小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY33的耐鹽性分析

張惠媛，劉永偉，楊軍峰，張雙喜，于太飛，陳雋，陳明，周永斌，馬有志，徐兆師，付金東

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小麥轉(zhuǎn)錄因子基因的耐鹽性分析

張惠媛1，劉永偉2，楊軍峰3，張雙喜4，于太飛1，陳雋1，陳明1，周永斌1，馬有志1，徐兆師1，付金東1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，石家莊 050051；3河北旺豐種業(yè)有限公司，河北邢臺 054900；4寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，寧夏永寧 750105）

【目的】WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族之一，參與調(diào)控植物病原菌的防御、生長發(fā)育和抗逆應(yīng)答等多種生理過程。小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和高溫的抗性。通過分析的耐鹽性，檢測TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，深入分析轉(zhuǎn)錄因子基因的功能，以解析其耐鹽調(diào)控機(jī)制?！痉椒ā恳喳}脅迫處理的小麥cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在鹽脅迫條件下的表達(dá)模式；將的CDs序列插入帶有CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1302表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA1302-，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，侵染野生型擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因株系；同時(shí)利用pWMB110-雙元載體創(chuàng)建了過表達(dá)小麥株系。用轉(zhuǎn)的擬南芥和小麥進(jìn)行耐鹽性鑒定。構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-，通過單轉(zhuǎn)法將誘餌載體pGBKT7-重組質(zhì)粒和文庫質(zhì)粒逐步轉(zhuǎn)化到酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞。通過SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal顯藍(lán)反應(yīng)篩選得到陽性克隆，進(jìn)行測序和BLAST分析。制備小麥原生質(zhì)體，通過瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)共轉(zhuǎn)化報(bào)告子和效應(yīng)子質(zhì)粒，計(jì)算相對熒光值分析轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性?！窘Y(jié)果】實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，受鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明TaWRKY33在小麥細(xì)胞中可以激活相應(yīng)熒光素酶的活性。從功能分析，在正常生長條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥沒有明顯差異；在鹽處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長大于野生型擬南芥的根長；過表達(dá)擬南芥的鮮重大于野生型，呈顯著性差異。重要的是，在鹽處理下，鮮重、相對電導(dǎo)率和Na+含量表明，過表達(dá)的小麥較其受體對照有更好的耐鹽性。對TaWRKY33候選互作蛋白分析表明，這些候選互作蛋白主要參與植物體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或免疫過程，表明在植物的逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用?！窘Y(jié)論】小麥?zhǔn)茺}脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，具有潛在的轉(zhuǎn)錄激活活性，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和小麥的耐鹽性；TaWRKY33可能需要其他蛋白共同作用提高小麥耐鹽性。

