腹瀉型腸易激綜合征患者腸黏膜相關(guān)菌群及其與癥狀的關(guān)系研究

王深皓， 鐘文婷， 魯曉嵐， 史海濤， 趙 剛， 張 靜， 靳耀峰, 王雙妮， 趙紅莉

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，陜西 西安 710004； 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院健苑五病區(qū); 3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞫鵁o(wú)器質(zhì)性病變的常見(jiàn)功能性腸病，是一組根據(jù)癥狀進(jìn)行歸類的臨床癥候群，其發(fā)病率較高，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為5%～15%[1],尤以歐美國(guó)家為著。近年來(lái)在我國(guó)人群中的調(diào)查顯示，其患病率約為5.7%，且其中22%的患者承認(rèn)曾因反復(fù)發(fā)作的癥狀就醫(yī)[2]。IBS患者以中青年居多，男女比例約為1∶2。由于IBS癥狀的反復(fù)發(fā)作，給患者的生活帶來(lái)了巨大的困擾，且經(jīng)濟(jì)上也面臨著沉重的負(fù)擔(dān)。根據(jù)其癥狀的特點(diǎn)，IBS可被分為交替型、腹瀉型(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)、便秘型、不確定型等4個(gè)類型，其中以腹瀉型最為常見(jiàn)[1]。IBS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為IBS的發(fā)生與結(jié)腸動(dòng)力障礙、內(nèi)臟高敏感性、腦-腸軸功能異常、炎癥、免疫因素、腸道菌群失調(diào)、飲食因素、腸內(nèi)分泌細(xì)胞等均有關(guān)[3]。但在近期，越來(lái)越多的研究認(rèn)為，腸道菌群與IBS的發(fā)病和進(jìn)展有著密切的關(guān)系，腸道菌群不僅可以通過(guò)激活腸道免疫系統(tǒng)，引起這兩種疾病的發(fā)生，還可以通過(guò)自身的特殊結(jié)構(gòu)、特殊的代謝產(chǎn)物及參與腦-腸軸調(diào)節(jié)引發(fā)相關(guān)的腸道癥狀[4-5]。腸道中的菌群主要由腸道菌群(即黏膜相關(guān)菌群)和腸腔菌群(即糞便菌群)組成，近年來(lái)通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)，二者之間在組成上有顯著性差異[6]，單純的研究糞便菌群并不能反映腸道微生態(tài)的變化。因此，研究腸黏膜相關(guān)菌群的變化必不可少。本文利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization, FISH)對(duì)IBS-D患者的腸黏膜相關(guān)菌群進(jìn)行定位定量研究，并探究腸黏膜相關(guān)菌群與癥狀之間的相關(guān)性，為發(fā)病機(jī)制和臨床用藥提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1納入及排除標(biāo)準(zhǔn)健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)任何腸道疾病，此次因偶感腹部不適或因某些原因要求腸鏡檢查進(jìn)行體檢的人群；(2)年齡 20～70 歲；(3)近2個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素及益生菌使用史。IBS-D組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IBS-D的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于IBS的診斷選擇羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。IBS-D是指至少25%的排便為松散(糊狀)糞或水樣糞，硬糞或干球糞小于25%。(3)年齡20～70歲，性別不限；(3)近1個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素及益生菌使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<20歲或>70歲者；(2)合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病的患者；(3)處于妊娠期、哺乳期及月經(jīng)期的女性；(4)有酒精、藥物濫用史者；(5)智力精神發(fā)育障礙，不能給予充分知情同意者；(6)研究人員認(rèn)為存在有其他上述未提及但不適合入選本研究因素的患者。

1.2人口學(xué)資料該研究通過(guò)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受檢者均簽署知情同意書(shū)。選取了符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的2016年6月至2016年10月于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的IBS-D患者20例及健康體檢者16名。具體情況見(jiàn)表1。

表1 人口學(xué)資料Tab 1 Demographic data

1.3IBS-D嚴(yán)重程度評(píng)分對(duì)于IBS癥狀嚴(yán)重程度的評(píng)估采用 FRANCIS等[8]于1997年設(shè)計(jì)的IBS嚴(yán)重程度評(píng)分量表。該量表從腹痛程度、腹痛發(fā)作次數(shù)、當(dāng)天腹脹程度、對(duì)大便的滿意情況、癥狀對(duì)生活的干擾程度等5個(gè)方面分別對(duì)患者的IBS-D癥狀加以量化評(píng)價(jià)。每個(gè)方面的滿分均為100分，共有5個(gè)選項(xiàng)，按照程度輕重每個(gè)選項(xiàng)依次遞進(jìn)20分，最后計(jì)算該問(wèn)卷的總分，以此來(lái)評(píng)估IBS-D患者的嚴(yán)重程度。評(píng)分情況見(jiàn)表2。

