14株芽胞桿菌菌株的分子鑒定及其促生機理分析

陳崢　劉波　鄧文瓊　朱育菁　鄭梅霞　李慧敏　劉欣　王階平

摘 ?要：以前期篩選的14株植物促生細菌為實驗材料，運用16S rRNA基因序列同源性對菌株進行分子鑒定，通過生物測定評價菌株對番茄的促生效果，并對其促生機理進行初步分析。實驗結(jié)果表明，促生菌株來自芽胞桿菌科的2個屬、9個種。對番茄種子促生特性研究表明，14株芽胞桿菌均能提高種子發(fā)芽率，增長率為0.74%～11.85%;其中12株芽胞桿菌能促進胚根生長，增長率為4.03%～65.33%;而8株芽胞桿菌促進胚芽生長，增長率為1.24%～18.17%。對不同芽胞桿菌的促生因子相關分析結(jié)果表明，芽胞桿菌的6個促生因子（解無機磷、解有機磷、固氮效能、吲哚-3-乙酸含量、植酸酶活性、吡咯喹啉醌濃度）之間無相關關系（P>0.05），與活菌數(shù)無相關關系（P>0.05），與種子發(fā)芽率、胚根長、胚芽長也無顯著相關關系（P>0.05）。種子發(fā)芽率與胚根長、胚芽長無相關關系（P>0.05），而胚根和胚芽長之間具有顯著性相關（P<0.01）。室內(nèi)番茄盆栽實驗表明，試驗的6株芽胞桿菌對番茄幼苗均有促生作用，不同芽胞桿菌對番茄促生特性存在差異，如圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648能顯著增加根長，提升地上部與地下部干重，而暹羅芽胞桿菌FJAT-47226的促生效果則主要表現(xiàn)在增加株高和地上部生物量上。

關鍵詞：芽胞桿菌;促生菌;分子鑒定;促生機理;促生因子

中圖分類號：S476.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Molecular Identification and Growth Promoting Mechanisms of 14 Bacillus Strains

CHEN Zheng， LIU Bo*， DENG Wenqiong， ZHU Yujing， ZHENG Meixia， LI Huimin， LIU Xin， WANG Jiepin

Agricultural Bio-Resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract： Using 14 strains of plant growth promoting bacteria screened in the laboratory as the experimental materials， and the 16S rRNA gene sequence homology was used for molecular identification. The bioassay was used to evaluate its promoting effect on tomato growth， and its promoting mechanism was analyzed. The 14 strains were from 2 genera and 9 species of Bacillus. The inorganic phosphorus， organophosphorus， nitrogen fixation efficiency， IAA content， PQQ concentration and phytase activity of different Bacillus strains were different. The study on seed growth promoting characteristics showed that all the 14 strains could improve the germination rate of seeds with an increase rate of 0.74% to 11.85%. 12 strains could promote the growth of radicle with an increase rate of 4.03%-65.33%. Eight strains could promote the growth of germ， increased from 1.24% to 18.17%. The correlation analysis of growth promoting factors of different Bacillus strains showed that there was no correlation between the growth promoting factors （P>0.05）， and the number of viable bacteria （P>0.05）， and there was no significant correlation between them and seed germination rate， radicle length and germ length （P>0.05）， but there was a significant correlation between radicle length and plumule length （P<0.01）. The effect of 6 Bacillus strains on rhizosphere growth promotion was further verified by the pot experiment in the laboratory. The results showed that Bacillus had an effect on the growth promotion of tomato seedlings. For example， Bacillus toyonensis FJAT-47648 could significantly increase the root length of the plant， and also increase the aboveground and underground biomass while Bacillus siamensis FJAT-47226 could significantly increase the plant height and aboveground biomass.

