuǎn)錄中的作用

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料研究所前期克隆了和啟動子序列[21-22]，二者約680 bp序列（，686 bp；，676 bp）保持91%的同源性，這一同源區(qū)域?qū)τ诨虮磉_(dá)量的貢獻巨大。和啟動子區(qū)分別分為4個區(qū)域A（A′）、B（B′）、C（C′）和D（D′），構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，采用Western blot技術(shù)檢測報告基因GFP的蛋白豐度。結(jié)果顯示，當(dāng)區(qū)域D和D′缺失時，GFP蛋白的豐度增加，表明該區(qū)域可能存在一些負(fù)向調(diào)控元件，抑制基因表達(dá)。隨著區(qū)域C和C′的進一步缺失，GFP蛋白豐度下降，預(yù)示該區(qū)域中存在一些用于控制基因表達(dá)的正調(diào)控元件；進一步敲除區(qū)域B和B′后，HM-A（A′）的GFP蛋白豐度一定程度的高于HM-BA（B′A′），即GFP蛋白豐度呈現(xiàn)增加的現(xiàn)象，說明B（B′）區(qū)存在一些負(fù)調(diào)控元件調(diào)節(jié)基因表達(dá)（圖1-e和圖1-f）?？梢?，啟動子C（-226—-314 bp）區(qū)域和啟動子C′（-228—-312 bp）區(qū)域是保持基因高度表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域。

a：BnA5.FAD2啟動子不同長度同源區(qū)的載體構(gòu)建模式圖；b：BnC5.FAD2啟動子不同長度同源區(qū)的載體構(gòu)建模式圖；c：敲除BnA5.FAD2啟動子的C區(qū)域后構(gòu)建載體模式圖；d：敲除BnC5.FAD2啟動子C′區(qū)域后構(gòu)建載體模式圖；e：含有不同長度BnA5.FAD2啟動子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；f：含有不同長度 BnC5.FAD2啟動子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；g：含有敲除C區(qū)域的BnA5.FAD2啟動子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；h：含有敲除C′區(qū)域的BnA5.FAD2啟動子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測

為了進一步驗證C（-226—-314 bp）區(qū)域和C′（-228—-312 bp）的功能，分別敲除這兩個區(qū)域并構(gòu)建載體-C和-C′（圖1-c和圖1-d）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，區(qū)域C和C′缺失時，GFP蛋白質(zhì)豐度均降低（圖1-g和圖1-h）。表明啟動子的-226—-314 bp和啟動子的-228—-312 bp是控制甘藍(lán)型油菜種子中和表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域。

啟動子的-226—-314 bp和啟動子的-228—-312 bp僅存在一個堿基差異，經(jīng)PlantCARE軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)這兩個區(qū)域均存在GT和GATA順式作用元件，分別為GT家族和GATA家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。分別敲除2個元件并構(gòu)建載體-GT和-GATA與-GT′和GATA′（圖2-a和圖2-b），轉(zhuǎn)化擬南芥進行功能分析。結(jié)果顯示，分別單獨敲除BnC5.FAD2啟動子的GT和GATA順式作用元件后，均會造成GFP蛋白豐度顯著下降（圖2-d），表明啟動子的GT和GATA順式作用元件在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。分別單獨敲除2啟動子的GT和GATA順式作用元件后，GFP蛋白豐度顯著下降（圖2-c），表明啟動子中GT和GATA順式作用元件在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。

a：敲除BnA5.FAD2啟動子GT、GATA元件后構(gòu)建載體模式圖；b：敲除BnC5.FAD2啟動子GT、GATA元件后構(gòu)建載體模式圖；c：敲除BnA5.FAD2啟動子的GT、GATA元件后轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；d：敲除BnC5.FAD2啟動子的GT、GATA元件后轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測

