Nav1.7離子通道作為疼痛的藥物靶標(biāo)：向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)邁進(jìn)

劉雅梅，劉玉霜，張精亮，王靜，李敏，陳付學(xué)，楊洋③?

①上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；②普渡大學(xué) 藥學(xué)院藥物化學(xué)及分子藥理系，西拉法葉市，印第安納州47907，美國(guó)；③耶魯大學(xué) 醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)系/神經(jīng)科學(xué)與再生研究中心，紐黑文市，康乃狄格州 06510，美國(guó)

1 Nav1.7 作為治療靶標(biāo)

電壓門控鈉通道1.7(Nav1.7)被廣泛認(rèn)為是一種“疼痛通道”，遺傳學(xué)、細(xì)胞及動(dòng)物層面的研究表明Nav1.7在人類疼痛傳遞中不可或缺。Nav1.7表達(dá)于外周背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元及內(nèi)臟感覺神經(jīng)元的痛覺受體，也表達(dá)于交感神經(jīng)元、肌間神經(jīng)元和嗅覺神經(jīng)元[1-2]。Nav1.7在解剖學(xué)上分布于神經(jīng)元胞體、軸突和傳入神經(jīng)的外周及中樞神經(jīng)末梢。Nav1.7具有閾值通道的功能，已經(jīng)確認(rèn)Nav1.7與人類疼痛突變的單基因連鎖失調(diào)及嗅覺喪失有關(guān)，并且此通道在疼痛和嗅覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮核心作用[2]。

有研究表明Nav1.7作為電流閾值通道，由Nav1.7產(chǎn)生的電流可降低亞閾值，從而增加神經(jīng)元達(dá)到閾值的概率[3-4]。將具有天然生物物理特性的人類Nav1.7電流注入培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，采用膜片鉗記錄，結(jié)果顯示Nav1.7電導(dǎo)水平與DRG神經(jīng)元的電流閾值間線性相關(guān)[5]。另外，發(fā)現(xiàn)Nav1.7選擇性阻斷劑可以增加人類DRG感覺神經(jīng)元閾值并減少嚙齒類動(dòng)物外周和中樞末梢神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[6]。這些證據(jù)表明Nav1.7作為外周神經(jīng)元的閾值通道發(fā)揮功能。

動(dòng)物研究中，軟組織炎癥及糖尿病發(fā)生后DRG感覺神經(jīng)元Nav1.7表達(dá)水平增加[7-8]。利用病毒敲低(knock-down) Nav1.7蛋白表達(dá)水平可以改善小鼠炎癥引起的疼痛和大鼠糖尿病疼痛性神經(jīng)病變[8]。此外，在各種動(dòng)物損傷模型中完全或條件性敲除(knockout)Nav1.7可以升高疼痛閾值[9-11]。這些發(fā)現(xiàn)提示Nav1.7可作為疼痛治療的靶點(diǎn)。

2 人類驗(yàn)證

在遺傳性疼痛患者中，Nav1.7的編碼基因SCN9A的突變遵循孟德爾遺傳規(guī)律，并且有證據(jù)表明Nav1.7在人類遺傳性疼痛信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，并確認(rèn)該通道為疼痛治療的靶標(biāo)[2]。在患有遺傳性紅斑性肢痛癥(IEM)和陣發(fā)性劇痛癥(PEPD)[12]的患者中發(fā)現(xiàn)了SCN9A獲得性功能單基因錯(cuò)義突變。相比之下，Nav1.7相關(guān)的先天性不敏感(無(wú)差別)疼痛(CIP)是由SCN9A雙等位基因引起的(隱性)功能性缺失突變導(dǎo)致。很多與Nav1.7有關(guān)的CIP病人都顯著表現(xiàn)出感覺喪失，但是僅限于疼痛感和嗅覺的缺失，沒有自主神經(jīng)缺陷[13-14]。這些研究表明Nav1.7基因突變是導(dǎo)致人類異常疼痛的主要因素。

IEM癥狀在臨床上表現(xiàn)為手腳灼燒狀的疼痛且伴有紅斑和輕度腫脹，通常是由溫度輕微上升或運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)，大多可通過(guò)冷卻患肢而得以緩解。最近有研究針對(duì)4種Nav1.7突變(S241T、V400M、I848T和F1449V)、來(lái)自4個(gè)不同家庭的IEM病人進(jìn)行了研究。這些患者顯示出一系列癥狀和觸發(fā)條件，一些IEM家族成員稱冷卻能減輕痛苦，但其他家庭成員說(shuō)它喚起疼痛[15]。

