N5，N10—亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病合并2型糖尿病的相關(guān)性研究

何偉喜 劉鵑鋒 劉志輝 王平

[摘要]目的 探討N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病合并2型糖尿病的相關(guān)性。方法 選取2017年1月～2018年9月我院收治的90例冠狀動脈造影患者作為研究對象，其中正常者30例作為對照組，冠心病患者33例作為A組，冠心病合并2型糖尿病患者27例作為B組，均行N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與生化指標(biāo)（總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）檢測。結(jié)果 A組患者總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇高于對照組（P<0.05）；A組患者高密度脂蛋白膽固醇低于對照組（P<0.05）；B組患者總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白膽固醇高于A組和對照組（P<0.05）；B組患者高密度脂蛋白膽固醇低于A組和對照組（P<0.05）；對照組患者基因型為CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A組患者基因型為CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B組患者基因型為CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%），三組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對照組患者C等位基因頻次>A組患者C等位基因頻次>B組患者C等位基因頻次（P<0.05）。結(jié)論 N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病合并2型糖尿病的關(guān)系密切。TT基因型越多，冠心病合并2型糖尿病的患病風(fēng)險越高。

[關(guān)鍵詞]N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；冠心?。?型糖尿??；相關(guān)性

[中圖分類號] R735.7 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（a）-0041-03

Analysia of the correlation between the polymorphism of N5，N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene and coronary heart disease complicated with type 2 diabetes mellitus

HE Wei-xi LIU Juan-feng LIU Zhi-hui WANG Ping

Department of Cardiology， the First People′s Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the polymorphism of N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene and coronary heart disease （CHD） complicated with type 2 diabetes mellitus （DM）. Methods A total of 90 patients performed with coronary angiography treated in our hospital from January 2017 to September in 2018 were selected as the subjects. Among them， 30 patients were selected as normal control group. The 33 patients with CHD alone were classified into group A， and the rest 27 patients with CHD and type 2 DM were categorized into group B. They were all tested with N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and biochemical markers such as total cholesterol （TC）， triacylglycerol， fasting blood glucose （FBG）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）. Results The levels of TC， triacylglycerol， and LDL-C in group A were higher than those in the control group （P<0.05）. The HDL-C level in the group A was lower than that in the control group （P<0.05）. The TC， triglyceride， FBG and LDL-C in the group B were higher than those in the group A and control group （P<0.05）. The HDL-C level in the group B was lower than that in the group A and the control group （P<0.05）. The genotypes of patients in the control group were CC （95.0%）， CT （5.0%） and TT （0.0%）. In the group A， the genotypes were CC （68.8%）， CT （25.0%） and TT （6.2%）. In the group B， the patients′ genotypes were CC （27.8%）， CT （38.9%）， TT （33.3%）. After inter-group comparisons， there were statistical significance （P<0.05）. The sequence of frequency of C alleles was listed as control group， group A， and group B from high to low （P<0.05）. Conclusion The N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism is closely associated with CHD complicated with type 2 DM.The more TT genotypes are，the higher the risk of CHD with type 2 DM becomes.

[Key words] N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase； Gene polymorphism； Coronary heart disease； Type 2 diabetes mellitus； Correlation

冠心病是臨床常見病，高發(fā)于老年人[1-2]，可直接危及患者的生命安全。合并2型糖尿病會明顯增加患者的臨床治療難度，分析其機制，可能與機體代謝紊亂、血流動力學(xué)指標(biāo)改變等諸多個體因素有關(guān)[3-4]。N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶發(fā)生基因錯位突變后，可引起酶缺乏或生物活性降低，可引發(fā)高同型半胱氨酸血癥，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化，增加冠心病風(fēng)險。因而，分析N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病合并2型糖尿病的相關(guān)性，具有重要的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月～2018年9月我院收治的90例冠狀動脈造影患者作為研究對象。其中正常者30例作為對照組，男14例，女16例；年齡46～75歲，平均（58.5±5.2）歲；冠心病患者33例作為A組，男21例，女12例；年齡45～76歲，平均（62.±4.8）歲；冠心病合并2型糖尿病患者27例作為B組，男19例，女8例；年齡48～73歲，平均（61.7±4.6）歲。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)冠狀動脈造影證實在左主干、左前降支、回旋支或右冠狀動脈中至少有1支血管狹窄程度>50%；符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，空腹血糖>7.8 mmol/L，餐后2 h血糖>11.1 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有繼發(fā)性高血壓、自身免疫性疾病、心力衰竭、嚴(yán)重肝腎功能不全、非漢族及其他惡性疾病的患者。

1.2方法

1.2.1樣本收集 采集被檢人員空腹9～12 h肘靜脈血10 ml。一管EDTA抗凝，混勻后，在-80℃下保存，用于提取基因組DNA，另一管肝素抗凝，用于生化指標(biāo)檢測。

