微小核糖核酸與抗血小板藥物反應(yīng)異質(zhì)性的相關(guān)研究進(jìn)展

劉軍，尹彤*

(1解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科，2國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100853)

血小板在血栓形成和延續(xù)的過程中發(fā)揮重要作用[1]，血小板異常激活會導(dǎo)致一系列血栓風(fēng)險事件發(fā)生，如腦卒中、心肌梗死等，而血小板功能異常還會導(dǎo)致嚴(yán)重出血。因此，抗血小板藥物在心腦血管血栓性疾病的防治過程中發(fā)揮核心作用。目前，臨床應(yīng)用的抗血小板藥物主要包括阿司匹林和P2Y12受體拮抗劑(如氯吡格雷、替格瑞洛)等?？寡“逅幬锸且话央p刃劍，抗血栓不足會導(dǎo)致嚴(yán)重心腦血管缺血性事件發(fā)生， 抗血栓過度又會導(dǎo)致嚴(yán)重出血事件。研究發(fā)現(xiàn)，抗血栓不足和過度所導(dǎo)致的嚴(yán)重缺血和出血事件均會導(dǎo)致患者預(yù)后不良，并增加死亡事件的發(fā)生風(fēng)險[2,3]。新型抗血小板藥物(如P2Y12受體拮抗劑替格瑞洛)能夠提供更快、更強(qiáng)有效的抗栓效果，但由于抗血小板反應(yīng)性的個體差異，仍有近10%的高危患者因高血小板反應(yīng)性發(fā)生嚴(yán)重的心血管事件[3,4]。因此，如何預(yù)測抗血小板藥物的抗栓療效，實現(xiàn)個性化抗血小板藥物治療，一直是心腦血管領(lǐng)域研究的熱點和亟待解決的難題。

表1 血小板miRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性相關(guān)研究

ACS: acute coronary syndrome; CHD: coronary heart disease; SCA: symptomatic atherosclerosis; CAD: coronary artery disease; DM2: type 2 diabetes mellitus; LD: loading dose; MD: maintaining dose; NC: negative correlation; UN: uncorrelated; PC: positive correlation

目前，臨床應(yīng)用的預(yù)測抗血小板反應(yīng)性的方法主要包括血小板功能檢測(如光密度比濁法、血栓彈力圖等)和藥物基因組學(xué)檢測，但這些方法均有局限性，尚無法充分預(yù)測抗血小板藥物反應(yīng)性的差異。血小板是由巨核細(xì)胞胞質(zhì)片段脫落而形成，盡管沒有細(xì)胞核，但血小板中存在大量微粒，其中包括核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)等物質(zhì)[5,6]，尤其是存在豐富的微小RNA(micro ribonucleic acid,microRNA)[7]。microRNA是非編碼RNA家族中的一員，通過影響信使RNA(messenger ribonucleic acid,mRNA)的穩(wěn)定性，負(fù)性調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄，對信號通路和細(xì)胞間作用發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。近年來多項研究顯示，血小板microRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性密切相關(guān)，其中包括能夠調(diào)控P2Y12受體編碼基因(P2RY12)表達(dá)的miR-223和miR-126，這為尋找能夠預(yù)測抗血小板藥物反應(yīng)性個體差異的生物標(biāo)志物提供了新的線索。鑒于此，本文將針對血小板microRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性的相關(guān)性進(jìn)行如下綜述。

1 microRNA在血小板中的表達(dá)情況

microRNA在血小板中表達(dá)極為豐富，目前通過各類研究方法(包括芯片篩查、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等)發(fā)現(xiàn)人類血小板中約有250～375種microRNA[7,8]。而早在2011年，Nagalla等[8]對19名健康志愿者的外周血進(jìn)行血小板提純后，通過芯片分析發(fā)現(xiàn)，血小板中總共存在284種microRNA，其中以miR-223的含量最為豐富，其次為miR-126，miR-21，let-7f等，這與隨后的幾個研究結(jié)果一致[10]。這些microRNA在血小板中發(fā)揮著多種功能，包括血小板mRNA翻譯和表達(dá)的調(diào)控、血小板反應(yīng)性的生物標(biāo)志物、成熟的巨核細(xì)胞microRNA水平的標(biāo)志物等[9,11-13]。