Keywords： Bacillus; growth-promoting bacteria; molecular identification; growth promoting mechanisms; growth promoting factors

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.026

植物促生細菌通常定殖于植物根際系統(tǒng)或植物內(nèi)部[1]，對植物的生長起促進作用。植物促生細菌能有效分解植物根際土壤中難溶或被固定的元素，促進植物對元素的吸收，能直接或間接促進植物的生長、增產(chǎn)以及抗病等[2-4]。目前，植物促生細菌的類群包括芽胞桿菌[5]、假單胞菌[6]、農(nóng)桿菌[7]、運動節(jié)桿菌[8]和沙雷氏菌[9-10]等。

植物促生細菌的促生機制復雜多樣，且多數(shù)是多種機制共同作用[11]。目前報道的促生菌的促生機理主要包括以下3個方面：（1）通過固氮、解磷和解鉀作用，有效分解土壤中難溶和被固定的元素，使營養(yǎng)元素有效化，促進植物生長;（2）合成促進植物生長發(fā)育物質(zhì)，如吲哚-3-乙酸（IAA）、吡咯喹啉醌（PQQ）和植酸酶（phytases）等。大多數(shù)植物促生菌能合成IAA[12]，參與植物細胞的伸長生長、形成層細胞的分裂、維管組織的分化過程的調(diào)節(jié)與控制[13];而PQQ不僅能提高植物抗低溫脅迫能力[14]，微生物還能利用GDH-PQQ全酶作用溶解土壤無機或有機磷酸鹽，從而達到促進植物生長[15];而植酸酶能分解植酸，釋放磷元素，促進植物磷的吸收[16];（3）促生菌能誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）和系統(tǒng)耐受力（IST），使植物抵抗真菌、細菌和病毒等生物類侵害，耐受重金屬，干旱，鹽分等非生物脅迫[17]，提高植物整體免疫抗病力，促進植物生長。

芽胞桿菌作為植物促生菌的重要類群，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要的應用價值。芽胞桿菌促生菌的重要特點是促生菌種資源多樣化[5， 18-25]和促生作物品種多樣化[22， 25-30]。然而，各芽胞桿菌均含有不同的促生因子（解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、PQQ濃度和植酸酶活性等），促生因子間的相互關系的研究報道還較少。國內(nèi)關于植物促生菌的促生因子和促生作用有較多研究，主要集中于菌株篩選、功能測定、代謝物提取與鑒定等方面，尚缺乏完整而充分的篩選條件。前人研究的促生菌的促生因子，單一因子研究較多，而系統(tǒng)研究較少，特別是各促生因子之間的相互關系及其對植物的促生作用的相關性方面。本研究以實驗前期高通量篩選得到的14株芽胞桿菌為材料，進行16s rRNA分子鑒定，檢測植物促生作用的相關因子，對其促生能力進行評估，并研究促生因子的相關性，對其促生機理進行初步分析，為后續(xù)促生菌的應用研究提供理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?供試菌株14株，置于-80 ℃甘油冷凍保存，由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。

1.1.2 ?供試培養(yǎng)基 ?LB固體培養(yǎng)基;LB液體培養(yǎng)基;NBRIP培養(yǎng)基;Ashby培養(yǎng)基;有機磷細菌溶磷能力測定培養(yǎng)基;植酸酶篩選培養(yǎng)基。

1.1.3 ?供試試劑 ?細菌基因組提取試劑盒（Gene-rary bitehch），引物為27F和1492R，由上海博尚生物技術有限公司合成，Taq酶購自上海博尚生物技術有限公司。鉬銻抗貯存溶液、Salkowski比色液、硫酸蒽酮溶液、吡咯喹啉醌、植酸鈣、植酸鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈣、三氯乙酸、鉬銻抗顯色劑、硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色劑等購自福州卡文生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 ?生測材料 ?栽培基質(zhì)采用蔬菜設施專用栽培基質(zhì)（N+P2O5+K2O≥3%，有機質(zhì)≥45%）購自廈門市江平生物基質(zhì)技術股份有限公司;生測用番茄品種為‘農(nóng)科180，購自福建農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開發(fā)有限公司;營養(yǎng)液采用霍格蘭液。

