γδ T細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

陶林芬， 廖 容， 王紀(jì)珍， 曾志勇， 邱東飆， 陳君敏

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是異常漿細(xì)胞增生的一種惡性腫瘤。以骨骼破壞、骨質(zhì)疏松、腎功能損害和免疫球蛋白異常為主要臨床表現(xiàn)。近年來，隨著新的治療藥物如免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑等的出現(xiàn)以及自體造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用，MM的治療療效已有明顯提高。但由于骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性特點(diǎn)，MM仍被認(rèn)為是不可治愈的疾病[1]。不斷探索更好的藥物和方法來治療MM，仍是目前該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

近年來，細(xì)胞免疫治療在血液腫瘤研究中取得了重要進(jìn)展，已成為治療血液惡性腫瘤的重要手段[2-3]。γδ T細(xì)胞是表達(dá)TCR γδ的T細(xì)胞亞群，是一種既能殺傷腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞，又能識別癌抗原的免疫細(xì)胞，殺傷性較強(qiáng)，且無組織相容性抗原(major histocompatibility antigen，MHC)限制性。γδ T細(xì)胞在體內(nèi)的數(shù)量雖然較少，但在體外用磷酸抗原激活和IL-2刺激下可大量擴(kuò)增，并具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用[4-5]。由于MM是一種伴有嚴(yán)重免疫功能紊亂的腫瘤，表現(xiàn)為γδ T細(xì)胞的數(shù)量或功能異常[6]。因此，本研究通過體外研究γδ T細(xì)胞對MM細(xì)胞殺傷及凋亡方面的作用，以期為MM的細(xì)胞免疫治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 人MM細(xì)胞株RPMI 8226(美國ATCC公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；唑來膦酸(Zol，中國恒瑞公司)；重組人白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2，美國Peprotech公司)；Anti-human γδ TCR mAb(法國Immunotech公司)；Anti-human NKG2D mAb和Anti-mouse IgG mAb(美國eBioscience公司)；Anti-human CD3 mAb(美國Miltenyi Biotec公司)；Cyto Tox 96?非放射性細(xì)胞毒性試劑盒(美國Promega公司)；AnnexinV/PI試劑盒(中國Beyotime公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2儀器 全波長多功能酶標(biāo)儀(Infinite?M1000 Pro，瑞士帝肯公司)；熒光顯微鏡(MicroPublisher 3.3RTV，日本奧林巴斯公司)；流式細(xì)胞儀(FACSCanto II，美國BD Biosciences公司)。

1.2方法

1.2.1γδ T細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定 采集健康志愿者的外周血10 mL，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMNC)，重懸，按每孔細(xì)胞數(shù)(1～2)×106個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)當(dāng)日加入含Zol(終濃度為1 μmol/L)和IL-2(終濃度為200 IU/mL)的20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，每3天半換液1次，并加入含IL-2(200 IU/mL)的10% FBS的RPMI 1640新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，收集細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗滌2次，分別加入5 μL抗CD3-FITC與γδ TCR-PE抗體混勻，用抗鼠IgG單克隆抗體作同型對照，室溫避光孵育20 min，加入2 mL PBS洗滌1次，重懸于500 μL的PBS，流式細(xì)胞術(shù)行γδ T細(xì)胞表型鑒定。

1.2.2CCK-8檢測擴(kuò)增后γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞增殖的抑制作用 以人MM細(xì)胞株RPMI 8226為靶細(xì)胞，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，同時(shí)收集γδ T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。按效靶比為1∶1，5∶1和10∶1分別將效應(yīng)細(xì)胞γδ T細(xì)胞和處于對數(shù)增長期的靶細(xì)胞RPMI 8226加至96孔板，培養(yǎng)24 h后，以單獨(dú)RPMI 8226、單獨(dú)γδ T細(xì)胞為對照組，每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后在酶標(biāo)儀上測490 nm波長吸光度(A)值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

細(xì)胞生長抑制率=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組)/A單獨(dú)靶細(xì)胞]×100%

1.2.3乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)法檢測擴(kuò)增后γδ T細(xì)胞殺傷RPMI 8226細(xì)胞活性

1.2.3.1γδ T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞的靜息與制備 收集培養(yǎng)至第7天的γδ T細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用無血清RPMI 1640洗滌2次，將細(xì)胞沉淀用含5% FBS、不含IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)液制備成合適濃度的細(xì)胞懸液，按每孔3×106個(gè)接種于24孔板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中靜息48 h；將靜息好的γδ T細(xì)胞按組收集到相應(yīng)的離心管中，1 500 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)，洗滌后，制備細(xì)胞懸液，備用。

