牙鲆甲狀腺素受體β互作蛋白的鑒定及其受甲狀腺素調(diào)控的分析

喻 杰，付元帥，施志儀

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

甲狀腺素(TH)是一類氨基酸衍生物，其在魚類早期發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。甲狀腺素是由甲狀腺素受體(TR)介導(dǎo)發(fā)揮作用的，研究證實(shí)，在TR介導(dǎo)TH基因轉(zhuǎn)錄的過程中，一系列的TR結(jié)合蛋白參與其中[1]。這些結(jié)合蛋白中，一些具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl transferases, HATs)或組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)活性，它們通過對(duì)組蛋白特定氨基酸的乙?；蛉ヒ阴；揎梺碇厮苋旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。如果組蛋白尾部的賴氨酸殘基被HAT乙?；?，則染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)變松散，聚合酶II更易進(jìn)入，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。如果組蛋白尾部賴氨酸殘基被HDAC去乙?；瑒t染色質(zhì)將變得緊湊，使得聚合酶II難以進(jìn)入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制[2]。另外，TR還可以通過蛋白和蛋白結(jié)合的形式直接發(fā)揮作用。如TR可以與細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的CREB區(qū)域結(jié)合，阻止其磷酸化；對(duì)小鼠甲狀腺腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TRβ還可以與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的p85α C末端的SH2區(qū)域結(jié)合[3]，令其磷酸化，使得介導(dǎo)的下游通路發(fā)生級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)。

免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)是以抗原和抗體之間的專一性免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性環(huán)境下天然相互作用的有效方法。通過抗體在細(xì)胞總蛋白裂解液中捕獲抗原及與抗原相互作用的蛋白，經(jīng)過適當(dāng)?shù)叵疵?，收集免疫?fù)合物，然后分離蛋白質(zhì)，加以質(zhì)譜鑒定，從而得到蛋白的氨基酸序列及種類信息[4]。牙鲆(Paralichthysolivaceus)是一種重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，其從仔魚到稚魚的發(fā)育經(jīng)過一個(gè)重要的變態(tài)發(fā)育過程，該過程受甲狀腺素的調(diào)控，而甲狀腺素是由TR介導(dǎo)發(fā)揮作用的。關(guān)于甲狀腺素在牙鲆變態(tài)過程中對(duì)相關(guān)功能基因影響的研究已有報(bào)道[5-7]。本研究以甲狀腺素受體β(TRβ)為研究對(duì)象，制作多克隆抗體，利用免疫沉淀法在牙鲆胚胎細(xì)胞中探索TRβ的相互作用蛋白，以期進(jìn)一步了解甲狀腺素受體介導(dǎo)甲狀腺素調(diào)控牙鲆變態(tài)過程，為牙鲆變態(tài)的分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 牙鲆胚胎細(xì)胞

本研究所用的牙鲆胚胎細(xì)胞(flounder embryonic cells，F(xiàn)EC)來自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳松林老師的饋贈(zèng)，在本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)室連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方法參照CHEN等[8]的研究。

1.2 牙鲆仔魚實(shí)驗(yàn)

牙鲆仔魚實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行，培育溫度為19～21°C。將孵化后第15天(15 dph)的仔魚隨機(jī)分成3組(每組3個(gè)缸，每缸2 000尾魚)，飼養(yǎng)直至41 dph。3組分別為：正常對(duì)照組(NC)：在天然海水中飼養(yǎng)；TH組：在含有0.1 mg·L-1TH(L-甲狀腺素，T4；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的海水中飼養(yǎng)；TU組：在含30 mg·L-1硫脲(上海生工)的海水中飼養(yǎng)[9]。在21 dph(變態(tài)早期)和28 dph(變態(tài)高峰期)時(shí)采集各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品，收集的牙鲆幼體用DEPC水洗滌并用MS-222(125 mg·L-1；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)進(jìn)行麻醉，然后在液氮中速凍并在-80 ℃下儲(chǔ)存直至使用。