1.2 ?方法

1.2.1 ?促生芽胞桿菌的分子鑒定 ?采用LB液體培養(yǎng)基于170 r/min，30 ℃搖床中培養(yǎng)48 h，獲得培養(yǎng)液，并離心收集菌體。采用Tris-飽和酚法提取菌株基因組DNA，采用16S rRNA基因通用引物27F： 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3和1492R： 5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，進行PCR擴增，PCR反應程序參照鄭雪芳等[31]的方法，PCR產(chǎn)物送至上海博尚生物技術有限公司測序，應用EZBioCloud完成序列同源性比對，通過MEGA 6.0.6軟件分析序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 ?菌株促生生功能分析 ?（1）菌株高溫脅迫生長性能測定。挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，170 r/min 30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，用滅菌超純水稀釋至OD600=0.8左右。吸取200 ?L種子液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基為對照，分別于30 ℃和60 ℃下170 r/min培養(yǎng)48 h，每株菌3個重復，于酶標儀檢測OD600值。

（2）解磷能力測定。有效磷含量檢測采用鉬銻抗法，參照張祥勝[32]的方法，測定波長700 nm的吸光度，繪制標準曲線，從標準曲線上查得相應的含磷量。

（3）固氮能力測定。固氮效能測定方法參照NY 411—2000《固氮菌肥料》[33]。定糖采用恩酮光電比色法，測氮采用半微量光電比色法。

（4）菌株產(chǎn)IAA能力測定。采用Salkowski比色法，參照高曉星等[34]的方法，根據(jù)標準曲線測定細菌分離IAA的量。

（5）菌株產(chǎn)PQQ濃度測定。采用光譜分析法，參照徐文等[35]的方法，根據(jù)標準曲線計算樣品中PQQ含量。

（6）菌株植酸酶活性測定。采用硫酸亞鐵-鉬藍法檢測植酸酶活性。先用10 mL LB培養(yǎng)菌24 h，離心，菌體用無菌水洗3次，溶解于1 mL無菌水，取30 μL接種于10 mL植酸酶篩選培養(yǎng)基中，30 ℃，170 r/min搖床中培養(yǎng)5 d。取發(fā)酵液離心取上清，得到粗酶液。將200 μL粗酶溶液與800 μL底物溶液于37 ℃孵育30 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸終止液終止反應，加入2 mL顯色劑，10 min后測量700 nm處的吸光度分析釋放的有機磷酸鹽。將1個單位的植酸酶活性定義為在植酸鈉濃度為1 mmol/L，溫度為37 ℃，每分鐘釋放1 μmol磷酸鹽的酶量（U/mL）。

1.2.3 ?菌株促生特性分析 ?（1）番茄種子促生試驗。將14株芽胞桿菌發(fā)酵液稀釋1000倍，清水為對照。挑選相對一致的番茄種子置于底部鋪置2～3層濾紙的9 cm透明培養(yǎng)盒中，每個培養(yǎng)盒15粒番茄種子，每個處理重復3次，共計45顆。置于27 ℃恒溫人工氣候箱，光照16 h、黑暗8 h。觀察記錄番茄發(fā)芽情況，直到連續(xù)3 d無新的發(fā)芽粒出現(xiàn)，統(tǒng)計發(fā)芽率并測量胚根長與胚芽長。

（2）番茄幼苗促生試驗。基于種子促生實驗結(jié)果，挑選6株芽胞桿菌用于盆栽苗實驗，將芽胞桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 170 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)至菌密度約為（0.8×108）～ （1.2×108） CFU/mL（OD600=0.8左右）。挑選長勢相近的番茄幼苗，移栽于花盆中，每盆4株。設置試驗組、對照組（CK），每個處理組20株（5盆）。于室內(nèi)種植7 d后，進行發(fā)酵液灌根處理，用稀釋100倍的發(fā)酵液每周每盆澆灌200 mL。植物生長期間每2 d澆水1次，每2周澆霍格蘭液100 mL/盆。日夜溫度分別為25 ℃/20 ℃，日照時間為14 h，盆直徑為14 cm。每盆裝1 kg滅菌的蔬菜種植基質(zhì)。35 d后，測量各組番茄植株株高、莖粗、根長、根干重及地上部分干重。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