1.2.3.2收集RPMI 8226靶細(xì)胞 收集生長狀態(tài)良好的RPMI 8226，用無血清RPMI 1640洗滌2次，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞沉淀用含5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液制備成1×105mL-1的細(xì)胞懸液，備用。

1.2.3.3細(xì)胞上板 按Cyto Tox96?非放射性細(xì)胞毒性試劑盒說明書，按效靶比(1∶1，5∶1和10∶1)將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞分別加入孔底。96孔板實(shí)驗(yàn)孔中(每個(gè)效靶比平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，設(shè)定好相應(yīng)的培養(yǎng)基背景對照孔、體積校正對照孔、靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔、靶細(xì)胞最大LDH釋放孔及效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔，每孔終體積為100 μL。用微量加樣器分別混勻各孔中細(xì)胞，1 800 r/min離心平板4 min，使靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞能充分接觸，將平板放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育195 min，向體積校正孔和靶細(xì)胞最大LDH釋放孔中加10 μL裂解液(×10)，加樣器輕輕吹勻，繼續(xù)孵育45 min。

1.2.3.4細(xì)胞毒活性測定 將上述孵育4 h的96孔板取出，1 800 r/min離心平板4 min，準(zhǔn)備相應(yīng)孔數(shù)的酶標(biāo)板，輕輕吸取上清50 μL，至酶標(biāo)板相應(yīng)孔中；檢測緩沖液配制底物，每孔分別加入50 μL至酶分析孔中，混勻，蓋好平板，室溫，避光孵育30 min，向每孔加入50 μL終止液，1 h內(nèi)測490 nm吸光度。計(jì)算每個(gè)效靶比產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比：

細(xì)胞毒性(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔-A靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔)/(A靶細(xì)胞最大釋放孔-A靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔)×100%

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞的凋亡情況 按效靶比1∶1和10∶1將γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，懸浮細(xì)胞于1 500 r/min下離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集1×106～5×106細(xì)胞，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidiumiodide, PI)，混勻避光，室溫反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5抗體封閉γδ T細(xì)胞殺傷RPMI 8226細(xì)胞活性測定 分別用含10 μg/mL的抗人γδ TCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人CD3 mAb和同型對照IgG mAb加入γδ T細(xì)胞中預(yù)孵育1 h后，收集離心、洗滌封閉后的γδ T細(xì)胞，重懸，備用。按效靶比1∶1和10∶1將γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞共培養(yǎng)，采用LDH法檢測各組γδ T細(xì)胞對MM細(xì)胞的殺傷活性。

2 結(jié) 果

2.1體外擴(kuò)增γδ T細(xì)胞的表型鑒定 流式檢測結(jié)果顯示，3名健康志愿者來源的PBMNC，刺激前的γδ T細(xì)胞比例為(2.01±0.56)%，加入Zol和IL-2聯(lián)合刺激7 d后，γδ T細(xì)胞比例為(87.53±0.78)%，γδ T細(xì)胞增殖了43.55倍(P<0.05，圖1)。

培養(yǎng)第7天與培養(yǎng)前比較，P<0.05.圖1 流式檢測體外誘導(dǎo)培養(yǎng)前后的細(xì)胞表型Fig 1 Phenotype of γδ T cells before and after culture

2.2CCK-8檢測擴(kuò)增后的γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞增殖的抑制作用 CCK-8檢測結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞按效靶比為1∶1，5∶1和10∶1加入時(shí)，γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的生長抑制率分別為(25.44±3.59)%，(44.57±4.3)%及(53.54±5.69)%，即在一定程度上，隨著效靶比的增大，抑制率隨之增加(P<0.05，圖2)。

與效靶比為1∶1組比較，☆：P<0.05.圖2 CCK-8檢測γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的抑制作用Fig 2 Inhibition of γδ T cells on myeloma cells detected by CCK-8

2.3LDH法檢測不同效靶比的γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷能力 LDH法檢測結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞與RPMI 8226按效靶比1∶1，5∶1和10∶1混合培養(yǎng)4 h后，γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率分別為(12.23±1.75)%，(31.11±6.12)%及(43.56±3.29)%,即殺傷率隨著效靶比的提高而增強(qiáng)(P<0.05，圖3)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞的凋亡情況 流式檢測結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞按效靶比為1∶1和10∶1混合培養(yǎng)24 h后，γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞凋亡率分別為(38.21±1.98)%和(68.18±2.16)%，凋亡率較RPMI 8226細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組明顯增高(P<0.05，圖4)。

與效靶比為1∶1組比較，☆：P<0.05.圖3 LDH法檢測γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷活性Fig 3 Cytotoxic activity of γδ T cells against myeloma cells detected by LDH assay