小麥；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；酵母雙雜；蛋白互作；耐鹽性

0 引言

【研究意義】作物在生命周期內(nèi)會(huì)不可避免的遭受干旱和高鹽等非生物逆境脅迫，影響作物正常的生長，由此造成減產(chǎn)，品質(zhì)降低，嚴(yán)重影響作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。植物在進(jìn)化過程中形成了一個(gè)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[1-2]，因此，研究植物對逆境信號的感知、傳遞以及適應(yīng)性響應(yīng)的分子機(jī)制，對于闡明植物適應(yīng)逆境機(jī)理，提高作物抗性具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）是信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)控過程的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)基序保守性將植物體眾多轉(zhuǎn)錄因子[3]分成包括WRKY在內(nèi)的若干個(gè)家族[1-2]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物中分布廣泛，通過信號網(wǎng)絡(luò)參與多個(gè)植物生命過程的調(diào)節(jié)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的N端含有WRKY結(jié)構(gòu)域，在少數(shù)WRKY蛋白中其被WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY代替[4]。WRKY家族可以被進(jìn)一步分為3個(gè)亞族GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ；依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)分析，高等植物WRKY家族GroupⅡ被精確地分為Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd+Ⅱe[5-6]。據(jù)報(bào)道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物的生物脅迫響應(yīng)[7]。近幾年，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過ABA介導(dǎo)對植物逆境的應(yīng)答，在受到非生物脅迫信號時(shí)，能夠調(diào)控下游抗逆相關(guān)功能基因的表達(dá)，增強(qiáng)植株的抗逆性[8-10]。過表達(dá)提高了水稻對鹽和干旱的抗性[11]。擬南芥調(diào)節(jié)滲透脅迫應(yīng)答和氣孔運(yùn)動(dòng)[12]。過表達(dá)和RNA干擾試驗(yàn)表明大豆通過抑制其下游抗逆負(fù)調(diào)因子的表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根對鹽和干旱的抗性[13]。因此，深入研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的作用機(jī)制對提高作物抗性有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。一般蛋白質(zhì)行使功能時(shí)，需要與其他蛋白質(zhì)或者其他分子相互作用才能完成。因而，在蛋白質(zhì)互作水平上研究蛋白質(zhì)作用機(jī)制對理解蛋白質(zhì)功能具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)OsMKK4-OsMPK3/OsMPK6調(diào)控了水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY53的激活活性，從而提高植物抗性[14]。目前，關(guān)于小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白之間互作的研究還很少。因此，在小麥中尋找與WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白，對于進(jìn)一步了解小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究除抗病之外還集中在發(fā)芽、衰老和響應(yīng)非生物脅迫幾方面。然而，大多數(shù)還是集中在模式植物，小麥耐鹽WRKY蛋白還鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】He等[15]從小麥中克隆獲得一個(gè)抗逆相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，在ABA和干旱應(yīng)答信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定在鹽脅迫下的表達(dá)表達(dá)模式，通過轉(zhuǎn)基因小麥和轉(zhuǎn)基因擬南芥研究其對鹽的響應(yīng)；利用酵母雙雜交技術(shù)以pGBKT7-作為誘餌篩選小麥cDNA文庫，得到可能與其互作的候選蛋白，為研究小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的耐鹽性提供線索。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長環(huán)境

小白麥（L.）獲贈(zèng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所景蕊蓮研究員。播種及生長條件參考文獻(xiàn)[15]，通過對溫室中2周齡的小麥植株進(jìn)行鹽（150 mmol·L-1NaCl）處理，并分別于0、0.5、1、2、6、12和24 h取樣，液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小麥原生質(zhì)體制備及雙熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)

提前配置纖維素酶解液，原生質(zhì)體制備參考Abel等[16]。選取1周齡小白麥幼嫩的葉片，切成0.5—1 mm，浸入纖維素酶解液中，黑暗條件下，真空泵抽30 min；然后黑暗條件下室溫50 r/min酶解約3 h；用W5（154 mmol·L-1NaC1、125 mmol·L-1CaC12、5 mmol·L-1KC1和5 mmol·L-1glucose，pH5.6）溶液潤濕的60—100目篩子過濾含有原生質(zhì)體的酶解液，1 030 r/min離心1 min，收集原生質(zhì)體；再用適量的預(yù)冷的W5溫和重懸，冰上靜置30 min后1 030 r/min離心1 min，用適量的MMG重懸原生質(zhì)體，使之終濃度為2×105個(gè)/ml。

雙熒光素酶系統(tǒng)質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所林浩研究員轉(zhuǎn)贈(zèng)。將報(bào)告因子質(zhì)粒和效應(yīng)因子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入110 μl的原生質(zhì)體，質(zhì)粒總量為15—20 μg，然后加入1.1×體積的PEG4000溶液，輕柔混合，室溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化30 min。最后用400 μl的W5溶液混合終止反應(yīng)，1 030 r/min離心1 min，取上清，加入1 ml W5溶液，離心1 min，取上清，加入200 μl W5溶液，23℃黑暗孵育16 h。遵照雙熒光素酶檢測試劑盒Dual- Luciferase? Reporter Assay System（Promega，E1910）分別檢測螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）和海腎熒光素酶（renilla luciferase）。瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 載體的構(gòu)建

將經(jīng)coRⅠ酶切的酵母雙雜誘餌載體pGBKT7（Clontech，美國）和進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，篩選正確的陽性克隆。