聚類分析：對各芽胞桿菌的解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ濃度等，以芽胞桿菌為樣本，檢測值為指標，數(shù)據(jù)不轉(zhuǎn)換，馬氏距離為尺度，用可變類平均法進行系統(tǒng)聚類。

相關分析：構(gòu)建各芽胞桿菌的檢測因子：解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、活菌數(shù)、發(fā)芽率、胚根長、胚芽長數(shù)據(jù)矩陣，以芽胞桿菌為樣本，檢測因子為指標，利用DPS統(tǒng)計軟件進行相關分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?促生作用芽胞桿菌篩選

2.1.1 ?菌株鑒定 ?對供試的14株菌株進行分子鑒定，采用引物27 F和1492 R進行PCR擴增，條帶在1400 bp左右。通過16S rRNA鑒定與同源性比對，試驗菌株為芽胞桿菌科的2個屬、9個種，鑒定結(jié)果見表1。其中，芽胞桿菌屬有7個種，為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、暹羅芽胞桿菌（Bacillus siamensis）、副炭疽芽胞桿菌（Bacillus paranthracis）、萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）、圖瓦永芽胞桿菌（Bacillus toyonensis）、貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）和特基拉芽胞桿菌（Bacillus tequilensis）;而類芽胞桿菌屬有2個種，為土地類芽胞桿菌（Paeni?bacillus terrae）和苔原類芽胞桿菌（Paenibacillus tundrae）。

2.1.2 ?菌株高溫脅迫生長能力測定 ?不同的芽胞桿菌對高溫（60 ℃）脅迫生長的適應性不同，研究結(jié)果顯示，特基拉芽胞桿菌FJAT-49377在高溫下生長能力最強，活菌數(shù)達5.28×107 CFU/mL，而土地類芽胞桿菌FJAT-47525最弱，活菌數(shù)為0.32×107 CFU/mL（表2）。

2.2 ?與芽胞桿菌促生作用相關的生理生化特性

2.2.1 ?菌株無機磷降解能力測定 ?不同芽胞桿菌對無機磷的降解能力不同，芽胞桿菌降解無機磷的范圍在?2.05～297.36 mg/L（表3）。其中降解能力最強的是副炭疽芽胞桿菌FJAT-47469，磷增量為297.36 mg/L，較CK提高了588.25%;最弱的則為枯草芽胞桿菌FJAT-10626，磷增量為?2.05 mg/L，磷含量較CK減少3.02%。

對無機磷增量進行聚類分析表明，當λ=15.1時，供試菌株分為3個類群。類群I為沒有無機磷降解能力組，僅1個菌株，為枯草芽胞桿菌FJAT-10626，特征是不具備無機磷降解能力，磷增量為-2.05 mg/L;類群II為中等無機磷降解能力組，包含6株芽胞桿菌（貝萊斯芽胞桿菌FJAT-49378、暹羅芽胞桿菌FJAT-49376、苔原類芽胞桿菌FJAT-49379、土地類芽胞桿菌FJAT- 47525、枯草芽胞桿菌FJAT-10275、暹羅芽胞桿菌FJAT-47169），其特征為具有中等無機磷降解能力，表現(xiàn)出中等的磷增量，范圍為55.27～94.67 mg/L;類群III為強無機磷降解能力組，包含其余7株芽胞桿菌，表現(xiàn)出較高的磷增量，其范圍為116.51～ 297.36 mg/L。

2.2.2 ?菌株有機磷降解能力測定 ?芽胞桿菌的有效磷含量見表4。不同的芽胞桿菌對有機磷的降解能力不同，范圍為?3.596～5.011 mg/L。其中，有機磷降解能力最強的菌株為圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648，磷增量為5.011 mg/L，較CK提高150.45%;降解能力最弱的為土地類芽胞桿菌FJAT-47525。