2.5不同抗體封閉γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞殺傷能力比較 LDH法檢測結(jié)果顯示，分別用抗人γδ TCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人CD3 mAb及同型對照抗IgG mAb封閉γδ T細(xì)胞后，按效靶比10∶1將γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞混合培養(yǎng)4 h，γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率分別為(21.54±1.52)%，(29.25±1.51)%，(32.68±0.78)%和(43.0±2.91)%(P<0.05，圖5)。

3 討 論

MM是異常漿細(xì)胞增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，傳統(tǒng)的化學(xué)療法以及近年來出現(xiàn)的多種新型藥物能夠緩解患者的癥狀，延長患者的生存期，但該病仍不可治愈。因此，尋找新的治療手段或聯(lián)合治療方案具有緊迫性。近年來，隨著對各種惡性實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤免疫治療研究的不斷深入，γδ T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療逐漸成為腫瘤生物免疫治療研究的熱點(diǎn)。

γδ T細(xì)胞是存在于外周血中具有廣泛抗腫瘤活性的一種特殊類型的淋巴免疫細(xì)胞。研究顯示，其對MM、淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤有明顯的殺傷能力，且可在體外條件下經(jīng)PBMNC大量擴(kuò)增獲得[7-9]。本研究在體外用Zol聯(lián)合IL-2刺激培養(yǎng)7 d后，可高效擴(kuò)增出較高純度的γδ T細(xì)胞。然后，將誘導(dǎo)培養(yǎng)的γδ T細(xì)胞與人MM細(xì)胞株RPMI 8226直接共同培養(yǎng)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞能抑制RPMI 8226細(xì)胞的生長，在一定程度上，隨著效靶比的增大，γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的抑制作用隨之增加。LDH方法檢測結(jié)果也顯示，γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷作用亦隨著效靶比的增大而增強(qiáng)。表明γδ T細(xì)胞可通過細(xì)胞毒作用直接殺傷RPMI 8226細(xì)胞，且殺傷能力與γδ T細(xì)胞的數(shù)量呈劑量依賴性。為了進(jìn)一步證實(shí)γδ T細(xì)胞是否也可以促進(jìn)RPMI 8226細(xì)胞的凋亡，筆者按效靶比1∶1和10∶1將γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞混合培養(yǎng)后，結(jié)果顯示，2組凋亡率明顯高于RPMI 8226單獨(dú)培養(yǎng)組，證實(shí)了γδ T細(xì)胞也可通過直接誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤增殖。

A：RPMI 8226單獨(dú)培養(yǎng)組；B：效靶比1∶1組；C：效靶比10∶1組. 效靶比1∶1組和效靶比10∶1組與RPMI 8226單獨(dú)培養(yǎng)組比較，P<0.05.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞的凋亡情況Fig 4 Apoptosis of RPMI 8226 cells induced by γδ T cells detected by flow cytometry

Anti-γδ TCR：抗人γδ TCR mAb封閉組；Anti-NKG2D：抗人NKG2D mAb封閉組；Anti-CD3：抗人CD3 mAb封閉組；Anti-IgG：同型對照抗IgG mAb 封閉組. 與同型對照Anti-IgG組比較，☆：P<0.05.圖5 LDH法檢測不同抗體封閉的γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷活性Fig 5 Cytotoxic activity of γδ T cells blocked by antibodies against myeloma cells detected by LDH assay

γδ T細(xì)胞同時(shí)具有T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特征，細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)γδ TCR受體和NK細(xì)胞重要的活化功能受體NKG2D[10]，這2種受體是γδ T細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用的主要受體。本研究中通過不同抗體封閉γδ T細(xì)胞，按效靶比10∶1時(shí)γδ T細(xì)胞與RPMI 8226細(xì)胞混合培養(yǎng)4 h后，抗γδ TCR抗體組和抗NKG2D抗體組抑制殺傷作用較為明顯，但仍保持部分殺傷活性，證明γδ T細(xì)胞對RPMI 8226細(xì)胞的殺傷作用主要與其細(xì)胞表面γδ TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的信號通路相關(guān)，同時(shí)也說明了γδ T細(xì)胞的識別和清除腫瘤細(xì)胞的作用是多途徑的。

總之，本研究建立的體外Zol+IL-2聯(lián)合刺激擴(kuò)增γδ T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法簡便可行，誘導(dǎo)效率高，并具有殺傷RPMI 8226細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能主要與其表面γδ TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的信號通路有關(guān)，為今后RPMI 8226的細(xì)胞免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究也存在一些不足，如沒有通過封閉γδ T細(xì)胞表面的其他受體及其分泌的細(xì)胞因子等途徑進(jìn)一步研究其殺傷RPMI 8226細(xì)胞的機(jī)制。