1.3 牙鲆TRβ多克隆抗體制備

牙鲆TRβ多克隆抗體交由上海友科生物科技有限公司制備。制備流程為：表達(dá)載體構(gòu)建-蛋白表達(dá)純化回收-兔子免疫-抗體純化。

1.4 免疫沉淀

待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，第二次洗滌后吸干PBS，加入預(yù)冷的2 mL裂解液和20 μL PMSF混合液，吹打使其充分融合，在-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，每10 min一次；超聲破碎：功率200 W，5 s沖擊，9 s間隙，共60次；經(jīng)過超聲處理的樣品在4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，去除不溶物質(zhì)；立即將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)；取提取的蛋白1 mg，加入TRβ 多克隆抗體(5 μL)、適量PBS、甘油，IP結(jié)合體系為 1 mL，甘油終濃度為10 %。4 ℃搖床孵育過夜；次日，取60 μL protein A/G，加入10倍protein A/G體積的PBS進(jìn)行清洗，重復(fù)4次；清洗結(jié)束后加入10倍protein A/G體積的IP buffer平衡1次，將清洗平衡后的protein A/G按每個(gè)樣品60 μL加入到昨日的抗體蛋白復(fù)合物中，4 ℃結(jié)合2 h，結(jié)合完成后，用10倍體積的IP buffer清洗4次；加入適量體積的PBS及1×SDS loading buffer，沸水中煮10 min，用于后續(xù)分析。以兔IgG替代TRβ 多克隆抗體作為對(duì)照組(control)，同步進(jìn)行免疫沉淀。

1.5 Western Blot檢測(cè)IP復(fù)合物

取免疫沉淀得到的蛋白復(fù)合物10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，以TRβ 多克隆抗體為一抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，緊接著孵育二抗，超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯色拍照。

1.6 質(zhì)譜檢測(cè)IP復(fù)合物

取IP復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，切下含目的條帶和蛋白marker的膠塊，利用天根生物的試劑盒進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色脫色。脫色完成后，切下含目的蛋白的膠塊進(jìn)行膠內(nèi)酶解。樣品處理完成后，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析。

1.7 牙鲆仔魚總RNA提取和cDNA合成

將牙鲆仔魚混合樣品100 mg左右，加入1 mL Trizol，吹打并研磨，然后依照Trizol Reagent試劑盒方法提取總RNA，總RNA用NANODROP 2000測(cè)定OD 260/OD280值及濃度，再用1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA ( 1.0 μg) 完整性。確認(rèn)RNA質(zhì)量能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA用DNase I處理后，作為模板，按照Promega公司試劑盒說明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA直接用于PCR擴(kuò)增或-20 ℃保存。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從NCBI網(wǎng)站的GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中獲取相應(yīng)基因的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件(Premier，Canada)設(shè)計(jì)用于定量RT-PCR的引物(表1)。使用20 μL反應(yīng)體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL (10 μM)，10 μL THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO，Osaka，Japan)，8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；61 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s，采集熒光39次，然后進(jìn)行融解曲線的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3個(gè)，技術(shù)重復(fù)2次。實(shí)驗(yàn)前首先制備目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。18s在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中具有恒定的表達(dá)，故本研究選擇其為內(nèi)參基因。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示目的基因和內(nèi)參基因的R值均大于0.99，相應(yīng)的擴(kuò)增效率(E)均介于95 %～100 %之間，并且目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的M值相差小于0.1?；蛳鄬?duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCT方法計(jì)算[10]，其數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SE)表示，n=3。數(shù)據(jù)采用Sigamplot 10.0軟件中的One-Way方差分析 (ANOVA)，使用Dunnett’s T 多重比較法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。

表1 研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

注：F和R分別代表上游引物和下游引物；Q-RT-PCR：熒光定量PCR

Note: F and R denote forward and reverse primers, respectively; Q-RT-PCR: quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆TRβ多克隆抗體的制備和檢測(cè)

原核表達(dá)的TRβ蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)正確后純化回收進(jìn)行兔子免疫。4次免疫完成后采集檢測(cè)血清小樣，抗血清效價(jià)符合標(biāo)準(zhǔn)后采全血分離抗血清。利用抗原親和純化柱對(duì)抗血清進(jìn)行抗原親和純化，獲得特異性抗體。最終獲得抗原親和純化抗體3.6 mg，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)結(jié)果顯示抗體效價(jià)≥1∶80 000，符合標(biāo)準(zhǔn)。

將TRβ多克隆抗體以1∶1 000體積比稀釋后作為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG以1∶2 000體積比稀釋后作為二抗，分別對(duì)牙鲆胚胎細(xì)胞和牙鲆組織總蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖1，在牙鲆細(xì)胞和組織樣品中均檢測(cè)到了信號(hào)，TRβ蛋白大小為43 kDa，在圖1中顯示為40 kDa蛋白marker左右的條帶。該結(jié)果表明制備的牙鲆TRβ多克隆抗體在稀釋1000倍時(shí)仍能識(shí)別牙鲆細(xì)胞和組織中的TRβ蛋白，說明該TRβ多克隆抗體具有良好的特異性。

