CSRP1蛋白在大腸癌中的表達及意義

石 宇，王宇博,謝 風，何成彥，師慶紅

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130033)

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(CSRP)家族是一組由兩個串聯排列的LIM結構域與短的富含甘氨酸的區(qū)域相連的蛋白質[1]。到目前為止，CSRP家族中的三個成員(CSRP1，CSRP2和CSRP3)已被證實在脊椎動物中表征，并且展示了具有獨特雙重亞細胞定位的組織特異性分布。其中，CSRP1已經在富含平滑肌的各種器官中檢測到高表達[2]。本研究旨在探討CSRP1在大腸癌及癌旁組織中的表達情況，研究其差異，探究其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關系，為臨床診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

遴選吉林大學中日聯誼醫(yī)院近兩年內已確診大腸癌患者17例，取新鮮癌組織及距其邊緣10 cm以上的癌旁正常組織標本，取材后立即液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

于GE公司(美)購入DTT、SDS、TMED、SDS，于西格瑪公司(美)購入RNA酶、DNA酶、尿素，于Beyo-time公司購入PMSF、考馬斯亮藍-G250，于Bio-Rad公司購入蛋白質定量試劑盒，于賽摩-菲舍爾公司購入LTQ XL離子肼質譜儀。

1.3 方法

1．3．1提取樣本總蛋白，檢測其濃度 打開低溫冰箱取出樣本，將80 mg樣本組織與液氮混合，研磨充分，至其全部粉碎成勻漿。將研磨后樣本以12 000 g離心1 h(溫度 控制在4℃左右)，取離心后上清液體備用。考馬斯亮藍染色后，在595 nm下檢測吸光度，確定蛋白濃度。檢測結束后，將液體分裝，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2水解樣本蛋白，制備多肽混合物 于低溫冰箱中取出樣本，于室溫靜置，待其溫度平衡后，應用NH4HCO3稀釋上述樣本以達到降低尿素濃度的目的。加入適量DTT，充分混勻，確保其最終濃度在20 mmol/L。將制備好的樣本放于56℃避光保存1 h。完成上述操作后，將反應溫度調整至室溫，應用適量IAA調整最終濃度至50 mmol/L，于避光處靜置30 min。加入1∶50固定比例的胰酶：蛋白，37℃水浴過夜。將酶切產物置于-80℃保存。

1．3．3應用液質聯用技術鑒定分析多肽混合物 將樣品溶解于Buffer A，每次取出50 μg上樣分析，將制得的多肽放入LTQ XL質譜儀中進行分析，挑選恰當的核質比檢測區(qū)間，應用數據依賴方式進行質譜掃描。得到的質譜圖用Bio-works3.3.1SP1軟件的SEQUEST算法分析處理，用Uniprot-sprot數據庫查詢，對差異蛋白進行比較。

1．3．4Western Blot分析 將CSRP1作為目標蛋白，應用免疫印跡試驗驗證，確定CSRP1蛋白在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達情況。試驗應用ABGENT公司(美)采購的CSRP1單克隆抗體，內參為β-actin。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 液質聯用技術對樣本蛋白酶解產物的分析

本試驗旨在分析大腸癌組織及癌旁正常組織樣本中同一蛋白質的豐度變化，若兩組樣本的譜圖數比值>1，差值>72，則可認為其豐度有差異。遵循上述標準，分析檢測結果得出大腸癌組織與癌旁正常組織共有44個差異蛋白，其中21個蛋白表達情況為上調，23個表達情況為下調。本文研究的CSRP1屬于下調表達蛋白之一，其質譜圖如下(圖1)。

圖1 CSRP1質譜圖

2.2 Western Blot驗證結果

Western Blot試驗證實了CSRP1蛋白在大腸癌組織中和癌旁正常組織中的差異表達，其結果如下(圖2) 。通過對免疫印跡試驗的結果分析，可以得出CSRP1在癌組織中低表達，在癌旁正常組織中高表達的結論。

3 討論

近年來，大腸癌發(fā)病幾率越來越高。由于起病過程隱匿，患者在疾病早期并無明顯癥狀，確診大腸癌時已接近中晚期，這不僅加大了疾病的治療難度，同時也降低了患者的生存率。因此，早診斷、早治療依舊是大腸癌現階段研究的重點。隨著醫(yī)學檢驗相關技術突飛猛進的發(fā)展，蛋白質組學對癌組織中蛋白質的表達情況、癌旁正常組織中的對比情況的研究有重要意義[3,4]。通過對比分析某種蛋白在不同組織中的差異表達，可以為臨床腫瘤的診斷提供新的標志物。

圖2 CSRP1免疫印跡圖

富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質1是由兩個串聯排列的LIM結構域與短的富含甘氨酸的區(qū)域相連的蛋白質，具有連接肌動蛋白束和α-肌動蛋白的作用，同時可以捆綁肌動蛋白微絲[5]。有研究表明，CSRP1是足體新成份之一，足體具有促進ECM(細胞外基質)降解的作用，并與細胞運動有關。蛋白質功能的發(fā)揮是由其細胞定位決定的，二者息息相關[6]。研究蛋白質在某種細胞中的定位,并且對比其在某種疾病情況下的定位對臨床診斷意義重大。CSRP1是骨架蛋白之一，已有研究證實CSRP1在細胞質的表達較為明顯。除此之外，CSRP1還可以抑制細胞增殖，當應激狀態(tài)下誘導凋亡時，對細胞具有一定的保護作用[7]。

CSRP1已被證實在富含平滑肌的器官中高表達，其中濃度最高的是前列腺和直腸，大腦、睪丸次之，脾臟和肝臟濃度較低，腎臟最少。此外，有研究證實，CSRP1與特發(fā)性肺纖維化關系緊密，可能會增加這類患者肺癌的發(fā)病幾率[8]。在腫瘤組織中，CSRP1同樣存在表達失調的情況，例如乳腺癌骨轉移患者和低轉移骨肉瘤患者均可將其作為特征標志物，前列腺癌、腎癌組織中也出現了CSRP1的表達失調[9-12]。

本試驗表明，CSRP1在大腸癌組織中的表達低于癌旁正常組織，WesternBlot試驗進一步證實了大腸癌組織中CSRP1下調表達。該結果與現有研究結果一致。CSRP1在不同腫瘤組織中的表達情況差異較大，說明其與腫瘤的發(fā)展及愈后關系密切，CSRP1的作用機制還有待進一步探討。