嚴(yán)重的直腸周圍疼痛PEPD癥狀始于嬰兒期，常伴有排便、刺激直腸或會(huì)陰部位引起皮膚潮紅[16]的癥狀。例如：一個(gè)患有典型PEPD的嬰兒疼痛發(fā)作時(shí)伴隨皮膚潮紅，軀干的左右側(cè)疼痛交替，其原因?yàn)镾CN9A的第26外顯子突變破壞了Nav1.7通道的快速失活過(guò)程，導(dǎo)致DRG和交感神經(jīng)過(guò)度興奮[17]。PEPD病人一般使用抗驚厥藥物卡馬西平治療后，疼痛能夠有所減輕[16]。利用隱性遺傳的功能缺失突變，研究者發(fā)現(xiàn)了Nav1.7與CIP和嗅覺喪失的關(guān)系[13-14,18]。與Nav1.7相關(guān)的CIP病人通常不會(huì)表現(xiàn)出除嗅覺外的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、交感神經(jīng)或胃腸道缺陷，其感官感覺相對(duì)完整[13]。利用電壓鉗可以發(fā)現(xiàn)突變導(dǎo)致離子通道的激活以及失活的性質(zhì)如何改變，而電流鉗技術(shù)則可以在細(xì)胞水平上研究通道的功能。這些研究提供了這些疾病中受損感受器興奮性的病理學(xué)基礎(chǔ)，從而建立起突變和疼痛之間的聯(lián)系。電流鉗記錄顯示出Nav1.7中的突變賦予通道多重功能屬性。當(dāng)獲得性功能突變的Nav1.7通道在與疼痛相關(guān)的細(xì)胞如DRG感覺神經(jīng)元中表達(dá)時(shí)，這些神經(jīng)元興奮性增加，其中包括降低電流閾值和增加放電頻率[2](圖1)。

圖1 表達(dá)Nav1.7-S241T突變的神經(jīng)元比表達(dá)野生型(Wild Type, WT)Nav1.7的神經(jīng)元興奮性高。(a、b)注入400 pA電流，表達(dá)WT通道(a)或S241T突變通道(b)的代表性DRG神經(jīng)元在1 s去極化的響應(yīng)；(c)比較表達(dá)WT和S241T突變通道的DRG神經(jīng)元之間的動(dòng)作電位(APs)的平均數(shù)。在125～500 pA電流注入范圍內(nèi)，表達(dá)WT通道與S241T突變通道的DRG神經(jīng)元顯著不同；(d)比較表達(dá)WT和S241T突變通道的DRG神經(jīng)元的當(dāng)前閾值，S241T通道的電流閾值顯著降低

除了外周神經(jīng)系統(tǒng)，Nav1.7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠皮層和海馬神經(jīng)元中可檢測(cè)到低表達(dá)水平的Nav1.7 mRNA[19-20]，提示Nav1.7可能與皮層和海馬密切相關(guān)的癲癇[21]以及自閉癥[19]有關(guān)。雖然Nav1.7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用有待進(jìn)一步研究，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Nav1.7阻斷劑的副作用不容忽視。

3 靶向離子通道的精準(zhǔn)醫(yī)療

在過(guò)去幾年，根據(jù)患者的遺傳背景獲得個(gè)性化藥物治療得到越來(lái)越多的關(guān)注，例如在治療不同突變導(dǎo)致癌癥的患者方面已取得顯著進(jìn)展。因此，量身定制藥物療法的應(yīng)用已迅速擴(kuò)大到通道療法。由于缺乏明確目標(biāo)，動(dòng)物模型可預(yù)測(cè)性較低，以及體外試驗(yàn)缺乏預(yù)測(cè)性，精準(zhǔn)治療攜帶基因突變的疼痛綜合征患者的理念仍處于起步階段，而Nav1.7突變有望開發(fā)成為下一代量身定制的藥物治療。了解這些突變與疼痛綜合征相關(guān)性變得至關(guān)重要，因?yàn)閿y帶不同突變體的患者對(duì)于止痛藥的反應(yīng)是不同的。目前，嚴(yán)重的疼痛綜合征患者選擇止痛藥主要是基于試錯(cuò)法[22]。當(dāng)前研究者一直在努力解決止痛藥量身定制問(wèn)題，已有的研究表明，可以通過(guò)體外測(cè)定來(lái)預(yù)測(cè)藥物對(duì)于Nav1.7突變的作用[23]。特別是在臨床中首次證明，通過(guò)體外測(cè)定的藥物，可以有效幫助攜帶特定Nav1.7突變的患者緩解疼痛[24]。

早期的精準(zhǔn)方法包括以下幾個(gè)步驟：①結(jié)構(gòu)建模/多態(tài)建模評(píng)估在3D折疊通道結(jié)構(gòu)中致病突變的空間位置；②熱動(dòng)力學(xué)突變循環(huán)分析評(píng)估突變體間的能量耦合；③電壓鉗了解突變通道的生物物理特性和藥物對(duì)突變通道生物物理性質(zhì)的影響；④電流鉗評(píng)估藥物對(duì)感覺神經(jīng)元放電特性的影響；⑤多電極陣列(MEA)記錄，以相對(duì)高通量的方式評(píng)估完整的感覺神經(jīng)元對(duì)藥物的反應(yīng)。