2.2 GATA家族和GT家族基因的表達(dá)分析和蛋白序列分析

通過qRT-PCR分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)規(guī)律（圖3），發(fā)現(xiàn)GATA轉(zhuǎn)錄因子家族中的表達(dá)規(guī)律與一致，而、和的表達(dá)規(guī)律與一致；GT轉(zhuǎn)錄因子家族中的表達(dá)規(guī)律與一致，的表達(dá)規(guī)律與一致。

a：油菜種子不同發(fā)育時期GATA家族基因表達(dá)分析；b：油菜種子不同發(fā)育時期GT家族基因表達(dá)分析；c：油菜種子不同發(fā)育時期BnA5.FAD2表達(dá)分析；d：油菜種子不同發(fā)育時期BnC5.FAD2表達(dá)分析

以甘藍(lán)型油菜湘油15基因組和cDNA基因組序列為模板，克隆GATA家族和GT家族基因，分別為（903 bp，301）、（594 bp，198）、（567 bp，189）、（963 bp，321）、（546 bp，182）、（582 bp，194）、（681 bp，227）和（1 239 bp，413）。GATA家族蛋白均具有保守的單個18個殘基的鋅指結(jié)構(gòu)（CX2CX18CX2C），與其他作物中GATA蛋白結(jié)構(gòu)相同（圖4-a），GT家族中Bna013749蛋白和Bna010915蛋白的3個α-螺旋構(gòu)成Trihelix結(jié)構(gòu)，而且每個串聯(lián)重復(fù)區(qū)具有1個色氨酸殘基，符合W-Xn-W-Xn-W的結(jié)構(gòu)特點，Bna010915蛋白第3個α-螺旋中的保守W被F替代（圖4-b），與GT-2家族的結(jié)構(gòu)特點相同[23]，可能屬于GT-2亞家族成員。

a：GATA家族蛋白序列分析；b：GT家族蛋白序列分析

2.3 GATA和GT家族在酵母中的功能分析

為了排除報告基因基底水平表達(dá)的影響，需確定適當(dāng)濃度的3-AT，排除干擾。結(jié)果表明，pHIS2-A5- promoter的最佳濃度為50 mmol·L-1，pHIS2-C5-promoter動子的最佳濃度為35 mmol·L-1（圖5-a）。將共轉(zhuǎn)化的酵母菌液涂布在SD-Trp-Leu（SD-TL）和SD-Trp- Leu-His（SD-TLH）+3-AT（35 mmol·L-1/50 mmol·L-1）的固體培養(yǎng)基上，并在30℃條件下孵育。觀察生長情況3—5 d（圖5-b），所有共轉(zhuǎn)化的酵母組合物可以在SD-T-L固體培養(yǎng)基平板上正常生長。在SD-TL-H+ 50 mmol·L-13-AT三缺板上，與pHIS2-A5-promoter共轉(zhuǎn)化酵母的Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915、Bna013749可以生長，即表明Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749可以與啟動子相互作用。在SD-T-L-H+35 mmol·L-13-AT三缺板上，與pHIS2-C5-promoter共轉(zhuǎn)化酵母的Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749可以生長，即表明啟動子也可與Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749相互作用。

