氨氮脅迫與恢復(fù)對(duì)羅氏沼蝦幼蝦非特異性免疫的影響

董學(xué)興,呂林蘭,趙衛(wèi)紅,陸 妍，劉其根

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2. 鹽城工學(xué)院海洋技術(shù)系，江蘇省沿海池塘養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇鹽城 224051)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)又稱馬來西亞大蝦或泰國蝦，具有食性廣、生長快、營養(yǎng)豐富、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良養(yǎng)殖性能，是我國養(yǎng)殖的主要淡水蝦品種之一。近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)水平的提高，放養(yǎng)密度加大，從而導(dǎo)致單位水體中養(yǎng)殖動(dòng)物排泄物及殘餌等有機(jī)物積聚，分解生成大量氨氮，使得養(yǎng)殖環(huán)境持續(xù)惡化，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生存、生長、發(fā)育構(gòu)成威脅，造成疾病頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重制約著我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。水體中的氨包括離子氨和非離子氨，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有毒性的主要為非離子氨。離子氨和非離子氨可以相互轉(zhuǎn)化，其比例主要取決于水溫和pH。水中非離子氨含量隨溫度和pH升高而增加，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性隨之增大。當(dāng)對(duì)蝦暴露于氨氮時(shí)，其體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫(H2O2)等氧自由基(ROS)，而氧自由基超過機(jī)體抗氧化耐受能力時(shí)便會(huì)影響機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生氧化脅迫[1-2]。研究表明，非離子氨能直接損害蝦類鰓組織，并影響其滲透調(diào)節(jié)、蛻殼和免疫功能，從而抑制生長、降低存活率[3-4]。已有研究表明，羅氏沼蝦在高濃度氨氮作用下抗病力明顯降低，感染病原菌的幾率增加[5-6]。關(guān)于氨氮對(duì)蝦類抗氧化影響的研究，目前主要集中于探索氨氮持續(xù)脅迫條件下不同時(shí)間點(diǎn)蝦類抗氧化酶的變化規(guī)律[7-10]。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，夏季水體溫度、pH晝夜變化較大，池水非離子氨常處于動(dòng)態(tài)變化中。因此，本文研究了非離子氨對(duì)羅氏沼蝦幼蝦的急性毒性，以及氨氮脅迫48 h后恢復(fù)48 h對(duì)羅氏沼蝦幼蝦抗氧化酶的影響，以期為羅氏沼蝦健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)幼蝦購自江蘇省鹽城市射陽縣林盛蝦苗場(chǎng)，蝦體長(2.0±0.4) cm，體質(zhì)量(0.16±0.06) g。

1.2 氨氮急性毒性實(shí)驗(yàn)

幼蝦運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行氨氮脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出無效應(yīng)濃度和最大效應(yīng)濃度。用氯化銨(分析純)、曝氣48 h的自來水配制氨氮溶液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共設(shè)置5個(gè)急性毒性實(shí)驗(yàn)濃度梯度，其總氨濃度為0、22.17、32.04 、46.32、66.95 mg·L-1，對(duì)應(yīng)的非離子氨濃度分別為0、1.18、1.70、2.46、3.56 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)在玻璃缸中進(jìn)行，每缸盛3 L實(shí)驗(yàn)液，放10尾蝦，每24 h換實(shí)驗(yàn)液1/2。每個(gè)濃度設(shè)置3組平行，實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)充氣，不投喂餌料，水溫保持在(25±1)℃，pH 保持在8.0±0.5，準(zhǔn)確記錄24、48、72、96 h死亡數(shù)目。

