以還原型谷胱甘肽干預(yù)慢性酒精中毒動物模型升主動脈力學(xué)特性分析

逯 遙，姜東莉，劉 洋，齊 兵*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.中醫(yī)科；2．藥學(xué)部， 吉林 長春130033)

高脂飲食和過量飲酒是一種十分普遍的不良生活方式,嗜酒、酗酒、酒精依賴導(dǎo)致酒精中毒呈年輕化趨勢,嚴(yán)重危及人類健康和社會安定。濫用酒精已經(jīng)成為世界性的問題。長期大量飲酒可引起高血壓、腦卒中、酒精性心肌病和心律失常[1]。

以往的研究[2，3]均未涉及慢性酒精中毒模型以阿拓莫蘭治療后的升主動脈的生物物力學(xué)特性對比分析，因此，對慢性酒精中毒模型以阿拓莫蘭干預(yù)治療后，升主動脈的生物力學(xué)特性對比分析顯得十分迫切和必要。我們推測慢性酒精中毒病動物模型升主動脈拉伸力學(xué)特性發(fā)生改變，以阿拓莫蘭治療后可能會在一定程度恢復(fù)其力學(xué)性能。本實驗復(fù)制Sprague-Dawley大鼠慢性酒精中毒模型，以阿拓莫蘭對大鼠慢性酒精中毒模型進(jìn)行干預(yù)治療后對各組大鼠血清的生物學(xué)指標(biāo)MDA、SOD、MT進(jìn)行測定，對大鼠升主動脈進(jìn)行拉伸力學(xué)性能實驗，以大鼠血漿生物學(xué)指標(biāo)MDA、SOD、MT和大鼠升主動脈生物力學(xué)指標(biāo)研判阿拓莫蘭對大鼠酒精中毒的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性5月齡SD大鼠60只，體重245-248 g由長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供[許可證號：SCXK-(吉)：2003-0004]。

1.2 藥物

還原型谷胱甘肽,重慶藥友制藥有限公司。

1.3 實驗大鼠分組

大鼠飼養(yǎng)1周后,60只大鼠隨機分為對照組20只、慢性酒精中毒模型組(以下簡稱模型組)20只，慢性酒精中毒模型以還原型谷胱甘肽干預(yù)組(以下簡稱干預(yù)組)20只。

1.4 大鼠酒中毒模型復(fù)制與藥物干預(yù)

按參考文獻(xiàn)[4]的方法建立慢性酒中毒大鼠模型:第1 周以酒精濃度為5%、第二周以酒精濃度10%、第三周以酒精濃度20%、 第4-8周以35%(V/V)濃度(乙醇3.50 g· kg-1· d-1)對大鼠灌胃;以同等體積的生理鹽水10 ml· kg-1· d-1對正常對照組大鼠灌胃 。建模60 d 后，大鼠性情不穩(wěn)定，毛發(fā)無光澤，精神萎靡、煩躁不安，反應(yīng)淡漠、行動遲緩、 食欲減退， 重者體態(tài)呆板、流涎、 嗜睡， 活動明顯減少， 進(jìn)食量減少， 體 重 增 長 緩 慢 ， 證 明 慢 性 酒 精 中 毒 模 型 復(fù)制成 功。對模型組大鼠于造模第60 d 后開始每只大鼠每天注射還原型谷胱甘肽(阿拓莫蘭)400 mg /k g，連續(xù)注射3周。

1.5 儀器和試劑

MDA、SOD、MT試劑盒( 南京建成生物工程研究所);KDC 40 離心機( 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.6 大鼠升主動脈試樣切取與試樣加工

各組大鼠建模60天后，以腹腔注射(水合氯醛(0．3 ml/100 g)的方法麻醉大鼠后開胸，在鎮(zhèn)江市卓創(chuàng)醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的ZC-x-6A手術(shù)顯微鏡下找到大鼠升主動脈，以浙江省遂昌雙劍醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的無菌塑柄手術(shù)刀切取各組大鼠升主動脈，每組各20個長為20 mm的升主動脈標(biāo)本，將升主動脈標(biāo)本置于生理鹽水槽中。

1.7 大鼠血清制作

對各組大鼠行剪尾取血，每只大鼠 采血 8 ml，在常溫下靜置 45 min，低速離心機以 2 000 r/min 離心 20 min，取上清，置于 1.5 ml 離心管內(nèi)，置于-20℃冰箱保存，待測量金屬硫蛋(metallothionein，MT、超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)丙二醛(malondialdehyde，MDA) 含量。