擬南芥過表達(dá)載體的構(gòu)建：將與經(jīng)Ⅰ酶切的pCAMBIA1302載體連接，形成pCAMBIA1302重組子，并轉(zhuǎn)染到GV3101根癌農(nóng)桿菌中。

小麥雙元表達(dá)載體的構(gòu)建：將插入到由泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pAHC25載體中，作為植物中的篩選標(biāo)記基因。將構(gòu)建好的pWMB110轉(zhuǎn)染到EHA105農(nóng)桿菌中。

1.4 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及自激活的驗(yàn)證

按照試劑盒說明書（MATCHMAK2 ER pLexA two-Hybrid User Manual，yeast Protocols Handbook）制備酵母感受態(tài)誘餌載體的自激活驗(yàn)證參考文獻(xiàn)[17]。

1.5 酵母雙雜系統(tǒng)篩選核庫及陽性克隆的分析

挑取SD/-Trp單缺平板的單克隆于800 μL的-Trp單缺液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，用PCR技術(shù)進(jìn)行菌液檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將帶有pGBKT7-重組質(zhì)粒的正確酵母菌液制備酵母感受態(tài)細(xì)胞見于太飛等[17]。核庫篩選過程見參考文獻(xiàn)[17]。

用1 ml YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性酵母單克隆，用于PCR檢測。將插入片段大小在1 000 bp左右的酵母單克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans10（TransGen，北京）感受態(tài)，菌液測序結(jié)果通過DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對后在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性分析。

1.6 熒光定量qRT-PCR分析

用試劑盒（TransGen Biotech，北京）提取不同時(shí)間鹽處理的小麥樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。設(shè)計(jì)引物（F：5′-GCGAGATGC TCAGGGAGGTG-3′，反向引物序列R：5′-ACGGCTGGTTGTTGTAGTGGC-3′）進(jìn)行表達(dá)模式分析，反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[15]。以小麥為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。按照2-ΔΔCT法分析目的基因的相對表達(dá)量及其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 相對電導(dǎo)率

分別取自然條件下生長和0.6%鹽處理?xiàng)l件下兩葉期野生型冬小麥和過表達(dá)冬小麥葉片0.1 g，浸入20 ml蒸餾水中，抽真空30 min后室溫靜置2 h，測得起始電導(dǎo)率值S1。然后將試管沸水煮30 min，待冷卻至室溫測得最終電導(dǎo)率值S2。相對電導(dǎo)率計(jì)算公式為REC = S1×100/S2。

2 結(jié)果

2.1 TaWRKY33結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸的保守域分析

前期研究中，從小麥中獲得一個(gè)干旱響應(yīng)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因[15]，通過進(jìn)一步解析的結(jié)構(gòu)及編碼氨基酸的特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子（圖1-A），內(nèi)含子含有典型的GT-AG序列。經(jīng)Ensembl Plants基因組數(shù)據(jù)庫BLAST分析，位于小麥6B染色體上。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族序列十分保守，通過在線BLAST分析TaWRKY33蛋白序列，得到CDD中與其WRKY基序（WRKY motif）相似度較高的不同物種的WRKY基因。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)小麥TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子與TaWRKY4、TaWRKY8相似度很高，與OsWRKY28和OsWRKY71均屬于GroupⅡ-a亞組，擬南芥gi15239913、水稻gi115477104、鷹爪豆gi18158619和高粱gi242040565處于同一進(jìn)化分支，為旁系同源基因，可能由同一祖先進(jìn)化而來；而與擬南芥gi297846008和另外2個(gè)基因雖保守域相同但相似性較低。

2.2 TaWRKY33啟動(dòng)子序列的分析

對干旱、ABA脅迫均有響應(yīng)[15]。為進(jìn)一步解析挖掘在逆境響應(yīng)方面的功能，首先分析了啟動(dòng)子的順式元件。通過對起始密碼子ATG上游1 281 bp序列的分析顯示，的啟動(dòng)子區(qū)含有多種與逆境應(yīng)答相關(guān)的元件，例如元件HSE（熱響應(yīng)元件）、ABRE（ABA應(yīng)答元件）、BOXI與Sp1（光應(yīng)答元件）、MBS（非生物脅迫誘導(dǎo)的MYB結(jié)合元件）和TC-rich repeats（與防御和逆境響應(yīng)相關(guān)的元件）等（圖2），說明啟動(dòng)子可能對干旱、ABA以外的脅迫有響應(yīng)。另外還包含與發(fā)育相關(guān)的順式元件（圖2）。