1.3 氨氮亞急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)96 hLC50結(jié)果，設(shè)置5個(gè)亞急性毒性實(shí)驗(yàn)濃度梯度，總氨濃度為0、8、12、16、20 mg·L-1，對(duì)應(yīng)的非離子氨濃度分別為0、0.43、0.64、0.85、1.06 mg·L-1(其中濃度0為對(duì)照組)。亞急性毒性實(shí)驗(yàn)在玻璃缸中進(jìn)行，每缸盛3 L實(shí)驗(yàn)液，隨機(jī)挑選個(gè)體均勻的健康羅氏沼蝦幼蝦10尾，每個(gè)濃度設(shè)置3組平行。氨氮脅迫48 h(24 h 時(shí)換實(shí)驗(yàn)液1/2)后將實(shí)驗(yàn)液更換為清水(曝氣48 h的自來水)，恢復(fù)48 h。溫度、pH、充氣、投喂等實(shí)驗(yàn)條件同上。脅迫48 h、恢復(fù)48 h時(shí)分別取幼蝦肌肉組織，保存在-80℃下，用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)測(cè)定。

1.4 抗氧化酶活性及MDA測(cè)定

抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性和MDA含量測(cè)定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，具體操作步驟、計(jì)算和單位參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中非離子氨計(jì)算公式如下[11]：

非離子氨濃度 =總氨氮濃度/[10(pKa-pH)+1]

式中：pKa=0.090 18+2 729.92/T(T為開氏溫度，T=273+t℃)。

氨氮對(duì)羅氏沼蝦幼蝦半致死濃度(LC50)：采用SPSS 16.0 Probit分析法計(jì)算半數(shù)致死濃度和95%置信區(qū)間，并按照公式SC= 0.1 × 96 hLC50計(jì)算安全濃度。

酶活性差異性分析：采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，若差異顯著(P<0.05)則采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對(duì)羅氏沼蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)

氨氮對(duì)羅氏沼蝦幼蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組(非離子氨濃度0)羅氏沼蝦無死亡現(xiàn)象發(fā)生。同一時(shí)間點(diǎn)，羅氏沼蝦幼蝦死亡率隨氨氮濃度升高而升高。同一濃度下，幼蝦死亡率隨暴露時(shí)間延長而上升。氨氮對(duì)羅氏沼蝦幼蝦24、48、72、96 h的半致死濃度分別為4.25、2.35、1.86、1.54 mg·L-1，其安全濃度為0.154 mg·L-1(表2)。

表1 氨氮對(duì)羅氏沼蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of acute toxicity test of ammonia-N on M. rosenbergii

表2 氨氮對(duì)羅氏沼蝦的半致死濃度和安全濃度Tab.2 LC50 and SC of ammonia-N stress on M. rosenbergii

2.2 氨氮脅迫和恢復(fù)對(duì)羅氏沼蝦抗氧化酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表3)，氨氮脅迫顯著影響羅氏沼蝦SOD活性(P<0.05)，而對(duì)CAT和GSH-Px活性影響不顯著(P>0.05)。暴露48 h時(shí)，羅氏沼蝦幼蝦SOD活性隨氨氮濃度升高而升高，各氨氮濃度組活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。其中最高氨濃度(1.06 mg·L-1)組SOD活性是對(duì)照組的2.13倍，亦顯著高于其余各處理組(P<0.05)。

恢復(fù)48 h時(shí)，各組SOD、CAT活性差異顯著(P<0.05)，而各組GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。同一濃度下，各試驗(yàn)組SOD活性均較脅迫時(shí)顯著下降(P<0.05)，但除0.85 mg·L-1組外，其余試驗(yàn)組仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。CAT活性則與之相反，除0.85 mg·L-1組顯著低于對(duì)照組外(P<0.05)，其余試驗(yàn)組均與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。與脅迫48 h時(shí)相比，0.85、1.06 mg·L-1濃度組CAT活性及0.85 mg·L-1組GSH-Px活性下降顯著(P<0.05)。

2.3 氨氮脅迫和恢復(fù)對(duì)羅氏沼蝦MDA含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，氨氮對(duì)羅氏沼蝦MDA含量有顯著影響(P<0.05)。脅迫48 h，0.43、0.64、1.06 mg·L-1組MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。解除脅迫后恢復(fù)48 h，上述3個(gè)濃度組MDA含量均較脅迫時(shí)下降，各組MDA含量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 氨氮對(duì)羅氏沼蝦的急性毒性