圖1 TRβ多克隆抗體用于牙鲆細(xì)胞和組織總蛋白的Western BlotFig. 1 Western Blot analysis of the TRβ polyclonal antibody against total proteins from FECs and P. olivaceus tissues 注：M：蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白WB；2：牙鲆組織總蛋白WB。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號(hào)Note: M: protein marker; 1: FECs total protein WB; 2: P. olivaceus tissues total protein WB. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

2.2 免疫沉淀

2.2.1 Western Blot檢測(cè)免疫沉淀復(fù)合物

本研究利用免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation，IP)，以牙鲆胚胎細(xì)胞為對(duì)象，探索與牙鲆TRβ相互作用的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)組，第一組：input為牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白直接上樣，上樣量24 μg；第二組：IP為TRβ抗體與牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物，共沉淀了978 μg蛋白，上樣量10 μL；第三組：對(duì)照組control為兔IgG與牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物，沉淀量1 mg，上樣量5 μL。以TRβ多克隆抗體檢測(cè)免疫沉淀復(fù)合物中是否存在TRβ蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞總蛋白和TRβ抗體與牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物中均檢測(cè)到大小在43 kDa左右的片段，與TRβ蛋白的大小相符，對(duì)照組則沒有檢測(cè)到TRβ蛋白信號(hào)，僅檢測(cè)到2個(gè)大小分別在25 kDa和55 kDa左右的片段，推測(cè)為用于免疫沉淀的抗體存留在免疫沉淀復(fù)合物中所顯示的信號(hào)，同樣在TRβ抗體與牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物中也檢測(cè)到這兩個(gè)條帶信號(hào)(圖2)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明免疫沉淀實(shí)驗(yàn)效果較好，沉淀復(fù)合物可用于后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)分析。

圖2 免疫沉淀復(fù)合物的Werstern Blot檢測(cè)Fig.2 Werstern Blot detection of immunoprecipitation complexes注：Input：細(xì)胞總蛋白上樣；IP：TRβ抗體免疫沉淀復(fù)合物；Control：兔IgG抗體免疫沉淀復(fù)合物。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號(hào)Note: Input: Cell total protein loading; IP: TRβ antibody immunoprecipitation complex; control: Rabbit IgG immunoprecipitation complex. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

2.2.2 質(zhì)譜檢測(cè)IP復(fù)合物

將牙鲆TRβ多克隆抗體與胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，割取含有目的蛋白的膠條(圖3)，回收蛋白，上機(jī)進(jìn)行LC-MS/MS 90 min質(zhì)譜鑒定。

圖3 免疫沉淀復(fù)合物的SDS-PAGE凝膠電泳考染圖Fig. 3 Immunoprecipitation complex SDS-PAGE gel electrophoresis注：M：蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；IP：TRβ抗體免疫沉淀復(fù)合物。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號(hào)Note: M: Protein marker; IP: TRβ antibody immunoprecipitation complex. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)經(jīng)搜索Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果顯示：本次質(zhì)譜鑒定的閾值得分是26分(圖4)，大于26分的蛋白為可信蛋白。本研究從牙鲆TRβ多克隆抗體與胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物中共鑒定得到了21個(gè)與TRβ蛋白可信度高的相互作用牙鲆蛋白(表2)。

圖4 肽段得分分布Fig. 4 Peptide score distribution注：離子得分以-log10(P)表示，其中P為隨機(jī)事件的概率。個(gè)體離子得分大于26表示具有同一性或廣泛同源性Note: Ions score is -log10 (P), where P is the probability that the observed match is a random event. Individual ions scores > 26 indicate identity or extensive homology

登錄號(hào)GeneBank ID蛋白質(zhì)名稱Protein name分子量MW蛋白質(zhì)豐度指數(shù)emPAIdbj|BAF37104.1|ATP synthase beta-subunit177507.08gb|AAO92751.1|heat shock protein 90 beta836571.08dbj|BAD05136.1|hsc71713420.96gb|ABG56396.1|chaperonin containing TCP1 subunit 6A, partial488500.58gb|AAF61072.1|AF220553_140S ribosomal protein S15A150474.08gb|ABB76381.1|heat shock protein 60 kDa612510.37gb|ABU42561.1|creatine kinase 1431440.16dbj|BAE48204.1|solute carrier family 25 alpha, member 5, partial239040.48dbj|BAO53973.1|elongation factor 1 alpha507370.37gb|AAT35603.1|receptor for activated protein kinase C354580.43gb|AAF61071.1|AF220552_1ribosomal protein L17216060.54gb|AAY25400.1|natural killer enhancing factor221560.76gb|ABQ41382.1|cell division cycle 48899490.11gb|AAF61070.1|AF220551_1ribosomal protein L31143391.35gb|ACB97649.1|60S ribosomal protein L30131151.53gb|AFQ38973.1|scinderin-like protein799980.08dbj|BAE48215.1|filamin A, partial226490.15gb|AAO45173.1|splicing factor arginine/serine-rich 3196440.17gb|AFI80898.1|histone H1-like protein212550.16dbj|BAP59753.1|CC chemokine, Paol-SCYA106125470.27dbj|BAD77968.1|type 1 collagen alpha 1137682

