IL-38及其受體IL-36R mRNA在結(jié)直腸癌中的表達及意義

張 瑜，金建軍，田笑笑

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽 471003

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)生率和死亡率均高居第4位，僅次于肺癌、食管癌和胃癌[1]。大量證據(jù)證實，炎癥與CRC發(fā)病密切相關(guān)。常見的CRC相關(guān)炎癥因子包括：腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-33和IL-1等[2-5]。IL-38作為IL-1家族中的新成員，不僅與炎癥有關(guān)，而且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[6-7]。本研究采用實時熒光定量PCR檢測IL-38 mRNA在CRC及癌旁正常組織中的表達，同時檢測IL-38受體IL-36R mRNA的表達，并探討兩者的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1標本收集收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科CRC手術(shù)切除標本62例，男36例，女26例，年齡(55.9±12.7)歲(41～72歲)。高-中分化腺癌38例，低分化腺癌24例。臨床Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期19例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。所有診斷均經(jīng)病理報告確診。手術(shù)切除癌組織同時取其5 cm以外的癌旁正常組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2主要儀器及試劑NanoDrop One超微量紫外分光光度計(賽默飛公司，美國)，ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。TRNzol試劑、反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 試劑盒和SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京，中國)。

1.3總RNA提取及cDNA合成取凍存組織100 mg，加入TRIzol試劑1 ml，按照試劑操作說明書提取總RNA，超微量紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。取500 ng總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA于-20 ℃保存。

1.4熒光定量PCR采用SYBR Green染料法進行實時熒光定量PCR以檢測目的基因IL-38和IL-36R mRNA 在62例CRC和對應(yīng)癌旁正常組織中的表達。參照文獻[8]設(shè)計引物：IL-38：5′-TTATCCTTGTGGGCTCAGTT-3′(上游)，5′-AATCCGTTCCCTTGGCTTTT-3′(下游)；IL-36R：5′-GCTGGAGTGTCCACAGCATA-3′(上游)，5′-GCGATAAGCCCTCCTATCAA-3′(下游)。利用管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標化IL-38和IL-36R基因的表達。GAPDH引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′(上游)，5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′(下游)。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。反應(yīng)體系20 μl，含SYBR Green (2×) 10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，cDNA模板2.0 μl，無RNA酶水6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熔解曲線反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用2-ΔCt進行相對定量，Ct值為熒光信號達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct(目的基因)- Ct(管家基因)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，由于實時熒光定量PCR結(jié)果呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，IL-38和IL-36R mRNA相對含量組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，IL-38和IL-36R mRNA表達量之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-38及其受體IL-36RmRNA在CRC中的表達CRC組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA的相對含量中位數(shù)分別為0.68和0.33，明顯高于癌旁正常組織中的含量(0.23和0.07)。CRC組織與癌旁正常組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.944、-3.254，P=0.003、0.001)。

2.2IL-38和IL-36RmRNA的表達與CRC臨床特征的相關(guān)性IL-38和IL-36R mRNA在臨床Ⅲ～Ⅳ期CRC組織中的相對含量明顯高于臨床Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC組織中的相對含量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在不同分化程度CRC組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 IL-38及其受體IL-36R mRNA表達與CRC臨床特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation of the clinical features of colorectal cancer and the expressions of IL-38 and its receptor IL-36R mRNA

2.3IL-38和IL-36RmRNA相關(guān)性分析對CRC組織中IL-38和IL-36R mRNA表達量進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，IL-38與IL-36R mRNA表達量呈正相關(guān)(r=0.63，P<0.001)。

3 討論

多項研究表明，炎癥反應(yīng)參與CRC的發(fā)病，CRC圍手術(shù)期應(yīng)用腸道微生態(tài)制劑可減少腸道致病菌數(shù)量、降低術(shù)后炎癥反應(yīng)、抑制感染和降低并發(fā)癥的發(fā)生率[9]。這一過程涉及多個細胞因子，例如IL-1[2-5]。IL-1包括IL-1α和IL-1β兩個成員，過表達IL-1α和IL-1β均可促進CRC細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成等[10-11]。外源性給予IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)可抑制CRC細胞增殖、侵襲，并提高抗腫瘤藥物的輸送能力[12]。新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子IL-38屬于IL-1家族成員，位于人類第2號染色體長臂1區(qū)4帶1亞帶，長約7.8 kb，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。IL-38在序列上與IL-1Ra和IL-36受體拮抗劑(IL-36Ra)高度同源，可能具有類似的生物學(xué)功能。由此推測，IL-38可能介導(dǎo)了CRC的病理學(xué)進程。

本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測62例CRC和對應(yīng)癌旁正常組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)CRC組織中IL-38和IL-36R mRNA均顯著高表達，且在臨床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中表達升高更為明顯，提示IL-38和IL-36R參與CRC的病理進展，抑制IL-38和IL-36R的表達有望成為CRC新的治療途徑。此外，本研究還對IL-38和IL-36R mRNA的表達情況進行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈高度正相關(guān)，表明IL-38通過與其受體IL-36R結(jié)合傳遞信號介導(dǎo)CRC的發(fā)生。該研究結(jié)果與TAKADA等[6]的報道一致。TAKADA等[6]研究檢測了417例原發(fā)性肺腺癌中IL-38蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)IL-38呈高表達，高表達IL-38的患者腫瘤體積更大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多、臨床分期更晚、更易出現(xiàn)胸膜和血管侵襲、總生存期和無病生存期更短，且程序性細胞死亡配體1表達陽性。目前，IL-38介導(dǎo)CRC發(fā)病的分子機理尚不明確，推測可能影響了宿主免疫力和/或腫瘤微環(huán)境進而參與腫瘤的演變過程。

綜上所述，本研究首次報道了CRC組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA顯著高表達，兩者表達呈正相關(guān)，臨床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達更高，提示IL-38通過與其受體IL-36R結(jié)合參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展。未來有必要深入探討其分子機制，為尋求CRC治療新靶點奠定基礎(chǔ)。