對有機磷增量進行聚類分析表明，當λ=13.6時，供試菌株分為3個類群。類群I為無有機磷降解能力組，該類群特征為磷含量減少較多，磷增量范圍為?3.60～ ?3.17 mg/L，包含2株芽胞桿菌（土地類芽胞桿菌FJAT-47525和萎縮芽胞桿菌FJAT-47472）;類群II為無有機磷降解能力組，磷含量減少適中，其磷增量范圍為?2.06～?1.70 mg/L，包含5株芽胞桿菌（暹羅芽胞桿菌FJAT-47226、枯草芽胞桿菌FJAT-10501、枯草芽胞桿菌FJAT- 14464、貝萊斯芽胞桿菌FJAT-49378、特基拉芽胞桿菌FJAT-49377）;類群III為低有機磷降解能力組，其特征為具有較弱有機磷降解能力，表現(xiàn)出相對高的磷增量，磷增量的范圍為?1.16～ 5.01 mg/L，包含其余7株芽胞桿菌。

2.2.3 ?菌株固氮效能測定 ?采用比色法測定了芽胞桿菌的固氮效能。不同芽胞桿菌的固氮效能存在差異，固氮效能范圍為-8.80～27.67 mg/g（表5）。最高為萎縮芽胞桿菌FJAT-47472，其固氮效能為27.67 mg/g;最低的則為圖瓦永芽胞桿菌FJAT- 47648。

對固氮效能進行聚類分析表明，當λ=14.75時，供試菌株分為3個類群。類群I為低固氮效能組，僅1株芽胞桿菌（圖瓦永芽胞桿菌FJAT- 47648），其特征為固氮能力較低，固氮效能為-8.80 mg/g;類群II為中固氮效能組，包含4株芽胞桿菌（副炭疽芽胞桿菌FJAT-47469、枯草芽胞桿菌FJAT-10275、枯草芽胞桿菌FJAT-10626、苔原類芽胞桿菌FJAT-49379），其特征為具有中等固氮能力，表現(xiàn)出中等的固氮效能，其范圍為-1.74～7.62 mg/g;類群III為高固氮效能組，包含其余9株芽胞桿菌，其特征為具有相對高的固氮能力，固氮效能為10.51～27.67 mg/g。

2.2.4 ?菌株產(chǎn)IAA能力測定 ?采用Salkowski比色法檢測了芽胞桿菌產(chǎn)IAA的含量，結(jié)果表明所有供試菌株能具備產(chǎn)IAA的能力，其濃度范圍為1.23～10.29 mg/L（表6）。其中IAA含量最高的菌株為貝萊斯芽胞桿菌FJAT-49378，為10.29 mg/L;而含量最低的為圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648，濃度為1.23 mg/L。

通過聚類分析表明，λ=15.0時，供試菌株分為3個類群。類群I為高產(chǎn)IAA組，包含2株芽胞桿菌（貝萊斯芽胞桿菌FJAT-49378和苔原類芽胞桿菌FJAT-49379），其特征為IAA含量較高，為10.00～10.29 mg/L;類群II為低產(chǎn)IAA組，包含3株芽胞桿菌（枯草芽胞桿菌FJAT-10626、枯草芽胞桿菌FJAT-14464和圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648），其特征為產(chǎn)IAA能力較弱，IAA含量為1.23～5.16 mg/L;類群III則為中等產(chǎn)IAA組，包含了其余9株芽胞桿菌，其特征為具有中等的產(chǎn)IAA能力，產(chǎn)生的IAA含量范圍為7.17～ 8.98 mg/L。

2.2.5 ?菌株PQQ濃度測定 ?采用光譜法測定了芽胞桿菌對產(chǎn)吡咯喹啉醌的濃度（表7）。其中，產(chǎn)PQQ的菌株有7株，占供試菌株數(shù)的50%，PQQ的濃度范圍為0.00～55.01 μg/mL，含量最高的菌株為暹羅芽胞桿菌FJAT-49376。