隨后筆者進(jìn)行了蛋白質(zhì)GO富集分析，從3個(gè)方面對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行了注釋：分子功能(GO-MF)，細(xì)胞組分(GO-CC)和生物過程(GO-BP)。GO-MF分析結(jié)果顯示，這些可信度較高的作用蛋白主要具有ATP結(jié)合、未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)組成、激酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、GTP酶活性、翻譯延長(zhǎng)因子活性、過氧化物氧還原酶活性、水解酶活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、RNA結(jié)合、DNA結(jié)合、趨化因子活性以及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分這些分子功能。其中參與蛋白數(shù)量最多的分子功能是ATP結(jié)合和核糖體的結(jié)構(gòu)組成。GO-CC細(xì)胞內(nèi)組分分析結(jié)果顯示，所鑒定的蛋白主要分布在核糖體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體內(nèi)膜、染色體以及胞外區(qū)域，其中絕大多數(shù)的蛋白集中在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。GO-BP分析結(jié)果顯示，筆者鑒定的這些IP復(fù)合物中的蛋白主要參與翻譯、蛋白質(zhì)折疊和重折疊、細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分裂、核小體裝配、雌激素應(yīng)答、壓力應(yīng)答以及免疫應(yīng)答的生物學(xué)進(jìn)程。

同時(shí)經(jīng)KEGG通路分析結(jié)果顯示，鑒定的蛋白參與核糖體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、剪接體、粘著斑、氧化磷酸化、內(nèi)吞作用、RNA降解、氨基酸物質(zhì)代謝、膽汁分泌、信使RNA監(jiān)測(cè)通路、細(xì)胞周期、沙門氏菌感染、單純皰疹感染以及細(xì)胞因子受體相互作用途徑中。

2.2.3 結(jié)合蛋白在牙鲆變態(tài)過程中的表達(dá)及其對(duì)外源激素刺激的反應(yīng)

鑒于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)之間非特異性相互作用以及瞬時(shí)相互作用的存在，加之本研究采用了LC-MS/MS上機(jī)90min質(zhì)譜鑒定的高靈敏度，這些都增加了與TRβ非特異性結(jié)合蛋白存在的幾率。所以筆者選擇了可信蛋白中質(zhì)譜比對(duì)結(jié)果得分以及相對(duì)蛋白質(zhì)豐度指數(shù)最高的7個(gè)蛋白作為研究對(duì)象，分別為：ATP合酶β亞基(beta-F1-ATPase)、熱休克蛋白90β(Hsp90β)、含有TCP1的伴侶蛋白亞基6A(Cct6A)、40S核糖體蛋白S15A(RPS15A)、肌酸激酶1(CK1)、溶質(zhì)載體家族25α成員5(Slc25a5)和延伸因子1(EF1a)。利用Primer Premier 5.0軟件(Premier，Canada)在CDS區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)定量引物(表1)，以18s rRNA為內(nèi)參基因，在Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System上對(duì)這7個(gè)基因在牙鲆變態(tài)早期(21dph)和高峰期(28dph)的對(duì)照組(NC)、TH組以及TU組的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)(圖5)。

圖5 IP可信蛋白mRNA在牙鲆21 dph和28 dph的表達(dá)及其對(duì)外源TH和TU處理的反應(yīng)Fig. 5 Expression of IP-identifiable protein mRNA in P. olivaceus 21dph and 28dph and their responses to exogenous TH and TU treatments注：圖a～g分別代表beta-F1-ATPase, Hsp90β, Cct6A, RPS15A, CK1, Slc25a5, EF1a的表達(dá)。每個(gè)mRNA的表達(dá)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)(N=3)的誤差棒顯示。帶有星號(hào)的值與正常對(duì)照(NC)的相應(yīng)值有顯著差異(P<0.05)Note: a～g represent the expression of beta-F1-ATPase, Hsp90β, Cct6A, RPS15A, CK1, Slc25a5, EF1a, respectively. The means ± standard error (SE) (N=3) of the expression of each mRNA is shown by error bar. Values with asterisk are significantly different (P<0.05) from the corresponding value for the normal control (NC)