A：TaWRKY33的基因結(jié)構(gòu)；B：不同物種中WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)育分析。OS：水稻；Ta：小麥；Rr：鷹爪豆；Sb：高粱；As：燕麥；At：擬南芥；Hv：大麥

圖2 TaWRKY33啟動(dòng)子順式元件分析

2.2 TaWRKY33受鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)

為進(jìn)一步研究對鹽脅迫的響應(yīng)，用qRT-PCR分析NaCl處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在鹽脅迫處理下被緩慢誘導(dǎo)表達(dá)（圖3）。轉(zhuǎn)錄水平在150 mmol·L-1NaCl鹽處理后0.5 h時(shí)開始上升，在2 h時(shí)相對轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大值。此后表達(dá)量迅速下降，處理后12 h相對表達(dá)水平逐漸恢復(fù)到本底水平。

圖3 TaWRKY33在150 mmol·L-1 NaCl鹽處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析

2.3 TaWRKY33提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下根的伸長

為進(jìn)一步研究的耐鹽性，通過對過表達(dá)擬南芥植株進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥和野生型擬南芥在正常條件下生長狀態(tài)良好，表型無明顯差異，表明在正常生長條件下不會(huì)影響植物的生長和發(fā)育。

通過進(jìn)一步觀察并統(tǒng)計(jì)在NaCl處理?xiàng)l件下過表達(dá)擬南芥和野生型擬南芥根伸長情況，在正常培養(yǎng)條件下，與野生型擬南芥相比，過表達(dá)擬南芥根長無明顯差異（圖4）。在含有75 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，與野生型擬南芥相比，過表達(dá)擬南芥的根長較長，達(dá)到顯著水平；而在含100 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上，過表達(dá)擬南芥總根與野生型擬南芥的總根長均受到明顯的抑制，過表達(dá)擬南芥的根長比野生型擬南芥的根長略有優(yōu)勢，說明過表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率（圖4-E—圖4-F）和根的生長，但在幼苗期對植株的耐鹽性只在低鹽濃度下有明顯效果（圖4-A—圖4-D）。

A：轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照在正常條件下表型；B：轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照在75 mmol·L-1NaCl處理?xiàng)l件下表型；C：總根長檢測；D：鮮重測量；E：轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照在正常100 mmol·L-1NaCl條件下發(fā)芽率；F：發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)，誤差線表示3次獨(dú)立試驗(yàn)間的標(biāo)準(zhǔn)差，*表示<0.05，**表示<0.01。下同

A: The phenotype identification of transgenicand control under normal condition; B: The phenotype identification of transgenicand control under 75 mmol·L-1NaCl treatment; C: The detection of total root length; D: The detection offresh weight; E: The germination rate of transgenicand control under normal and 100 mmol·L-1NaCl treatment; F: The detection of germination rate, Error bars indicate SD among three independent replicates. Asterisk (*) denotes significant difference at<0.05. (**) indicated extremely significant difference<0.01 (Student’s test). The same as below

圖4 鹽脅迫條件下擬南芥的總根長和發(fā)芽率

Fig. 4 Total root length ofunder salt stress

2.4 WRKY33蛋白作為核轉(zhuǎn)錄激活因子

WRKY類轉(zhuǎn)錄因子分為3個(gè)亞組。TaWRKY33蛋白屬于第二亞組，含有一個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。小麥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)證明WRKY33定位在細(xì)胞核[15]。為進(jìn)一步探究其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性，利用瞬時(shí)雙熒光酶系統(tǒng)檢測TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子在小麥原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄活性。融合表達(dá)5×GAL4結(jié)合位點(diǎn)的Firefly luciferase（LUC）基因作為報(bào)告因子，由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的Renilla luciferase（REN）基因作為內(nèi)參。與此同時(shí)，TaWRKY33蛋白融合GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成效應(yīng)子。與對照相比，TaWRKY33明顯激活了相關(guān)熒光素酶的活性（圖5），說明TaWRKY33在植物細(xì)胞中具有潛在的轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.5 誘餌載體的構(gòu)建及自激活檢測