1.2.2生化指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測，指標(biāo)包括總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。嚴(yán)格按照說明書進行操作。

1.2.3 N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性檢測 MTHFR C677T基因分型檢測工作由上海聯(lián)吉醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司承擔(dān)，檢測方法為核酸芯片雜交法。①DNA提取。使用亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T檢測試劑盒（PCR-RFLP）提取DNA，嚴(yán)格按照說明書進行操作，將提取后的DNA保存于-20℃冰箱中，試劑盒均購自于深圳奧薩制藥有限公司。②PCR擴增和檢測。引物設(shè)計可使用Primer 3 Input網(wǎng)絡(luò)軟件，由上海生工生物合成，上游引物為5′-ATGACCTGCTGCCGTCAGCG-3′，下游引物為5′-CCGCAACTATGGCATCGAGC-3′。反應(yīng)體系為25 μl，包括模板DNA3 μl，PCR擴增混合液21.8 μl和Taq DNA聚合酶0.2 μl。應(yīng)用PCR基因擴增儀進行擴增。94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)。循環(huán)完畢后，72℃再延伸7 min，酶切后電泳。對PCR擴增產(chǎn)物理想的樣品進行酶切分析。反應(yīng)體系為15 μl，包括PCR產(chǎn)物10 μl，Hinf I內(nèi)切酶（深圳奧薩制藥有限公司）0.3 μl，酶切緩沖液4.7 μl，在37℃下溫育1 h，酶切反應(yīng)終止后，其產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，室溫恒壓1～5 V/cm，電泳10 min，最后在凝膠成像儀下觀察并照相，進行基因分型。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Z檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組患者生化指標(biāo)的比較

A組患者總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇高于對照組（P<0.05）；A組患者高密度脂蛋白膽固醇低于對照組（P<0.05）。B組患者總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白膽固醇高于A組和對照組（P<0.05）；B組患者高密度脂蛋白膽固醇低于A組和對照組（P<0.05）（表1）。

2.2三組患者基因型和等位基因頻次的比較

對照組患者基因型為CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A組患者基因型為CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B組患者基因型為CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%）。三組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

對照組患者C等位基因頻次>A組患者C等位基因頻次>B組患者C等位基因頻次（P<0.05）（表2）。

3討論

近年來，隨著醫(yī)療科技水平的不斷提升，基因檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床，篩查基因突變也作為了發(fā)病因素進行相關(guān)疾病的診療，取得了顯著效果[7-8]。諸多研究顯示，高同型半胱氨酸血癥是冠心病的獨立危險因子[9-11]，因而，檢測同型半胱氨酸水平，有助于診療冠心病，并改善患者的預(yù)后。N5， N10-亞甲基四氫葉酸還原酶是影響同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶之一，MTHFR基因C667T突變有可能下調(diào)酶的熱穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高，可能是冠心病的易感基因[12-13]。

在糖尿病患者中，N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性發(fā)生改變，主要為MTHFR基因C667T突變，即胸腺嘧啶T取代了胞嘧啶C，使得氨基酸發(fā)生錯譯，降低了MTHFR的生物活性，并增加了熱敏感性，減少了5-甲基四氫葉酸的生成，阻礙了重新甲基化的進程，會造成同型半胱氨酸水平升高，更易引起血脂水平改變[14-15]，而C等位基因?qū)ρ斜Ｗo作用，T等位基因具有危害作用，即隨著T等位基因的增加，患者的患病風(fēng)險將升高。

本研究結(jié)果顯示，A組患者總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇高于對照組；A組患者高密度脂蛋白膽固醇低于對照組；B組患者總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白膽固醇高于A組和對照組；B組患者高密度脂蛋白膽固醇低于A組和對照組。提示冠心病合并2型糖尿病存在明顯的血糖、血脂水平改變。

對照組患者基因型為CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A組患者基因型為CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B組患者基因型為CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%），三組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對照組患者C等位基因頻次>A組患者C等位基因頻次>B組患者C等位基因頻次。提示N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病合并2型糖尿病的關(guān)系密切，TT基因型越多，冠心病合并2型糖尿病的患病風(fēng)險越高。

綜上所述，開展MTHFR基因C667T多態(tài)性檢測，可以了解冠心病合并2型糖尿病患者的病情嚴(yán)重程度，從而降低主要心血管不良事件的發(fā)生風(fēng)險，有助于改善患者的臨床預(yù)后，提高其日后的生存質(zhì)量和生存期，同時MTHFR基因C667T多態(tài)性檢測還可降低醫(yī)療費用，提高醫(yī)院設(shè)備的運轉(zhuǎn)率，使得醫(yī)患雙方互利，能取得更好的社會效益，也為臨床精準(zhǔn)治療提供了更多的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-10-11 本文編輯：閆 佩）