表2 IBS-D嚴(yán)重程度評(píng)分Tab 2 IBS-D severity score

1.4標(biāo)本的收集與制備研究對(duì)象于結(jié)腸鏡檢查前一晚開(kāi)始禁食，并服用聚乙二醇電解質(zhì)散2盒進(jìn)行清腸。檢查時(shí)，使用pentax腸鏡于直腸-乙狀結(jié)腸交界處用活檢鉗鉗取黏膜組織3塊，放入模具盒內(nèi)用OCT包埋劑進(jìn)行包埋，并迅速放入液氮罐中進(jìn)行冷凍，隨后放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存。分析時(shí)，將冰凍的組織塊制成6 μm厚的冰凍切片。

1.5熒光原位雜交步驟將冰凍切片復(fù)溫后，PBS、1 g/L DEPC水各洗2次，0.2 mol/L HCl 、10 g/L 溶菌酶分別消化20 min、15 min，隨后1 g/L DEPC水浸泡10 min，滴加封閉液后于55 ℃封閉2 h。封閉結(jié)束后，將稀釋好的濃度為0.4 μmol/L的探針于37 ℃平衡后滴加于組織之上，蓋上蓋玻片，橡膠膠水封片，38 ℃避光雜交16～18 h。雜交后 SSC 洗4次，每次15 min，梯度酒精脫水后滴加20 μl DAPI，于暗處?kù)o置15 min 后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。目的細(xì)菌探針由廣州外顯子生物公司合成，具體核酸序列見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)使用各探針特點(diǎn)Tab 3 The characteristics of the probes used in the experiments

1.6切片的觀察計(jì)數(shù)在熒光顯微鏡下，計(jì)數(shù)細(xì)菌總數(shù)時(shí)，每塊組織沿上皮層隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)高倍鏡視野(每個(gè)高倍鏡視野的長(zhǎng)度為200 μm)，取其中的中位數(shù)進(jìn)行比較，并記為細(xì)菌計(jì)數(shù)/200 μm。

2 結(jié)果

2.1黏膜細(xì)菌的定位情況IBS-D患者腸黏膜中的細(xì)菌主要定植在黏膜表面及與之相鄰的黏液層中，僅個(gè)別患者有極少量的細(xì)菌定植在黏膜深處的固有層中(見(jiàn)圖1)。

2.2不同組間的黏膜細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果與健康對(duì)照組相比，IBS-D患者腸黏膜相關(guān)菌群中的細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、擬桿菌和梭菌屬數(shù)目明顯增多(P<0.05)，雙歧桿菌數(shù)目明顯減少(P<0.05)，但二者在乳酸菌的數(shù)量上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4、圖2)。

2.3不同組間的固有層細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果與健康對(duì)照組相比，IBS-D患者固有層中細(xì)菌差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表5、圖3)。

注：a～c分別為總細(xì)菌在IBS-D患者腸黏膜中、大腸桿菌在IBS-D患者腸黏膜中及大腸桿菌在腸道黏膜固有層中的定植情況。

組別 例數(shù)總細(xì)菌大腸桿菌梭菌屬擬桿菌乳酸菌雙歧桿菌健康對(duì)照組 16 45(21～70)7.5(3～10)6.5(2～19)9(2～18)11.5(4～49)17.5(5～27)IBS-D組 20 63(28～198) 11.5(4～43)23.0(3～87)14(1～50)10.5(4～60)8.0(4～51)P值0.0010.0150.0010.0400.8230.031

表5 固有層中的細(xì)菌總數(shù)[中位數(shù)(范圍)，細(xì)菌個(gè)數(shù)/2×104 μm2]Tab 5 The total number of bacteria in the lamina propria[median (range), bacteria /2×104 μm2]

2.4菌群與IBS癥狀之間的關(guān)系除腹痛程度評(píng)分與大腸桿菌數(shù)量、排便次數(shù)及乳酸菌的數(shù)量、對(duì)大便的滿意情況與雙歧桿菌之間有顯著相關(guān)性(P<0.05)，其他細(xì)菌的數(shù)量與其他IBS-D癥狀之間均無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)表6)。

注：圖中矩形盒兩端邊的位置分別對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的上下四分位數(shù)(Q1和Q3)，內(nèi)部的中位線代表數(shù)據(jù)的中位數(shù)。