a：選擇合適的3-AT濃度；b：轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的互作分析

2.4 GATA和GT家族在擬南芥中與BnA5.FAD和BnC5. FAD2啟動子互作分析

將GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的、和分別構(gòu)建到pRI101載體中，然后分別轉(zhuǎn)化具有HM-CBA、HM-C′B′A′、-GATA或-GATA′的轉(zhuǎn)基因擬南芥，（圖6-i和圖6-j）；將GT轉(zhuǎn)錄因子家族的和分別構(gòu)建到pRI101載體中，轉(zhuǎn)化具有HM-CBA、HM-C′B′A′、-GT和-GT′的轉(zhuǎn)基因擬南芥（圖6-k和圖6-l）。經(jīng)western blot檢測證明轉(zhuǎn)錄因子均轉(zhuǎn)染擬南芥，并且可以正常表達(dá)（圖6-m）。檢測報告基因GFP蛋白豐度的變化，鑒定轉(zhuǎn)錄因子與或啟動子互作與否（圖6），當(dāng)擬南芥含有GATA家族轉(zhuǎn)錄因子基因之一和HM-CBA或HM-C′B′A′時，GFP蛋白質(zhì)豐度有不同程度的增加（圖6-a和圖6-e）。但當(dāng)GATA順式作用元件被敲除時，GFP蛋白豐度沒有顯著變化（圖6-b和圖6-f）。說明轉(zhuǎn)錄因子基因、和可以與或啟動子發(fā)生相互作用，而且作用位點在GATA元件這一位置，而且互作的結(jié)果均是提高基因表達(dá)量。當(dāng)和HM-CBA或HM-C′B′A′共轉(zhuǎn)化擬南芥時，相對于僅含有HM-CBA或HM-C′B′A′的擬南芥，GFP蛋白豐度略有增加（圖6-c和圖6-g）；當(dāng)基因和HM-CBA或HM-C′B′A′共轉(zhuǎn)化到擬南芥中時，GFP蛋白豐度降低（圖6-c和圖6-g）；當(dāng)GT順式元件被敲除時，共轉(zhuǎn)化之后的擬南芥GFP蛋白豐度沒有顯著變化（圖6-d和圖6-h）。推測Bna010915可能作為一個正調(diào)控因子，Bna013749作為一個負(fù)調(diào)控因子，二者均可與或啟動子區(qū)的GT元件相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。

a：啟動子BnA5.FAD2與GATA家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；b：敲除GATA元件后的啟動子BnA5.FAD2與GATA家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；c：啟動子BnA5.FAD2與GT家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；d：敲除GT元件后的啟動子BnA5.FAD2與GT家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；e：啟動子BnC5.FAD2與GATA家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；f：敲除GATA元件后的啟動子BnC5.FAD2與GATA家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；g：啟動子BnC5.FAD2與GT家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；h：敲除GT元件后的啟動子BnC5.FAD2與GT家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的互作分析；i—l：啟動子和轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)化擬南芥的模式圖；m：轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中表達(dá)檢測圖

a: interaction analysis between promoterand GATA family transcription factors in; b: interaction analysis between promoterlacking GATA cis-element and GATA family transcription factors in; c: interaction analysis between promoterand GT family transcription factors in; d: interaction analysis between promoterlacking GT cis-element and GATA family transcription factors in; e: interaction analysis between promoterand GATA family transcription factors in; f: interaction analysis between promoterlacking GATA cis-element and GATA family transcription factors in; g: interaction analysis between promoterand GT family transcription factors in; h: interaction analysis between promoterlacking GT cis-element and GATA family transcription factors in; i-l: model diagram of co-transformation promoters and transcription factors into; m: Expression detection of transcription factors in

圖6 轉(zhuǎn)錄因子和啟動子在擬南芥中的互作分析

Fig. 6 The interaction analysis of transcription factor and promoters in

3 討論

3.1 GT轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作功能分析

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因調(diào)控中起重要作用，這一過程涉及多種順式作用元件和反式作用因子。啟動子上的順式作用元件與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的起始，轉(zhuǎn)錄效率以及時空特異性[24]。本研究預(yù)測到2個潛在順式元件GATA和GT，與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子為GATA家族和GT家族轉(zhuǎn)錄因子。