2 血小板microRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性的相關(guān)研究

自從2009年Landry等[7]首先報道了血小板中miR-223與血小板P2Y12受體通路相關(guān)后，一系列關(guān)于血小板microRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)性和潛在機(jī)制的研究開始問世(表1)。其中，miR-223和miR-126與P2Y12受體拮抗劑抗血小板反應(yīng)性的相關(guān)性備受關(guān)注。

2.1 miR-223與抗血小板藥物反應(yīng)異質(zhì)性的相關(guān)性及作用機(jī)制

miR-223是一類小的非編碼RNA，其編碼基因位于X染色體的Q12基因位點[14,15]。最初研究發(fā)現(xiàn)其在造血系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[16]，能夠促進(jìn)粒細(xì)胞分化和抑制紅系細(xì)胞分化[15,17]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在血小板和巨核細(xì)胞中其表達(dá)同樣十分豐富，因此在血栓形成過程中可能具有重要的調(diào)控作用，其能靶向調(diào)控位于X染色體上的7個mRNA的表達(dá)，包括與編碼腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)受體P2Y12的mRNA 結(jié)合，抑制P2Y12受體表達(dá)[18,19]。

由于血小板中的miR-223-P2Y12 mRNA通路在血小板功能調(diào)控方面具有重要的作用[7]，因此P2Y12受體及miR-223也成為臨床研究的重要分子，特別是miR-223與血小板對P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷反應(yīng)性的相關(guān)研究較多。Willeit等[12]首次發(fā)現(xiàn)抗血小板治療能夠降低血小板源性microRNA的表達(dá)，他們通過對9名男性健康志愿者進(jìn)行普拉格雷聯(lián)合阿司匹林抗血小板藥物干預(yù)，采用TaqMan定制探針，測定血漿中92種microRNA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中包括miR-223在內(nèi)的8種microRNA發(fā)生顯著變化。隨后，作者選取了33例頸動脈粥樣硬化患者，其中隨機(jī)選取8例服用阿司匹林聯(lián)合雙嘧達(dá)莫，4例服用阿司匹林+氯吡格雷，其余單用阿司匹林。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著抗血小板治療的加強(qiáng)，血漿中血小板miR-223表達(dá)降低。國內(nèi)Shi等[18]對冠心病患者血小板中microRNA與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的關(guān)系進(jìn)行研究，他們選取了33例需行經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)治療的冠心病患者，給予300 mg負(fù)荷劑量的氯吡格雷后，通過血小板反應(yīng)指數(shù)和血小板聚集區(qū)別高血小板反應(yīng)性和低血小板反應(yīng)性。在提取血小板microRNA后，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)觀察2組microRNA的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-223與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性減低相關(guān)。隨后的幾項研究也同樣證實，血小板miR-223的表達(dá)水平與抗血小板藥物反應(yīng)性相關(guān)。波蘭亞捷隆大學(xué)開展的一項包括21例非ST段抬高急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者血漿中miR-223表達(dá)情況的研究[20]，以及后續(xù)一項包括62例不穩(wěn)定心絞痛患者的研究進(jìn)一步證實，miR-223具有獨立預(yù)測氯吡格雷低反應(yīng)性的能力，并且隨著血小板抑制率增高其表達(dá)增加[21]。我們課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，在氯吡格雷低反應(yīng)性ACS患者的血小板中，miR-223比高反應(yīng)性組表達(dá)降低，但是上述相關(guān)性僅見于攜帶CYP2C19*2的患者中，提示miR-223對氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的影響受氯吡格雷代謝相關(guān)基因CYP2C19的影響[22]。