對PQQ濃度進行聚類分析表明，當λ=9.75時，供試菌株分為3個類群。類群I為高產(chǎn)PQQ能力組，包含5株芽胞桿菌（暹羅芽胞桿菌FJAT- 47226、暹羅芽胞桿菌FJAT-47169、貝萊斯芽胞桿菌FJAT-49378、枯草芽胞桿菌FJAT-10275和暹羅芽胞桿菌FJAT-49376），其特征為具有較強的產(chǎn)PQQ能力，表現(xiàn)出較高PQQ濃度，范圍為21.08～55.01 μg/mL;類群II為PQQ中等產(chǎn)量組，包含2株芽胞桿菌（副炭疽芽胞桿菌FJAT-47469和圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648），其特征為具有中等產(chǎn)PQQ的能力，其PQQ濃度范圍為3.86～ 7.37 μg/mL;類群III為不產(chǎn)PQQ組，包含其余7株芽胞桿菌，PQQ濃度為0。

2.2.6 ?菌株植酸酶活性測定 ?采用硫酸亞鐵-鉬藍法檢測了菌株的植酸酶活性，酶活范圍為0.00～ 19.62 U/mL（表8）。植酸酶酶活最高菌株為枯草芽胞桿菌FJAT-14464，為19.62 U/mL。供試菌株中具有植酸酶活性的菌株有10株，包含全部暹羅芽胞桿菌菌株（3株）與枯草芽胞桿菌菌株（4株）。

對植酸酶活性進行聚類分析表明，當λ=9.75時，供試菌株分為3個類群。類群I為無植酸酶活性組，包含4株芽胞桿菌（苔原類芽胞桿菌FJAT-49379、土地類芽胞桿菌FJAT-47525、萎縮芽胞桿菌FJAT-47472和副炭疽芽胞桿菌FJAT- 47469），其植酸酶活性為0;類群II為低植酸酶活性組，包含1株芽胞桿菌（暹羅芽胞桿菌FJAT-47169），其特征為具有中等植酸酶活性，其酶活為7.90 U/mL;類群III為高植酸酶活性組，包含其余9株芽胞桿菌，其特征為具有較強的植酸酶活性，表現(xiàn)出較高植酸酶酶活，范圍為13.39～19.62 U/mL。

2.3 ?芽胞桿菌對番茄種子發(fā)芽的影響

2.3.1 ?芽胞桿菌對番茄種子發(fā)芽的影響 ?通過種子發(fā)芽試驗，研究芽胞桿菌對番茄種子的促生作用，結(jié)果見表9。不同芽胞桿菌對番茄種子生物活性的影響存在不同。從發(fā)芽率看芽胞桿菌對番茄種子的發(fā)芽均有促進作用，種子發(fā)芽率范圍為82.22%～93.33 %，較CK提高了0.74%～11.85%。其中暹羅芽胞桿菌FJAT-49376和特基拉芽胞桿菌FJAT-49377的促發(fā)芽效果最明顯，其發(fā)芽率達93.33%。從胚根長度來看，12株芽胞桿菌對胚根的生長具有促生作用，其胚根長為54.97～ 87.36 mm，較CK提高了4.03～65.33%。同時存在2株菌對番茄種子胚根的生長具有抑制作用，分別為暹羅芽胞桿菌FJAT-49376和暹羅芽胞桿菌FJAT-47226。從胚芽長來看，有8株芽胞桿菌對種子胚芽有促進作用，其中促生作用最明顯的是土地類芽胞桿菌FJAT-47525，增長率為18.17%。