GT元件首先在豌豆葉中的rbcS-3A啟動子中被鑒定為光反應(yīng)元件[11]，但在多數(shù)啟動子中功能不明確。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)GT元件或GATA元件分別被單獨敲除時，報告基因GFP的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的降低，初步說明GT和GATA可能與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合后調(diào)控基因的表達(dá)上調(diào)。在水稻低表達(dá)的成熟組織中，屬于GT家族的OsGT-2轉(zhuǎn)錄因子可以上調(diào)的表達(dá)量，將水稻啟動子轉(zhuǎn)入煙草原生質(zhì)體中分析，發(fā)現(xiàn)也是表現(xiàn)為上調(diào)因子的功能[25]。GT元件結(jié)合GT轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平以抵抗不利環(huán)境[26]。GT家族基因?qū)儆赥rihelix家族，Trihelix家族是植物所特有的[27]，而且trihelix結(jié)構(gòu)域具有高度保守性[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，GT家族基因和均具有trihelix結(jié)構(gòu)，且符合W-Xn-W-Xn-W結(jié)構(gòu)特點，其中Bna010915蛋白第3個α-螺旋中的保守W被F替代，與GT-2家族的結(jié)構(gòu)特點相同，可能屬于GT-2亞家族成員。研究發(fā)現(xiàn)ASIL1屬于trihelix家族的新的亞科，作為擬南芥種子基因中的負(fù)調(diào)節(jié)因子[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于和啟動子也起到負(fù)調(diào)控的作用，與ASIL1功能相似，推測其可能與ALIL1屬于同一亞科。

3.2 GATA轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的互作功能分析

GATA家族轉(zhuǎn)錄因子識別GATA元件并與WGATAR（W是T或A；R是G或A）序列結(jié)合[30]。該家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常具有廣泛存在于真核生物中的Ⅳ鋅指（CX2CX17-20CX2C）的結(jié)構(gòu)[31]。本文中克隆的GATA轉(zhuǎn)錄因子基因都具有Ⅳ鋅指（CX2CX18CX2C）（圖4），和啟動子上含有WGATAR序列，推測本研究中克隆的GATA轉(zhuǎn)錄因子可能與和啟動子上的GATA序列相互作用，參與基因表達(dá)的調(diào)控，但需要進一步的試驗驗證。酵母單雜交試驗以及轉(zhuǎn)錄因子Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2與部分啟動子序列（HM-CBA或HM-C′B′A′）共轉(zhuǎn)染擬南芥的試驗結(jié)果表明，、、可以與和啟動子中GATA元件相互作用（圖6），而且3個轉(zhuǎn)錄因子均表現(xiàn)為正向調(diào)控的功能。

4 結(jié)論

GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子Bna010243-1、Bna026124- 1、Bna026124-2可以與和啟動子中GATA元件相互作用，增強基因的表達(dá)水平。GT家族的轉(zhuǎn)錄因子Bna010915可以與和基動子中的GT元件發(fā)生互作，正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)；Bna013749通過與啟動子和啟動子的GT元件發(fā)生互作，負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

[1] Yang Y Y, Yang S Q, Chen Z H, Guan C Y, Chen S Y, Liu Z S. QTL analysis of 18-C unsaturated fatty acid contents in zero-erucic rapeseed (L.)., 2011, 37(8): 1342-1350.

[2] Nabloussi A, Fernándezmartínez J M, Velasco L. Inheritance of mid and high oleic acid content in Ethiopian mustard., 2006, 46(6): 2361-2367.

[3] Chapman K D, Dyer J M, Mullen R T. Biogenesis and functions of lipid droplets in plants: Thematic Review Series: Lipid Droplet Synthesis and Metabolism: from Yeast to Man., 2012, 53(2): 215-226.

[4] Kargiotidou, A, Deli D, Galanopoulou D, Tsaftaris A, Farmaki T. Low temperature and light regulate delta 12 fatty acid desaturase () at a transcriptional level in cotton ().,2008, 59(8): 2043-2056.

[5] Martin C E, Oh C, Jiang Y. Regulation of long chain unsaturated fatty acid synthesis in yeast., 2007, 1771(3): 271-285.

[6] 吳秀麗, 李揚秋. 造血轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的研究進展. 國外醫(yī)學(xué)輸血及血液學(xué)分冊. 2001, 24(5): 387-390.Wu X L, Li Y Q. Research progress of hematopoietic transcription factor GATA-3., 2001, 24(5): 387-390. (in Chinese)

[7] 袁岐, 張春利, 趙婷婷, 許向陽. 植物中GATA轉(zhuǎn)錄因子的研究進展. 分子植物育種, 2017(5): 1702-1707.Yuan Q, Zhang C L, Zhao T T, Xu X Y. Research of advances GATA transcription factor in plant., 2017(5): 1702-1707. (in Chinese)

[8] Rastogi R, Bate N J,Sivasankar S, Rothstein S J. Footprinting of the spinach nitrite reductase gene promoter reveals the preservation of nitrate regulatory elements between fungi and higher plants.,1997, 34(3): 465-476.