3 討論

人體腸道微生態(tài)中含大量的微生物，其重量重達(dá)1.5 kg，菌群的細(xì)胞數(shù)量則占據(jù)著人體細(xì)胞組成的90%，編碼超過(guò)人體基因組100 倍的基因信息。腸道微生物對(duì)人體健康有巨大作用，然而我們目前仍知之甚少。從功能的角度，腸道菌群的地位與作用幾乎相當(dāng)于一個(gè)后天獲得的“器官”，對(duì)人體健康和正常的生理代謝有重要作用[8]。

近年來(lái)，有研究表明，IBS的發(fā)生與腸道菌群之間的關(guān)系密不可分，腸道菌群的改變可能是 IBS潛在的發(fā)病機(jī)制[3-5]。有實(shí)驗(yàn)[9]表明，將IBS患者的糞便移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)后，無(wú)菌小鼠的免疫系統(tǒng)被激活，腸道的滲透性和分泌物大幅增加，腸道內(nèi)出現(xiàn)了低級(jí)別的炎癥。目前，腸道中的菌群主要被分為腸道菌群(即黏膜相關(guān)菌群)和腸腔菌群(即糞便菌群)兩種，由于糞便菌群易于取得，所以早先的研究多是針對(duì)于糞便菌群的。但近年來(lái)有研究指出，糞便菌群和黏膜相關(guān)菌群的數(shù)量和分布上均有顯著性差異，糞便菌群無(wú)法全面反映腸道微生態(tài)情況[6]，且糞便菌群還有著送檢過(guò)程中易被干擾的缺點(diǎn)，因此通過(guò)研究腸黏膜相關(guān)菌群來(lái)探討腸道微生態(tài)的變化至關(guān)重要。乙狀結(jié)腸是腸道中細(xì)菌數(shù)最多的部位[10]，因此本研究選用直乙交界處的黏膜對(duì)所有菌群、大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌這6種腸道中主要分布的細(xì)菌數(shù)量及分布進(jìn)行研究，并探究菌群數(shù)量與IBS-D癥狀之間的相關(guān)關(guān)系。

圖3 各組間固有層中的細(xì)菌數(shù)量上的差異[中位數(shù)(范圍)，細(xì)菌個(gè)數(shù)/2×104μm2] Fig 3 The number of bacteria in the lamina propria between two groups[median (range), bacteria /2×104μm2]

組別腹痛程度評(píng)分腹痛發(fā)作次數(shù)評(píng)分當(dāng)天腹脹程度評(píng)分對(duì)大便的滿意情況評(píng)分癥狀對(duì)生活干擾程度評(píng)分嚴(yán)重程度總分近1個(gè)月內(nèi)每日大便最多次數(shù)近1個(gè)月內(nèi)每日大便最少次數(shù)總細(xì)菌相關(guān)系數(shù)-0.3700.0850.020-0.160-0.015-0.296-0.296-0.074P值0.1080.7220.9320.5010.9490.2610.2050.757大腸桿菌相關(guān)系數(shù)-0.7110.3070.115-0.0790.247-0.0010.1690.058P值<0.0010.1870.6290.7400.2940.9990.4770.807梭菌屬 相關(guān)系數(shù)0.0980.286-0.351-0.1180.003-0.083-0.440-0.408P值0.6810.2220.1290.6200.9890.7280.0520.074擬桿菌相關(guān)系數(shù)0.0670.1010.0820.0650.1760.231-0.291-0.079P值0.7770.6700.7310.7850.4580.3280.213-0.741乳酸菌相關(guān)系數(shù)-0.1900.0980.124-0.193-0.364-0.254-0.545-0.241P值0.4230.6820.6030.4140.1140.2790.0130.307雙歧桿菌相關(guān)系數(shù)0.173-0.0700.079-0.464-0.440-0.272-0.251-0.260P值0.4660.7680.7400.0390.0520.2470.2850.269