2.3.2 ?芽胞桿菌對番茄種子發(fā)芽促生因子的相關分析 ?構(gòu)建分析數(shù)據(jù)矩陣，以芽胞桿菌為樣本，以6個促生因子、芽胞桿菌活菌數(shù)、種子生物學特性（發(fā)芽率、胚根長、胚芽長）為指標，進行相關系數(shù)統(tǒng)計，分析結(jié)果見表10。統(tǒng)計結(jié)果表明，促生因子（解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ濃度）之間無相關關系（P>0.05），與芽胞桿菌活菌數(shù)無相關關系（P> 0.05），與種子發(fā)芽率、胚根長、胚芽長也無明顯相關關系（P>0.05）。種子生物學特性中發(fā)種子芽率與胚根長、胚芽長無相關關系（P>0.05），而胚根長和胚芽長之間具有顯著性相關（P<0.01）。

2.3.3 ?基于芽胞桿菌的種子發(fā)芽率促生因子聚類分析 ?構(gòu)建矩陣，以解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ濃度、活菌數(shù)、發(fā)芽率、胚根長、胚芽長等為樣本，以芽胞桿菌為指標，進行聚類分析（圖1）。當λ=7.7時，供試菌株分為3個類群。類群I為種子的生物學特性組，包括了3個因子，分別為發(fā)芽率、胚芽長和胚根長;類群II為活菌數(shù)、PQQ濃度和植酸酶活性;類群III為解有機磷能力、解無機磷能力、固氮效能與產(chǎn)IAA含量。

2.4 ?芽胞桿菌對番茄幼苗的促生作用

為了進一步驗證芽胞桿菌對番茄的促生效果，采用株高、根長和莖粗3個指標，評價芽胞桿菌對番茄幼苗生長特性的影響（表11）。結(jié)果表明，不同芽胞桿菌對番茄幼苗促生效果存在不同。試驗的5株芽胞桿菌均能顯著提升株高，增長率達36.00%～59.61%，其中，暹羅芽胞桿菌FJAT-47169效果最好，能提升幼苗株高達59.61%。在促進根生長方面，3株菌均能顯著增加根長42.74%～53.31%，副炭疽芽胞桿菌FJAT- 47469的促生效果最明顯，增長率為53.31%。但番茄幼苗經(jīng)各芽胞桿菌處理后，莖粗均與對照無顯著差異。

在芽胞桿菌處理對植株生物量的影響方面，4株芽胞桿菌能顯著增加地上部干重，增長率為72.36%～102.80%，其中暹羅芽胞桿菌FJAT- 47169的增長率最高，為102.80%。而圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648和副炭疽芽胞桿菌FJAT-47469能顯著提高地下部干重，較CK分別增加了60.26%和 64.29%。

3 ?討論

芽胞桿菌是一類重要的農(nóng)業(yè)微生物，目前關于促生芽胞桿菌的報道較多，包括解淀粉芽胞桿菌[18]、地衣芽胞桿菌[19]、枯草芽胞桿菌[20]、短短芽胞桿菌[5]、環(huán)狀芽胞桿菌[21]、蠟狀芽胞桿菌[22]、巨大芽胞桿菌[23]、蘇云金芽胞桿菌[24]和膠凍樣芽胞桿菌[25]等。本研究篩選到新的促生芽胞桿菌種類，為苔原類芽胞桿菌（Paenibacillus tundrae），國內(nèi)僅見該菌產(chǎn)纖維素酶的報道[36]，研究其作為植物促生菌，還未見報道。本研究表明，苔原類芽胞桿菌FJAT-49379能夠產(chǎn)IAA（含量為10 mg/L），并對番茄種子有一定的促生作用。