前期研究證實，血小板P2Y12受體是miR-223的靶點之一，能夠調(diào)節(jié)血小板功能(包括血小板聚集和顆粒分泌)，且能被ADP激活，是一類G蛋白偶聯(lián)受體。miR-223能夠穩(wěn)定地與人類P2Y12受體mRNA的3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)端結(jié)合，并且血小板P2Y12受體mRNA能夠與Ago2形成免疫共沉淀，miR-223還可調(diào)控P2Y12受體水平，進(jìn)而影響血小板功能[7]。miR-223降低可能會促進(jìn)P2Y12表達(dá)，增加血小板對ADP的敏感性。因此，血小板中miR-223的降低可用于預(yù)測P2Y12受體拮抗劑抗血小板的反應(yīng)性[18]。如果在新生血小板中上調(diào)miR-223表達(dá)，將會減少ADP受體表達(dá)，從而維持血小板的穩(wěn)定狀態(tài)。而另一項動物實驗顯示，miR-223對血小板產(chǎn)生及其功能的影響并不明顯[23]。Leierseder等[23]對miR-223基因敲除小鼠與野生型小鼠進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，二者血小板的數(shù)量、形態(tài)、壽命及血小板表面活性物質(zhì)均無明顯差異。血小板聚合度實驗顯示，敲除miR-223基因并沒有對小鼠血凝塊回縮速度、血小板聚集等產(chǎn)生影響。原因可能在于miR-223基因敲除小鼠的P2Y12受體編碼基因P2RY12 mRNA的3′UTR端并沒有miR-223的結(jié)合位點。前期研究顯示，miR-223正是通過結(jié)合基因P2RY12 mRNA的3′UTR端，調(diào)控P2Y12受體表達(dá)，從而影響血小板活性。

miR-223還可能是通過其直接作用于凝血因子相關(guān)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致血小板聚集和血栓風(fēng)險增加，削弱抗血小板藥物的反應(yīng)性。在條件性敲除miR-223基因的小鼠中，凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集增加，大塊穩(wěn)定血栓形成，血塊回縮時間延遲，血小板擴(kuò)散增加，同時血小板之間或者血小板與白細(xì)胞之間會自發(fā)性聚集。蛋白組學(xué)分析顯示，上述功能性改變與一系列蛋白表達(dá)增加相關(guān)，包括β1整合蛋白、kindlin-3以及凝血因子XⅢ-A。凝血因子XⅢ-A是miR-223的直接靶向結(jié)合物，參與維持纖維蛋白凝血塊的穩(wěn)定性，延遲血塊回縮時間。在miR-223敲除小鼠中，血塊回縮減弱，但用腐胺抑制凝血因子XⅢ-A后，血塊回縮正常(圖1)[24]。

總之，血小板miR-223能夠通過靶向結(jié)合人類P2Y12受體mRNA的3′UTR端，或者與凝血相關(guān)蛋白結(jié)合而影響血小板的活性，其中，與P2Y12受體結(jié)合在血小板活化過程中發(fā)揮著重要作用，是多種抗血小板藥物的作用靶點。因此，降低血小板miR-223的表達(dá)可能會引起P2Y12受體活性增加，進(jìn)而引起血小板活性增加。推測降低血小板miR-223的表達(dá)可能會增加血栓疾病風(fēng)險，如心肌梗死等。多項觀察性研究也證實降低血小板miR-223的表達(dá)與P2Y12受體拮抗劑作用減弱相關(guān)。

圖1 血小板microRNA影響血小板反應(yīng)性信號通路機(jī)制

2.2 miR-126與抗血小板藥物反應(yīng)異質(zhì)性的相關(guān)性及作用機(jī)制

2002年，Lagos等[25]通過測序首次在小鼠的心臟中發(fā)現(xiàn)了miR-126。從動物到人類，miR-126序列非常保守，在脊椎動物中，miR-126來源于編碼內(nèi)皮細(xì)胞特異分泌肽的Egfl7基因的第7個內(nèi)含子[26,27]，可以調(diào)控新生血管內(nèi)皮芽細(xì)胞的移動和定位[28]。miR-126具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性，在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)異常豐富，對維持細(xì)胞完整性具有重要作用。但循環(huán)中的miR-126并不完全來源于內(nèi)皮細(xì)胞。巨核細(xì)胞同樣表達(dá)miR-126，而循環(huán)中的miR-126則更多來源于血小板[12,29]。

Willeit等[12]首次發(fā)現(xiàn)抗血小板治療能夠降低血小板源性microRNA的表達(dá)，其中包括miR-126。無論在健康人還是頸動脈粥樣硬化患者中，隨著抗血小板治療的加強(qiáng)，血漿中血小板miR-126表達(dá)降低。Carino等[30]研究發(fā)現(xiàn)，將抗血小板治療藥物從氯吡格雷換成強(qiáng)效抗血小板藥物替格瑞洛后，血漿中的miR-126表達(dá)水平下降。