為解析的抗性機(jī)理，利用酵母雙雜篩選其可能的候選互作蛋白。將編碼序列構(gòu)建到pGBKT7誘餌載體，用PCR技術(shù)進(jìn)行菌液檢測，瓊脂糖電泳得到與目的片段大小相符的單一條帶約1 100 bp（圖6），經(jīng)測序和序列比對，提取正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-TaWRKY33。

為檢測的自激活活性，將pGBKT7- TaWRKY33重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，然后涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His的固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2—4 d（圖6），只在SD/-Trp培養(yǎng)基長出酵母菌落，而SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上沒有菌落長出，表明pGBKT7-TaWRKY33成功轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，且TaWRKY33無自激活活性。

A：小麥原生質(zhì)體雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)；B：雙熒光素酶系統(tǒng)Reporters和Effectors結(jié)構(gòu)圖

A：TaWRKY33的擴(kuò)增；B：TaWRKY33的自激活驗(yàn)證 A: Amplification of TaWRKY33; B: Auto-activity assays of TaWRKY33

2.6 TaWRKY33互作蛋白的篩選

WRKY轉(zhuǎn)錄因子多與其他轉(zhuǎn)錄因子、激酶相互作用，共同參與植物的抗逆過程。為了進(jìn)一步解析的抗性機(jī)理，利用酵母雙雜系統(tǒng)篩選其可能的候選蛋白。利用pGBKT7-誘餌載體篩選小麥cDNA文庫，將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體平板上，在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d左右，挑取直徑大于2 mm的單克隆，分別用YPDA培養(yǎng)基活化并點(diǎn)涂于SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade/X-α-gal平板上，篩選藍(lán)色陽性克?。▓D7-B）。

A：篩庫得到的克?。籅：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板上鑒定的陽性克隆

2.7 互作蛋白的序列比對分析

將酵母陽性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，結(jié)果顯示，篩出的互作基因的片段大部分集中在1 000 bp左右（圖8）。提取擴(kuò)增條帶大小在750 bp以上的單克隆酵母質(zhì)粒，進(jìn)而轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌并測序，經(jīng)BLAST比對（表1），發(fā)現(xiàn)篩選出的互作候選蛋白包括介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)交換的蛋白、植物抗逆應(yīng)答及蛋白修復(fù)功能相關(guān)蛋白和其他 一些編碼功能未知蛋白，這些基因可能參與植物能量代謝、脅迫響應(yīng)、防御、生長發(fā)育等一些生理過程。

2.8 轉(zhuǎn)TaWRKY33小麥的耐鹽性鑒定

通過對1周齡的T3轉(zhuǎn)小麥和對照科農(nóng)199（KN199）進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果顯示，在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因小麥的生長趨勢與對照相比沒有顯著差異（圖9-A），然而，在鹽處理?xiàng)l件下，對照組小麥的萎蔫程度要顯著高于轉(zhuǎn)基因小麥（圖9-B）。通過對T3轉(zhuǎn)基因小麥和對照KN199進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)小麥的2個(gè)株系中，的表達(dá)模式顯著高于對照KN199。表明能夠在轉(zhuǎn)基因小麥中穩(wěn)定表達(dá)（圖9-C）。此時(shí)，對鹽處理一周的小麥進(jìn)行鈉離子含量、鮮重以及相對電導(dǎo)率進(jìn)行測定，在正常生長條件下，上述指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因小麥與對照KN199之間無顯著差異，而在鹽處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因小麥擁有低的相對鈉離子含量/電導(dǎo)率以及相對高的鮮重（圖9-D—圖9-F）。