王龍等[12]研究表明，正常溶氧條件下非離子氨對(duì)羅氏沼蝦幼蝦(全長3 cm左右)24 hLC50、48 hLC50、72 hLC50、96 hLC50分別為2.0、1.5、0.97、0.83 mg·L-1，安全濃度為0.083 mg·L-1；而在高溶氧條件下(11 mg·L-1)安全濃度為0.142 5 mg·L-1。另有研究表明，高溶氧可降低非離子氨的毒性[13-14]。本實(shí)驗(yàn)在持續(xù)充氣條件下進(jìn)行，氨氮對(duì)羅氏沼蝦安全濃度為0.154 mg·L-1，與上述高溶氧條件下求得的安全濃度接近，說明羅氏沼蝦幼蝦對(duì)氨氮具有一定的耐受力。此外，不同規(guī)格的蝦對(duì)氨的耐受力亦不同，一般而言，個(gè)體越大耐受力越強(qiáng)[15-16]。羅氏沼蝦與規(guī)格接近的克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)幼蝦(0.016 4～0.021 7 g，SC=0.19 mg·L-1)[17]和中國明對(duì)蝦(Penaeuschinensis)(體長3.61 cm，SC=0.16 mg·L-1)[18]對(duì)非離子氨的耐受力接近，而小于紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)幼蝦(體長為25～38 mm，SC=0.48 mg·L-1)[15]。本研究結(jié)果表明，羅氏沼蝦幼蝦對(duì)氨氮的耐受力為中等水平。

表3 氨氮對(duì)羅氏沼蝦T-SOD、CAT和GSH-Px活性的影響Tab.3 Effects of ammonia-N on T-SOD, CAT and GSH-Px activity of M. rosenbergii

注：相同小寫字母表示同一時(shí)間(同列)各組差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05);相同大寫字母表示同一濃度組脅迫48h與恢復(fù)48h之間差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05)

Notes: The same lowercase mean no significant difference at the same time (the same column), otherwise significant differences(P<0.05); the same capital letter mean no significant difference under the same concentration, otherwise significant differences(P<0.05)

表4 氨氮對(duì)羅氏沼蝦MDA含量的影響Tab.4 Effects of ammonia-N on MDA content of M. rosenbergii

注：上標(biāo)含相同字母表示在同一時(shí)間下，各組間差異不顯著，否則差異顯著(P<0.05)

Notes: The same letter mean no significant difference at the same time, otherwise significant differences(P<0.05)

3.2 氨氮脅迫和恢復(fù)對(duì)羅氏沼蝦抗氧化酶活性的影響

ZHANG等[19]研究表明，隨著氨氮濃度升高，羅氏沼蝦血細(xì)胞活性氧(ROS)含量上升。SOD和CAT是生物體內(nèi)兩種相互關(guān)聯(lián)的抗氧化酶，可聯(lián)合清除活性氧自由基，從而減輕其對(duì)機(jī)體的損傷。過多的ROS會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度加劇，因此，作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一的MDA，其含量多寡可間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧化損傷的程度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫48 h，羅氏沼蝦幼蝦SOD活性隨氨氮濃度增大而升高，最高濃度組SOD活性達(dá)對(duì)照組的2.13倍。除0.85 mg·L-1濃度組外，其余各試驗(yàn)組MDA含量也顯著升高。據(jù)此推測(cè)，氨氮脅迫可能致使羅氏沼蝦肌肉組織ROS增多，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞脂膜產(chǎn)生氧化損傷，機(jī)體通過增強(qiáng)SOD活性清除多余的ROS以降低脅迫損傷。任海等[21]發(fā)現(xiàn)17.64、34.87 mg·L-1氨氮組脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺SOD活性在6～48 h 均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但72 h時(shí)SOD 活性受到顯著抑制。包杰等[22]研究證實(shí)，氨氮脅迫中華小長臂蝦(Palaemonetessinensis)24 h對(duì)其肝胰腺SOD酶活性具有誘導(dǎo)作用，而48 h時(shí)則下降。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的5個(gè)氨氮濃度均在96 hLC50以下，脅迫48 h時(shí)各試驗(yàn)組羅氏沼蝦SOD活性均受到不同程度的誘導(dǎo)。由此可見，氨氮對(duì)甲殼動(dòng)物SOD活性的影響與動(dòng)物種類、氨氮濃度、脅迫時(shí)間等因素密切相關(guān)，當(dāng)脅迫壓力超過其耐受能力時(shí)，SOD活性受到抑制。