芽胞桿菌能促進植物種子萌發(fā)、幼苗及根系生長[37]，提高植物產(chǎn)量，改善品質(zhì)。目前，關于芽胞桿菌促生作用的報道較多，車建美等用短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的菌體、發(fā)酵上清液及發(fā)酵液噴施的番茄苗葉片數(shù)量明顯增加，芽長和莖粗也明顯高于對照組[5]。張翠綿等研究表明接種枯草芽胞桿菌G81后，番茄幼苗的各項生理指標均明顯提高[38]。本研究也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，芽胞桿菌對番茄種子、番茄幼苗都表現(xiàn)出明顯的促生效果。在對番茄種子促生方面，14株芽胞桿菌提升了番茄種子的發(fā)芽率，增長0.74%～ 11.85%。其中暹羅芽胞桿菌FJAT-49376和特基拉芽胞桿菌FJAT-49377的發(fā)芽率達93.33%;12株芽胞桿菌能促進番茄種子胚根的生長，較CK提高了4.03%～65.33%;8株芽胞桿菌對種子的胚芽生長有促進作用，其中土地類芽胞桿菌FJAT- 47525的效果最好，胚芽較對照提高18.17%。在對番茄幼苗（盆栽苗）促生方面，5株芽胞桿菌

能顯著提升株高，增長率為36.00%～59.61%;3株菌顯著促進根長，增長率為42.74%～53.31%;而莖粗與對照則無明顯差異;4株芽胞桿菌能顯著促進地上部生物量，地上部干重增長達72.36%～ 102.80%;而2株芽胞桿菌能顯著提高地下部干重，增長60.26%～64.29%。另外，研究結(jié)果表明，供試的所有芽胞桿菌對番茄幼苗均有一定的促生作用，但促生的部位與效果存在不同。如圖瓦永芽胞桿菌FJAT-47648能顯著增加根長，提升地上部與地下部干重，而暹羅芽胞桿菌FJAT- 47226的促生效果則主要表現(xiàn)在增加株高和地上部生物量上。

近年來，研究者們陸續(xù)開展促生因子的特性及其相關性的研究。王奎萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，解磷、固氮、產(chǎn)IAA與植物促生效果間存在明顯的正相關，且解磷和固氮活性對植物的影響要大于產(chǎn)IAA活性;焦子偉等[15]認為PQQ可作為直接促生因子和IAA共同參與HX2菌株對增加玉米生物量，提高營養(yǎng)攝入，促進其根形態(tài)等有關鍵的調(diào)控作用;謝越盛等[39]以固氮、解（溶）磷以及分泌嗜鐵素、IAA活性為指標，對其促生能力進行賦值評估，結(jié)果表明細菌的平板活性賦值與促生效果之間存在較高的正相關性。芽胞桿菌促生因子對植物的促生作用是相互獨立的，研究表明，促生因子（解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ濃度）之間無相關關系（P>0.05），與番茄種子發(fā)芽率、胚根長、胚芽長也無明顯相關關系（P>0.05）。研究發(fā)現(xiàn)促生作用好的芽胞桿菌，其促生因子含量并不一定高，反之也成。芽胞桿菌促生因子的作用十分復雜，有待于進一步研究。

研究結(jié)果表明，芽胞桿菌促生因子獨立發(fā)生作用的，促生的過程十分復雜，特定的促生因子所起到作用有限。篩選出的4株芽胞桿菌，盡管它們的促生因子并非最好，但能夠顯著增加地上部干重，增長72.36%～102.80%，而2株芽胞桿菌可以顯著提高地下部干重，較CK分別增加了60.26%～64.29%。具有高效促生功能的微生物肥料用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能夠充分利用土壤潛在元素，對促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前存在的問題包括促生菌種類很多，但是部分菌株在田間的效果不穩(wěn)定，針對性不強，因此需要繼續(xù)開展菌種適生性、穩(wěn)定性與促生作用機理的研究。本研究篩選到的菌株，在田間環(huán)境的適應性，在不同作物根際的定殖能力與解磷、固氮、產(chǎn)生長素的實際效果，還有待進一步研究。

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責任編輯：謝龍蓮

收稿日期 ?2020-04-24;修回日期 ?2020-06-16

基金項目 ?公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（No. 2019R1034-4）;福建省自然科學基金項目（No. 2018J01036）。

作者簡介 ?陳 ?崢（1982—），男，博士，助理研究員，研究方向：微生物代謝物及功能成分。*通信作者（Corresponding author）：劉 ?波（LIU Bo），E-mail：fzliubo@163.com。