M：DL2000 Marker；1—8：酵母克隆

3 討論

3.1 WRKY與多種蛋白互作行使功能

WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與含有W-box順式元件以及MAPK、MAPKK、14-3-3蛋白、鈣調(diào)素、組蛋白去乙?；?、抗性蛋白和其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮功能，在調(diào)節(jié)植物許多生命過程的信號網(wǎng)絡(luò)中都很重要[17]。早期研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要在調(diào)節(jié)植物應(yīng)答病原體侵染和特定發(fā)育過程中發(fā)揮作用[17]。但是，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子同樣參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答[18-21]。目前，從干旱處理的小麥轉(zhuǎn)錄重測序中找到48個(gè)干旱響應(yīng)的WRKY基因[15]。早先研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子和增加了擬南芥的耐鹽性[22-24]；此外，近年研究表明小麥和通過提高下游相關(guān)基因的表達(dá)量提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽和干旱抗性[34]。在水稻中，的過表達(dá)提高了其對高溫和干旱的抗性[25]。

A：轉(zhuǎn)基因小麥和對照KN199在正常條件下的表型分析；B：轉(zhuǎn)基因小麥和對照KN199在鹽處理?xiàng)l件下的表型分析；C：TaWRKY33在轉(zhuǎn)基因小麥和對照KN199受體中的表達(dá)模式分析；D：鈉離子相對含量的測定；E：鮮重的測定；F：相對電導(dǎo)率的測定

3.2 候選蛋白的生物功能

為了進(jìn)一步解析的抗逆機(jī)制，本研究篩選了其可能的互作蛋白（表1），包括電控陰離子通道蛋白（VDAC）。VDAC是一類廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物線粒體外膜的蛋白。在水稻、煙草、百脈根、馬鈴薯、擬南芥和小麥中都有發(fā)現(xiàn)[29]。植物VDAC除了在生長發(fā)育發(fā)面發(fā)揮作用，在生物和非生物應(yīng)答方面也具有功能[29]。因此，TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能通過與VDAC互作，在植物抗逆調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。另外，有研究表明，乙醇酸氧化酶和ATP合成酶是植物光呼吸反應(yīng)中重要的2種酶。植物可以通過光呼吸反應(yīng)調(diào)節(jié)來增強(qiáng)植物對干旱的抵抗能力[27]。泛素結(jié)合酶E2能調(diào)控泛素化過程進(jìn)而調(diào)節(jié)下游不同靶蛋白。在小麥中已有報(bào)導(dǎo)E2連接酶（TaU4）是抗斑枯病的負(fù)調(diào)因子[30]。另外，當(dāng)植物受到干旱和高溫等非生物脅迫時(shí)，E2連接酶的表達(dá)可以增強(qiáng)植物的抗逆能力，能對一些損傷或錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行修復(fù)[30-33]。本研究利用酵母雙雜篩選出的候選蛋白多數(shù)參與了植物生長、發(fā)育，防御生物脅迫及抵抗非生物脅迫等生物過程。這些也說明了TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能通過與不同蛋白相互作用，在植物抗逆調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能。

表1 候選基因的BLAST分析結(jié)果及其推測的功能

3.3 遺傳學(xué)分析TaWRKY33的耐鹽性

越來越多研究表明，過表達(dá)逆境應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子對提高作物非生物脅迫抗性是一種可行性策略[26-27]。ABA在植物非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[15]，一系列轉(zhuǎn)錄因子和它們的靶基因都參與介導(dǎo)ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)許多分子細(xì)胞過程。是ABI1/2和下游的正向調(diào)節(jié)因子，作為植物ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組；受干燥、低溫、高鹽和外源性ABA誘導(dǎo)。然而，和在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平明顯提高[15]。發(fā)現(xiàn)可能在ABA和干旱抗逆應(yīng)答的信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用[15]。為進(jìn)一步研究是否參與了耐鹽響應(yīng)，分析了鹽脅迫下的表達(dá)模式，數(shù)據(jù)顯示鹽脅迫激活了的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而且在鹽處理下，的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系的總根長明顯高于野生型擬南芥（圖4）。據(jù)Mahajan等[28]報(bào)道，很多提高干旱抗性的轉(zhuǎn)錄因子對鹽脅迫也有正調(diào)作用。近期研究顯示，小麥?zhǔn)且粋€(gè)早期鹽誘導(dǎo)表達(dá)基因，同時(shí)具有抗旱特性。過表達(dá)的小麥，可能激活了下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，表現(xiàn)出一定的耐鹽性。因此，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因可能同時(shí)參與了植物對干旱和鹽脅迫的調(diào)控。這些結(jié)果為在抗逆研究中提供了新方向。