對(duì)所選蛋白mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)分析結(jié)果顯示，除了RPS15A和CK1，其余蛋白的mRNA豐度在變態(tài)高峰期(28 dph)均低于變態(tài)早期(21 dph)，且beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、Slc25a5和EF1a對(duì)外源甲狀腺素及硫脲處理具有相似的反應(yīng)(圖5)，它們的表達(dá)在牙鲆變態(tài)早期和高峰期均受外源甲狀腺素的顯著下調(diào)(P<0.05)，而硫脲處理對(duì)它們的表達(dá)基本都沒有顯著性影響(P>0.05)，僅Slc25a5在高峰期受硫脲處理顯著下調(diào)(圖5-f，P<0.05)。而RPS15AmRNA的表達(dá)量在甲狀腺素和硫脲處理后均顯著下降，且在變態(tài)早期和高峰期均如此(圖5-d，P<0.05)。與其余基因截然不同；CK1在外源甲狀腺素處理后其mRNA豐度增長(zhǎng)了約5倍，在變態(tài)早期和高峰期均如此，差異極顯著(P<0.01)，而硫脲處理對(duì)CK1的表達(dá)沒有明顯影響(圖5-g)。

3 討論

免疫沉淀技術(shù)主要包括染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，Ch IP)、蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(protein immunoprecipitation，PIP)以及放射免疫沉淀技術(shù)(radioimmunoprecipitation，RIP)[11]。本研究中所提及的免疫沉淀(IP)為蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，是以抗體和抗原之間的專一性免疫反應(yīng)作用為基礎(chǔ)，主要用于抗原結(jié)合蛋白的定性檢測(cè)，是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)完整生理性作用的有效方法[12-14]。本研究為進(jìn)一步探索牙鲆TRβ的功能，以牙鲆胚胎細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用溫和裂解的方法，在細(xì)胞內(nèi)自然狀態(tài)下利用定制的牙鲆TRβ多克隆抗體(rabbit TRβ polyclonal antibody)去捕獲細(xì)胞內(nèi)的TRβ蛋白及與之相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物，再利用蛋白免疫印跡(Western Blot)和LC-MS/MS質(zhì)譜的方法確定相互作用蛋白，從TRβ多克隆抗體與牙鲆胚胎細(xì)胞總蛋白的免疫沉淀復(fù)合物中鑒定得到了21個(gè)達(dá)到本次質(zhì)譜鑒定閾值得分的可信牙鲆蛋白(表2)。

鑒于本研究免疫沉淀中可能存在的假陽(yáng)性結(jié)果，研究選擇了可信蛋白中質(zhì)譜比對(duì)結(jié)果得分以及相對(duì)蛋白質(zhì)豐度指數(shù)最高的7個(gè)蛋白作為進(jìn)一步研究對(duì)象，它們分別為：ATP合酶β亞基(beta-F1-ATPase)、熱休克蛋白90β(Hsp90β)、有TCP1的伴侶蛋白亞基6A(Cct6A)、40S核糖體蛋白S15A(RPS15A)、肌酸激酶1(CK1)、溶質(zhì)載體家族25α成員5(Slc25a5)和延伸因子1(EF1a)。