1.8 各組大鼠血清中MDA、MT、SOD 的測試方法

按丙二醛(MDA)試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法測定大鼠腦組織勻漿MDA含量；大鼠腦組織勻漿中MDA含量 (nmol/ml)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)x樣品測試前稀釋倍數(shù)。

按MT試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法測定血漿MT含量。

按SOD試劑盒操作說明，以日本東京日立公司U3410 分光光度儀采用黃嘿吟氧化酶(XO)法測定大鼠血漿SOD含量。

1.9 大鼠升主動脈拉伸實驗方法

實驗設(shè)備采用長春試驗機研究所生產(chǎn)的電子萬能試驗機(長春，吉林省，中國)，試驗機配有溫控儀、環(huán)境溫箱，根據(jù)需要可自行設(shè)定實驗環(huán)境溫度。以長春市第三儀器廠生產(chǎn)的CCs-3型讀數(shù)顯微鏡測量各組大鼠升主動脈試樣的直徑，以還原型谷胱甘肽干預(yù)組大鼠升主動脈試樣直徑1.01-1.04 mm、慢性酒精中毒大鼠模型組大鼠升主動脈試樣直徑0.99-1.03 mm、對照組大鼠升主動脈試樣直徑1.02-1.05 mm，實驗環(huán)境溫度設(shè)定為36.5℃±0.5℃，按參考文獻(xiàn)[16-18]的方法對各組大鼠升主動脈試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)，分別將每個預(yù)調(diào)過的試樣裝夾于試驗機的夾具內(nèi)，以2 mm/min的載荷增加速度對試樣進(jìn)行實驗。為了保持試樣濕度，實驗中向試樣噴灑生理鹽水。實驗結(jié)束后,計算機自動輸出 試樣的彈性模量、最大應(yīng)變、最大應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力，應(yīng)力-應(yīng)變曲線等。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清MT、 MDA、SOD 測試結(jié)果

各組大鼠血清中MT、 MDA、SOD 測試結(jié)果見表1。谷胱甘肽干預(yù)組SOD含量和MT含量大于模型組，MDA含量小于模型組，差異顯著(P<0.05)。

2.2 大鼠升主動脈試樣拉伸實驗結(jié)果

大鼠升主動脈試樣拉伸實驗結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠血清中 MT、 MDA、SOD測試結(jié)果(n=20)

注：與模型組比較*P<0.05

表2 大鼠升主動脈拉伸實驗結(jié)果

注：與模型組比較，*P<0.05

2.3 各組大鼠升主動脈試樣應(yīng)力-應(yīng)變曲線

各組大鼠升主動脈試樣的應(yīng)力-應(yīng)變曲線見圖1。

圖1 各組大鼠升主動脈試樣應(yīng)力-應(yīng)變曲線

2.4 大鼠升主動脈試樣應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系表達(dá)式的構(gòu)建

以回歸分析的方法，由各組大鼠升主動脈試樣拉伸實驗得出的應(yīng)力、應(yīng)變數(shù)據(jù)建立各組大鼠升主動脈試樣的應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式，結(jié)果如下：