4 結(jié)論

小麥?zhǔn)茺}脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)期和苗期對低鹽的耐性。TaWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能通過與其他蛋白相互作用參與轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽調(diào)節(jié)過程。

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Identification and Analysis of Salt Tolerance of Wheat Transcription Factor TaWRKY33 protein

ZHANG HuiYuan1, LIU YongWei2, YANG JunFeng3, ZHANG ShuangXi4, YU TaiFei1,CHEN Jun1, CHEN Ming1, ZHOU YongBin1, MA YouZhi1, XU ZhaoShi1, Fu JinDong1

(1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;2Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050051;3Hebei Wangfeng Seed Industry Co., Ltd. Xingtai 054900, Hebei;4Institute of Crop Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yongning 750105, Ningxia)

【Objective】WRKY transcription factors are one of the largest families of transcriptional regulators in plants which functions in the regulation of various physiological programs, including pathogen defense, growth, development and abiotic stresses. Wheat transcription factorenhanced drought and heat tolerance in transgenic. To further investigate its function and stress response mechanism, this article studied its salt tolerance and screened wheat cDNA library to obtain its putative interacting proteins by yeast two-hybrid system. Meanwhile, dual luciferase system was used to detect transcriptional activity of TaWRKY33 transcription factors.【Method】was tested under salt stress using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) based on SYBR Green I technology. The coding sequence ofwas cloned into pBI121 driven by CaMV35S promoter. The construct was transformed mediated byintoplants (Col-0) to obtain transgenic lines. Meanwhile, pWMB110-binary vector was used to create over expressed wheat lines. Homozygous T3seeds oftransgenic lines and T2wheat overexpression lines were used for salt tolerance analysis. The wheat cDNA was used as the template for amplifying thecoding sequence, and the bait plasmid pGBKT7- TaWRKY33 was constructed. We transformed the recombinant plasmid and cDNA library into yeast cell AH109. We screened positive clones via SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade and SD/Raf/Gal/X-α-gal plate. Predicted clones were sequenced and analyzed by BLAST. The protoplasts of wheat were prepared, and the reporters and effector plasmids were transformed by transient expression experiments, and the relative fluorescence values were calculated to illustrate transcription activity of transcription factors. 【Result】 qRT-PCR analysis showed thatwas induced by salt. The transient expression experiment of double luciferase showed that TaWRKY33 could activate the luciferase activity in wheat cells. From the perspective of functional analysis, formed longer roots compared with wild type plants, the fresh weight of overexpressingwas significantly different from that of wild type. Importantly, from the perspective of fresh weight, relative electrical conductivity and Na+content in salt treatment showed that wheat with overexpression ofhad better salt tolerance than control. Through preliminary analysis, the candidate proteins screened by yeast two-hybrid system showed influence on signal transduction and immune process, which demonstrates thatplays an important role in stress signal transduction and gene transcription regulation in plants.【Conclusion】 Salt-inducibleimproved salt tolerance in transgenicand wheat and it has potential transcriptional activation activity in cells; TaWRKY33 might function via interacting with a diverse array of protein partners.

; WRKY transcription factor; yeast two-hybrid system; protein interaction; salt tolerance

2018-06-27；

2018-09-12

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2018ZX0800909B）、寧夏自然科學(xué)基金（NZ17126）、河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（494-0402- JBN-C7GQ）

張惠媛，E-mail：zhuiyuan31@126.com。劉永偉，E-mail：liuywmail@126.com。張惠媛和劉永偉為同等貢獻(xiàn)作者。

徐兆師，E-mail：xuzhaoshi@caas.cn。通信作者付金東，E-mail：fujindong@caas.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.001

（責(zé)任編輯 李莉）