一系列研究顯示，血漿中血小板miR-126能夠作為生物標(biāo)志物預(yù)測PCI術(shù)后患者心血管不良事件的發(fā)生[31]。但是，由于抗血小板治療能夠降低血漿中miR-126的表達(dá)，因此在以血漿miR-126作為冠心病生物標(biāo)志物時，應(yīng)考慮血小板抑制劑如阿司匹林對其表達(dá)的影響[32]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中抑制miR-126的表達(dá)能夠降低花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集[12]。骨髓巨核細(xì)胞中含有豐富的miR-126，miR-126的過表達(dá)能夠降低靶基因去整合素樣金屬蛋白酶9(A disintegrin and metalloproteinase domain 9,ADAM9)的表達(dá)，而ADAM9能夠降低膠原誘導(dǎo)的血小板聚集[33]。上述研究證實，miR-126可能通過直接作用于ADAM9，導(dǎo)致血小板聚集功能改變，進(jìn)而導(dǎo)致抗血小板藥物反應(yīng)異質(zhì)性的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)，在miR-126-3p敲除小鼠的全血中，P2Y12受體表達(dá)顯著降低，由于P2Y12受體在血小板中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其在白細(xì)胞[34]和紅細(xì)胞[35]中的表達(dá)，因此，miR-126還可能通過間接作用于P2Y12受體的表達(dá)，導(dǎo)致抗血小板藥物反應(yīng)的異質(zhì)性(圖1)。

總之，抗血小板治療能夠影響血漿中miR-126的表達(dá)水平，隨著抗血小板強(qiáng)度的增加，miR-126的表達(dá)水平降低。同時，血漿miR-126還可作為心肌梗死及其他心血管不良事件的生物標(biāo)志物，但是需要考慮抗血小板藥物的影響。動物實驗初步證實，miR-126對抗血小板藥物反應(yīng)異質(zhì)性的影響機(jī)制可能與其對血小板靶基因ADAM9的直接作用和對P2Y12受體的間接作用有關(guān)，但是確切機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

2.3 其他microRNA與抗血小板藥物反應(yīng)性的相關(guān)研究

除了miR-223和miR-126以外，血小板來源的其他microRNA也被證實能夠與血小板活性相關(guān)基因相互作用，進(jìn)而影響抗血小板藥物的反應(yīng)性。Kondkar等[36]研究證實，過表達(dá)miR-96能夠通過靶向結(jié)合囊泡相關(guān)膜蛋白8(vesicle-associated membrane protein 8，VAMP8)-mRNA，抑制血小板活性，但在氯吡格雷治療的冠心病患者中，并沒有發(fā)現(xiàn)miR-96與抗血小板反應(yīng)性相關(guān)[18]。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)，血小板中過表達(dá)miR-26a與PCI術(shù)后患者氯吡格雷抵抗引起的高血小板反應(yīng)性相關(guān)。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)，miR-31能夠通過抑制血小板活化過程中的重要分子信號血栓素A2(thromboxane A2,TBXA2)受體起到抗血小板作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在服用氯吡格雷抗血小板治療的ACS患者中，高血小板反應(yīng)性組血小板miR-221和miR-21的表達(dá)均顯著低于低血小板反應(yīng)性組，表明血小板microRNA的表達(dá)與ACS患者氯吡格雷抗血小板療效相關(guān)[22]。Willeit等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抗血小板藥物能夠影響miR-150和miR-191的表達(dá)。

3 展望

在生物學(xué)和病理生理學(xué)領(lǐng)域，人們對血小板microRNA重要性的認(rèn)識正在逐漸增加，這為血小板microRNA的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。越來越多的研究證實，microRNA的表達(dá)量能夠反映循環(huán)中血小板的反應(yīng)性。目前對血小板活性的評估主要基于血小板的體外活性檢測，因此難以反應(yīng)體內(nèi)抗血小板藥物的療效。血小板microRNA表達(dá)水平的變化能夠反應(yīng)體內(nèi)抗血小板藥物的反應(yīng)性，未來有必要深入探討血小板microRNA指導(dǎo)下的個體化抗栓治療是否能夠改善臨床預(yù)后。目前，microRNA仍需人工提取，因此有必要發(fā)展快速提取和監(jiān)測microRNA的手段，加速microRNA的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。除此之外，由于樣本分離及樣本組成會對microRNA的表達(dá)產(chǎn)生影響，因此，有必要對血小板microRNA的檢測流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。隨著生物醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信將來有望通過對血小板microRNA的實時監(jiān)測，實現(xiàn)對抗血小板藥物的個體化選擇和應(yīng)用。