[9] Green P J, Kay S A, Chua N H. Sequence-specific interactions of a pea nuclear factor with light-responsive elements upstream of the rbcS-3A gene., 1987, 6(9): 2543-2549.

[10] McCarty D R, Chory J. Conservation and innovation in plant signaling pathways., 2000, 103(2): 201-209.

[11] Villain P, Clabault G, Mache R, Zhou D X. S1F binding site is related to but different from the light-responsive GT-1 binding site and differentially represses the spinach rps1 promoter in transgenic tobacco.,1994, 269(24): 16626-16630.

[12] Dehesh K, Smith L G, Tepperman J M, Quail P H. Twin autonomous bipartite nuclear localization signals direct nuclear import of GT-2., 1995, 8(1): 25-36.

[13] Dehesh K, Hung H, Tepperman J M, Quail P H. GT-2: a transcription factor with twin autonomous DNA-binding domains of closely related but different target sequence specificity., 1992, 11(11): 4131-4144.

[14] Suprunova T, Krugman T, Distelfeld A, Fahima T, Nevo E, Korol A. Identification of a novel gene (Hsdr4) involved in water-stress tolerance in wild barley., 2007, 64(1/2): 17-34.

[15] Mehrotra R, Kiran K, Chaturvedi C P, Ansari S A, Lodhi N, Sawant S, Tuli R. Effect of copy number and spacing of the ACGT and GT cis elements on transient expression of minimal promoter in plants., 2005, 84(2): 183-187.

[16] Guan Q L, Chen H X, Zhang Y, Li Q L. Progresses on GT elements and GT factors in plants., 2009, 31(2): 123-130.

[17] Le Gourrierec J, Li Y F, Zhou D X. Transcriptional activation by Arabidopsis GT-1 may be through interaction with TFIIA-TBP- TATA complex., 1999, 18(6): 663-668.

[18] An G. Binary ti vectors for plant transformation and promoter analysis., 1987, 153(153C): 292-305.

[19] Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for-mediated transformation of., 1998, 16: 735-743.

[20] 劉睿洋, 劉芳, 張振乾, 官春云. 甘藍(lán)型油菜基因啟動子及內(nèi)含子在表達(dá)水平的功能分析. 作物學(xué)報, 2016, 42(10): 1471-1478.Liu R y, Liu F, Zhang Z q, Guan C y. Functional analysis ofpromoter and intron at expression level in., 2016, 42(10): 1471-1478. (in Chinese)

[21] Xiao G, Zhang Z Q, Yin C F, Liu R Y, Wu X M, Tan T L, Guan C Y. Characterization of the promoter and 5′UTR intron of oleic acid desaturase (FAD2) gene in., 2014, 545: 45-55.

[22] Liu F, Wang G L, Liu R Y,GUAN C Y. The promoter of fatty acid desaturase on chromosome C5 in, drives high-level expression in seeds., 2016, 10(6): 369-381.

[23] Kaplan-Levy R N, Brewer P B, Quon T, DAVID R S. The trihelix family of transcription factors--light, stress and development., 2012, 17(3): 163-171.

[24] Fan S d, Wang Y. Cloning and activity analysis of promoter of GRAS transcription factor gene HcSCL13 from., 2017, 33: 131-138.

[25] Ni M, Dehesh K, Tepperman J M, Quail P H. GT-2:transcriptional activation activity and definition of novel twin DNA binding domains with reciprocal target sequence selectivity., 1996, 8(6): 1041-1059.

[26] McCarty D R, Chory J. Conservation and innovation in plant signaling pathways., 2000, 103(2): 201-209.