對照組：σ(ε)=0.0000e5-0.0001e4+0.031e3+ 0.58526e2+2.252e

模型大鼠組：σ(ε)=0.0000e5+0.0003e4+0.0237e3+0.0680e2+2.8429

以谷胱甘肽干預(yù)組：σ(ε)=0.0000e5-0.0001e4+0.0134e3+0.0797e2+3.0715e

3 討論

各組大鼠血漿中MDA、SOD、MT的測定結(jié)果表明，以谷胱甘肽干預(yù)組SOD含量和MT含量大于模型組，MDA含量小于模型組(P<0.05)。分析認(rèn)為大鼠酒中毒后使心、腦血管組織缺缺氧、缺血，從而引起心、腦組織自由基釋放，造成SOD值下降，MDA值上升，大鼠酒中毒模型通過以谷胱甘肽干預(yù)后提高了SOD值，降低了MDA值。谷胱甘肽具有一定的提高自由基的代謝能力的作用。有研究表明，金屬硫蛋白MT是一種高效的自由基清除劑，對在氧化應(yīng)激狀態(tài)下機體組織、細(xì)胞具重要的保護(hù)作用；MT可直接捕獲多種活性氮和自由基，起到清除自由基的作用[4]。酒精在體內(nèi)代謝后會產(chǎn)生大量自由基，并通過氧化應(yīng)激反應(yīng)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，金屬硫蛋白MT作為一種具有高效保護(hù)性蛋白，發(fā)揮重要的抗氧化作用。分析認(rèn)為，長期的酒精攝入會使動物心、腦組織內(nèi)MT含量發(fā)生變化.模型組MT含量的降低，說明心、腦組織清除自由基的能力下降。酒精中毒使大鼠心、腦組織受到損傷后造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，這種氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是慢性酒精中毒性心、腦損害的發(fā)病機制之一；長期大量酒精攝入可導(dǎo)致動物心、腦組織中氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，從而導(dǎo)致心、腦組織損傷，氧化應(yīng)激可能是慢性酒精腦損害的中間環(huán)節(jié)或始動因素，對慢性酒精中毒患者要盡早進(jìn)行抗氧化治療，中斷氧化應(yīng)激反應(yīng)的惡性循環(huán)，使氧自由基的平衡狀態(tài)得到恢復(fù)[5]。

各組大鼠升主動脈試樣拉伸實驗結(jié)果表明,對照組大鼠升主動脈試樣拉伸彈性限度應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變大于模型組和谷胱甘肽干預(yù)組，其彈性模量小于模型組和谷胱甘肽干預(yù)組，差異顯著(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。以谷胱甘肽干預(yù)組升主動脈拉伸彈性限度應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、最大應(yīng)變、最大應(yīng)力大于模型組，其彈性模量小于模型組，差異顯著(P<0.05)。有研究表明[6]，酒精中毒大鼠心血管都有炎癥損傷，酒精對心血管炎癥的反應(yīng)最為強烈。提示:酒精中毒后可以引起炎癥損傷，使心血管自身結(jié)構(gòu)的改變，對血流產(chǎn)生影響,造成心肌缺血缺氧性改變。血管壁中平滑肌細(xì)胞，彈性纖維、膠原纖維的結(jié)構(gòu)成份的含量和空間構(gòu)型對血管的生物力學(xué)性質(zhì)起著決定性的作用[7]。膠原纖維中的膠原組織在載荷作用下具有抵抗應(yīng)變和應(yīng)力的作用、彈性纖維中的膠原組織在應(yīng)力作用下具有延伸的作用[8]。分析認(rèn)為，由于酒精中毒模型組大鼠血管炎癥損傷，自身結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，升主動脈的拉伸力學(xué)性力學(xué)性質(zhì)也發(fā)生改變。

還原型谷胱甘肽廣泛分布于人體各器官內(nèi),對保護(hù)細(xì)胞膜的完整性、維持細(xì)胞生物功能具有重要作用,能參與過氧化物及自由基本結(jié)合、體內(nèi)氧化還原過程,以保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞,對抗氧化劑對巰基的破壞，對抗自由基對人體重要器關(guān)的損害[9-11]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)生成少量過氧化氫時,GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下,把H2O2還原成水,其自身被氧化GSSG。GSSG在谷胱甘肽還原酶的作用下,從NADPH+接受氫又被還原為GSH；GSH還可以和有機過氧化物起作用。這些過氧化物是需氧代謝的有害副作用,谷胱甘肽在這種解毒中起著關(guān)鍵性作用[12]。谷胱甘肽作為外源性自由基清除劑,既可以抑制過多的自由基,還可以挽救缺血組織,減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷阻止自由基產(chǎn)生的正反饋效應(yīng)，谷胱甘肽具有解毒作用[13]。本實驗結(jié)果表明，谷胱甘肽干預(yù)治療酒精中毒慢性療效顯著。

本文的特點是研究了以谷胱甘肽干預(yù)治療慢性酒精中毒模型和正常大鼠升主動脈的拉伸力學(xué)性能，以回歸分析的方法建立了慢性酒精中毒模型組、對照組、以谷胱甘肽干預(yù)治療組升主動脈的應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式，以數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)模型驗證各組大鼠升主動脈拉伸應(yīng)力-應(yīng)變實驗數(shù)據(jù)，大鼠升主動脈的應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式的構(gòu)建能更好的闡明慢性酒精中毒模型組和對照組、以谷胱甘肽干預(yù)治療組大鼠升主動脈脈的拉伸力學(xué)性質(zhì)，為慢性酒精中毒造成升主動脈損傷的發(fā)病機制提供生物力學(xué)方面的理論依據(jù)。