當(dāng)組織中活性氧含量異常升高，生物體通常首先通過SOD催化超氧自由基的歧化反應(yīng)生成H2O2，進(jìn)而再被GPx、CAT和過氧化物酶(Prx)等一系列抗氧化酶催化生成無害的H2O與O2[23]。本實(shí)驗(yàn)中，氨氮脅迫48 h對(duì)羅氏沼蝦CAT和GSH-Px影響不顯著(P>0.05)，與蔣琦辰等[24]發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫72 h對(duì)紅螯螯蝦SOD影響顯著(P<0.05)、而對(duì)CAT和GSH-Px影響不顯著的結(jié)果一致(P>0.05)。解除脅迫后恢復(fù)48 h，各組CAT、GSH-Px、SOD與脅迫時(shí)相比均呈下降趨勢(shì)，說明氨氮對(duì)CAT、GSH-Px也具有影響，但較SOD對(duì)氨氮脅迫的反應(yīng)可能更為滯后。曾媛媛等[25]在對(duì)擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的研究中也有相似的結(jié)果，即氨氮脅迫48 h時(shí)鰓SOD活性最高，而GPX活性則是在72 h時(shí)才達(dá)到最高。

迄今，關(guān)于氨氮脅迫后恢復(fù)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化酶活性影響的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究表明，氨氮脅迫48 h后恢復(fù)48 h，雖然除0.85 mg·L-1組外的其余試驗(yàn)組SOD活性仍高于對(duì)照組，但均較脅迫狀態(tài)顯著下降(P<0.05)，MDA含量亦降低到對(duì)照組水平。由此可見，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的氨氮濃度范圍內(nèi)，短期脅迫對(duì)羅氏沼蝦的氧化損傷在脅迫結(jié)束后可修復(fù)，但肌肉仍處于應(yīng)激狀態(tài)。另有研究發(fā)現(xiàn)，8、12、16 mg·L-1氨氮脅迫72 h后恢復(fù)7 d，紅螯光殼螯蝦(Cheraxquadricarinatus)總SOD活性顯著上升(P<0.05)，因此研究者認(rèn)為7 d恢復(fù)時(shí)間不足以讓紅螯光殼螯蝦從脅迫中完全恢復(fù)[24]，這與本研究羅氏沼蝦恢復(fù)48 h SOD活性仍高于對(duì)照的結(jié)果類似。張武肖等[26]研究證實(shí)，隨著氨氮脅迫時(shí)間延長，團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)鰓、肝和腎組織受到的損害增加，經(jīng)過96 h的恢復(fù)期仍未從脅迫中完全恢復(fù)，腎組織恢復(fù)能力最差。本實(shí)驗(yàn)以MDA和SOD為主要指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)氨氮短期(48 h)脅迫造成羅氏沼蝦肌肉氧化損傷，而經(jīng)過一定恢復(fù)期后其氧化損傷可修復(fù)。但是，氨氮脅迫是否會(huì)造成羅氏沼蝦組織損傷，以及其組織損傷是否可通過解除脅迫得以修復(fù)，還需要進(jìn)一步研究。