ATP合酶是位于核糖體內(nèi)膜上的含有多個(gè)亞單位的復(fù)合酶分子，在跨膜質(zhì)子梯度存在的條件下，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，參與氧化磷酸化和光合磷酸化途徑，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶。ATP合酶由F0和F1兩個(gè)亞單位組成，β亞基屬于F1亞單位，也是承載ATP合酶催化位點(diǎn)的主要亞基[15-16]。研究證明膜表達(dá)的ATP合成酶除了具有合成和水解ATP的活性，還承擔(dān)很多其它的生物學(xué)功能，例如可以影響內(nèi)皮細(xì)胞血管生成、調(diào)節(jié)血清膽固醇的水平、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)酸堿度等[17-18]，而β亞基不僅參與催化作用，還可位于生物膜表面參與各種生理功能[19]。Hsp90β、Hsc71和Hsp60均屬于熱休克蛋白家族同源基因，這是一類在進(jìn)化過程中高度保守的且在各種生物體中廣泛存在的蛋白。在功能上，它們作為分子伴侶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)正常生理和應(yīng)激情況下蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起著至關(guān)重要作用[20-21]。研究表明，在急性高溫和低溫脅迫下，鱖(Sinipercachuatsi)體內(nèi)多種組織中的多種熱休克蛋白表達(dá)量增加，且與脅迫作用時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)[22]，表明機(jī)體調(diào)用熱休克蛋白以積極的方式應(yīng)答并抵御不適溫度對(duì)自身產(chǎn)生的傷害。Cct6A是分子伴侶蛋白的一種，可在ATP水解釋放能量的條件下協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊組裝。其包含的TCP1亦屬于熱休克蛋白Hsp60家族，是一種在細(xì)胞胞漿中廣泛分布的異型寡聚蛋白，也是目前為止在真核細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)伴侶素蛋白[23-24]。RPS15A是核糖體的結(jié)構(gòu)成分，是蛋白質(zhì)翻譯不可或缺的。研究發(fā)現(xiàn)在星形細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌以及前列腺癌中RPS15A的表達(dá)均升高，李光耀等[25]利用RNAi技術(shù)觀察并分析RPS15A基因?qū)Π籽〖?xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的RPS15A基因進(jìn)行敲降可阻滯其細(xì)胞周期，增加細(xì)胞凋亡，從而影響白細(xì)胞的增殖。CK1(Creatine kinase 1，肌酸激酶1)是組織中調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵酶，與細(xì)胞的能量反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、神經(jīng)功能、有氧耐力、肌肉收縮有關(guān)，主要存在于高能耗組織如骨骼肌、腦、心臟等組織的細(xì)胞中[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和甲狀腺機(jī)能衰退會(huì)導(dǎo)致總肌酸激酶活力的變化，證明甲狀腺素可調(diào)節(jié)肌酸激酶及其同工酶的總活性[29-30]。Slc25a5是溶質(zhì)載體蛋白基因SLC大家族中SLC25小家族的一員，是位于線粒體膜上的一類運(yùn)輸分子。線粒體膜由作為各種分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)組成，Slc25a5就是其中一員[31]。SLC25A5(溶質(zhì)載體家族25，成員5)也被稱為ANT2，在增殖細(xì)胞中高度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中的ANT2誘導(dǎo)與糖酵解代謝和癌發(fā)生直接相關(guān)，另外ANT2基因的抑制可導(dǎo)致人細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯[32]。延伸因子1-α(EF1a)是真核生物翻譯延伸因子(eEF1)的一個(gè)亞基，該蛋白在蛋白質(zhì)生物合成期間促進(jìn)氨?；?tRNA與核糖體A位點(diǎn)的GTP依賴性結(jié)合，幫助肽鏈的延伸[33]。研究表明，在壓力條件下，細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)EF1和EF2等延伸因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)總蛋白的合成[34]。另外EF1a除了參與蛋白質(zhì)的翻譯過程外，還具有許多其它的重要功能，如可以充當(dāng)分子伴侶保護(hù)相關(guān)蛋白免受環(huán)境壓力的損害，協(xié)助蛋白的修復(fù)，參與溶酶體對(duì)N端封閉蛋白的降解等[34]。GOULART-SILVA等[35]對(duì)INS-1E細(xì)胞(胰腺β細(xì)胞)施以甲狀腺素T3處理后，翻譯因子EF1A和胰島素的表達(dá)同時(shí)增長(zhǎng)。

進(jìn)一步對(duì)編碼它們的基因mRNA表達(dá)分析結(jié)果顯示，它們的表達(dá)在外源甲狀腺素處理后均表現(xiàn)出顯著變化，其中beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、RPS15A、Slc25a5和EF1a的表達(dá)受外源甲狀腺素處理顯著下調(diào)，CK1截然相反，它的表達(dá)受甲狀腺素處理顯著上調(diào)；硫脲的處理對(duì)所分析的基因則幾乎都沒有明顯影響(圖5)。這些結(jié)果間接支持了所分析的可信蛋白與甲狀腺素受體β之間的相互聯(lián)系。本文對(duì)牙鲆甲狀腺素受體β結(jié)合蛋白的研究還停留在描述性階段，它們與TRβ的準(zhǔn)確關(guān)系和具體功能仍然需要進(jìn)行下一步的更深研究。盡管如此，本文的研究結(jié)果將有助于牙鲆甲狀腺素受體結(jié)合蛋白與牙鲆變態(tài)關(guān)系的研究。