本研究主要發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)：(1)IBS-D患者腸黏膜中的細(xì)菌主要定植在黏膜表面及與之相鄰的黏液層中，僅有極少量定植在黏膜深處的固有層中，且定植在固有層的細(xì)菌數(shù)目與健康對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異，這也說(shuō)明固有層中的細(xì)菌可能為取材時(shí)造成的黏膜破損所致。(2)與健康對(duì)照組相比，IBS-D患者腸黏膜相關(guān)菌群中的細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、擬桿菌和梭菌屬數(shù)量明顯增多，雙歧桿菌數(shù)量明顯減少，這與以往的多項(xiàng)研究結(jié)果相符[4，12-14]。雖然IBS-D患者的腸道黏膜未出現(xiàn)缺損，但是由于腸道屏障受到腸道微生態(tài)紊亂和腸道動(dòng)力改變等因素的影響，使更多細(xì)菌有了定植的機(jī)會(huì)，從而導(dǎo)致所有菌群數(shù)量明顯多于健康對(duì)照組。推斷可能是IBS患者中雙歧桿菌數(shù)量減少，造成了黏膜屏障功能減弱，從而導(dǎo)致有害微生物的大量定植，產(chǎn)生了腸道微生態(tài)的紊亂。然而某些研究結(jié)果[15-16]則與本研究有顯著性差異。例如，郭文濤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D患者腸黏膜中的梭菌屬和擬桿菌屬數(shù)量均較健康對(duì)照者明顯減少，而CARROLL等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D患者的大腸桿菌、梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量與健康對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。推斷造成這一差異的原因有以下幾點(diǎn)：(1)各地在人種、飲食、風(fēng)俗習(xí)慣上的差異造成了腸道微生態(tài)的不同。(2)本研究中所謂的健康對(duì)照組人群是因偶感腹部不適和/或消化道腫瘤家族史要求進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的人群，與完全的健康人群相比，可能有微小的差異。(3)IBS根據(jù)癥狀可分為腹瀉型、便秘型、交替型等3種，由于癥狀的不同，菌群可能也存在著部分差異，而部分研究未將IBS患者分成亞組進(jìn)行比較，也可能造成了差異。(4)腹痛程度評(píng)分與大腸桿菌數(shù)量、排便次數(shù)與乳酸菌的數(shù)量、對(duì)大便的滿意情況與雙歧桿菌之間均有顯著性差異，這也為臨床上對(duì)腹瀉患者服用雙歧桿菌和乳酸菌進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)治療，改善相關(guān)癥狀提供了理論依據(jù)。首先在IBS-D中，我們需要注意的是，并不是所有的益生菌菌株都可以緩解部分或全部的IBS-D相關(guān)癥狀，如腹痛、腹脹、腹瀉等，如國(guó)外的研究[19]就指出藍(lán)細(xì)菌門與腹脹癥狀相關(guān)，但腹痛等癥狀卻與變形菌門關(guān)系更為密切。本研究中，乳酸菌的數(shù)量與排便次數(shù)密切相關(guān)，而雙歧桿菌的數(shù)量則與對(duì)大便的滿意情況密切相關(guān)，這表明在針對(duì)排便次數(shù)過(guò)多這一癥狀時(shí)，我們應(yīng)該有針對(duì)性地選用乳酸菌進(jìn)行治療，而針對(duì)大便稀溏這一癥狀時(shí)，則應(yīng)該有針對(duì)性地選用雙歧桿菌緩解癥狀。這也與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的類似研究有相似之處[4, 19-20]。此外，JIZHONG等[21]研究還認(rèn)為，大腸桿菌與腹痛和腹脹等癥狀呈密切正相關(guān)關(guān)系。其機(jī)制可能是通過(guò)影響Toll 樣受體和細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致 IBS 低級(jí)別炎癥和腸道免疫系統(tǒng)的激活，而免疫系統(tǒng)的激活又導(dǎo)致了內(nèi)臟的高敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致腹痛、腹脹等癥狀的發(fā)生。而在本研究中，大腸桿菌的數(shù)量則與腹痛程度之間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系?？紤]出現(xiàn)差異的原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)各地人群在飲食、風(fēng)俗習(xí)慣上的差異可能造成了研究結(jié)果的不同。(2)本研究中大腸桿菌是在屬的級(jí)別上進(jìn)行研究的，而大腸桿菌屬中包括各種不同的種類，不同種類的大腸桿菌可能具有不同的作用，如大腸桿菌中的Nissle 1 917種，可通過(guò)產(chǎn)生一種名為C12AsnGABAOH的脂肽而抑制感覺(jué)神經(jīng)元的激活，從而降低與IBS相關(guān)的內(nèi)臟疼痛[22]。因而，有必要在種的級(jí)別上對(duì)大腸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

總之，在IBS-D患者中，雙歧桿菌等益生菌的減少以及所謂有害細(xì)菌如梭菌屬、擬桿菌和條件致病菌大腸桿菌的增加，提示它們可能參與IBS-D的發(fā)病機(jī)制，并且與癥狀的維持有著密切的關(guān)系。這些結(jié)果均為IBS-D的發(fā)病機(jī)制及治療研究提供重要的理論基礎(chǔ)。