[27] 丁劉軍, 普明宇, 衛(wèi)波, 王獻平, 范仁春, 張相岐. 轉(zhuǎn)錄因子基因參與烏拉爾圖小麥對條銹病的抗性. 遺傳, 2016, 38(12): 1090-1101.DING L J, Pu M y, Wei B, Wang X p, Fan R c, Zhang X q. Transcription factor geneis involved in the stripe rust resistance in., 2016, 38(12): 1090-1101. (in Chinese)

[28] Kaplanlevy R N, Brewer P B, Quon T. The trihelix family of transcription factors-light, stress and development., 2012, 17: 163-171.

[29] Gao M J, Li X, Lui H, Gordon M G,Derek D L, Shu W, Dwayne D H. ASIL1 is required for proper timing of seed filling in., 2011, 6(12): 1886-1888.

[30] Lowry J A, Atchley W R. Molecular evolution of the GATA family of transcription factors: Conservation within the DNA-binding domain., 2000, 50(2): 103-115.

[31] 劇建芳. 南極絲瓜蘚GATA轉(zhuǎn)錄因子PnGATA1的功能研究[D]. 濟南: 山東大學(xué), 2014.Ju J f. Functional study of GATA transcription factor PnGATA1 in[D]. Jinan: Shandong University, 2014. (in Chinese)

Regulation of GT and GATA Transcription Factors on Promoter Function ofandGenes in

Liu Fang1, Xiao Gang2, Guan Chunyun1

(1College of Agriculture, Hunan Agricultural University/National oilseed crops improvement center in Hunan, Changsha 410128;2Hunan Provincial Key Laboratory of Rice and Rapeseed Breeding for Disease Resistance, Changsha 410128)

【Objective】 Fatty acid desaturase 2 gene () is an important gene for controlling oleic acid content in rapeseed. And in this paper, the interaction between GATA family andandgene promoters or GT family transcription factors andandgene promoters was studied to make sure the transcription regulation mechanism to provide the theoretical basis for high oleic acid breeding. 【Method】 The potential cis-elements were predicted by deletion of promoter fragments and bioinformatics analysis, and candidate transcription factors were screened from PlantTFDB transcription factor database. Real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of transcription factors to further screen candidate transcription factors by comparison withandgene expression patterns. Transcription factors were co-transformed withandgenepromoters into yeast and verified interaction relationship between promoter and transcription factors by yeast one-hybrid. The transcription factors were transformed intowithandgenepromoter sequence, and the reporter gene GFP was detected by western blot to analyze the effects of transcription factors on promoters. 【Result】 After knocking out the GT or GATA cis-elements fromandgene promoters respectively, the GFP protein abundance decreased, which indicate that GT and GATA cis-elements play important roles in regulating gene transcription. Yeast one-hybrid results showed that the GATA family transcription factors (Bna010243-1, Bna026124-1, Bna026124-2) and the GT family transcription factors (Bna010915 and Bna013749) can interact withandgene promoters. Western blot analysis showed that when the GATA family transcription factor and the promoter fragment containing GATA elements were co-transformed into, the GFP protein content was significantly higher than that of no transcription factor. When the GATA element was knocked out, the GFP protein content did not change significantly. When the GT family transcription factor and the promoter fragment containing the GT element were co-transformed into, the GFP protein content changed significantly. When the GT element was knocked out, the GFP protein content did not change significantly.【Conclusion】 The GATA family transcription factors Bna010243-1, Bna026124-1, Bna026124-2 can interact with the GATA elements in theandgene promoters to enhance gene expression levels. The GT family transcription factor Bna010915 interacts with the GT elements in theandgene promoters to positively regulate gene expression; Bna013749 interacts with the GT elements in theandgene promoters to negatively regulate gene expression.

; GATA transcription factor; GT transcription factor;promoter;promoter

2018-07-13；

2018-09-25

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃“973”計劃（2015CB150200）

劉芳，E-mail：g5n2a5f@163.com。

官春云，E-mail：guancy2011@aliyun.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.002

（責(zé)任編輯 李莉）