(1)結(jié)構(gòu)建模/多狀態(tài)建模，評(píng)估3D通道結(jié)構(gòu)中致病突變的空間位置

哺乳動(dòng)物Nav1.7通道形成孔區(qū)的 α-亞基，由4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(I～I(xiàn)V)連接3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)(L1～L3)構(gòu)成。每個(gè)結(jié)構(gòu)域有6個(gè)跨膜螺旋(S1～S6)。S1～S4螺旋形成電壓傳感器，而S5和S6螺旋連同S5和S6之間的P環(huán)形成離子傳導(dǎo)通路或孔區(qū)[25](圖2(a))。隨著確定電壓門控鉀通道和之后的細(xì)菌鈉通道[26-27]晶體結(jié)構(gòu)數(shù)量的增加，人類Nav1.7的建模以及致病突變位置和方向的確定變得更加可行。

因氨基酸的變化而產(chǎn)生新的藥物結(jié)合口袋，或者可能變構(gòu)地影響藥物作用。由于離子通道結(jié)構(gòu)決定功能，不同突變的接近度能夠預(yù)測(cè)它們以類似的方式發(fā)揮功能。第一步用結(jié)構(gòu)建模來(lái)確定通道三維結(jié)構(gòu)中突變的位置(圖2(b))，基于細(xì)菌鈉通道結(jié)構(gòu)[27]，構(gòu)建人源Nav1.7 3D結(jié)構(gòu)模型[23]；第二步用CBZ反應(yīng)性突變(V400M)[28]的優(yōu)勢(shì)作為“種子”去探索新的突變；最終發(fā)現(xiàn)了一個(gè)距離V400M突變有159個(gè)氨基酸的新的突變(S241T)，它在蛋白的三維結(jié)構(gòu)上與V400M位置相近。新型突變(S241T)與藥物反應(yīng)性突變(V400M)之間的相似性，暗示出可能具有類似的藥物反應(yīng)。

此外，離子通道在門控過(guò)程中構(gòu)象顯著變化，也有助于理解不同通道門控殘基間的相似度。為此，使用多態(tài)建模策略試圖對(duì)Kv10.2進(jìn)行多態(tài)建模[29]，然后將其應(yīng)用于電壓門控鈉通道來(lái)觀測(cè)突變及其相互作用。

最近，隨著冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)突破性技術(shù)的發(fā)展[30]，在其門控過(guò)程中捕獲不同構(gòu)象的離子逐漸變得可行。事實(shí)上，最近發(fā)布了幾個(gè)新的電壓門控鈉通道結(jié)構(gòu)，例如顏寧教授課題組關(guān)于Nav1.4結(jié)構(gòu)的報(bào)道[31-32]。這樣，可以從結(jié)構(gòu)角度理解引起疾病的突變的位置和功能。使用冷凍電鏡可以在一個(gè)或幾個(gè)有限的構(gòu)象中揭示電壓門控鈉通道的結(jié)構(gòu)。

(2)熱動(dòng)力學(xué)突變循環(huán)(周期)分析，評(píng)估突變體間的能量耦合

運(yùn)用熱動(dòng)力學(xué)突變循環(huán)(周期)分析時(shí)，需要構(gòu)建一個(gè)同時(shí)包含這兩個(gè)突變的新通道，研究時(shí)這個(gè)新通道必須與兩個(gè)單一突變構(gòu)建的通道同時(shí)進(jìn)行，來(lái)評(píng)估這個(gè)包含雙突變的新通道是否比單突變通道發(fā)生更顯著性變化。如果兩個(gè)突變分別位于通道的不同區(qū)域，則有助于理解用熱動(dòng)力學(xué)突變周期分析來(lái)檢測(cè)這兩個(gè)突變能否發(fā)生能量耦合。使用這種方法，發(fā)現(xiàn)S241T和V400M能夠發(fā)生能量耦合，可以說(shuō)明，在通道門控中S241T和V400M作為一個(gè)單元來(lái)起作用，因此可能以類似的方式影響藥物的結(jié)合[23]。

(3)電壓鉗分析突變通道的生物物理特性及藥物對(duì)突變通道的生物物理特性的作用

了解一種特定藥物對(duì)其靶標(biāo)的作用是至關(guān)重要的。CBZ可引起經(jīng)典鈉通道抑制，而對(duì)于Nav1.7-V400M突變通道，CBZ具有改變通道激活曲線，導(dǎo)致通道激活去極化并向野生型(WT)值轉(zhuǎn)變[28]的特性。重要的是，這個(gè)新作用機(jī)制可以通過(guò)低濃度的CBZ(30 μM)在不影響WT通道的情況下實(shí)現(xiàn)[28]。這表明CBZ對(duì)Nav1.7通道具有突變體特異性。

為了預(yù)測(cè)其他新型突變的藥物反應(yīng)性，并測(cè)試CBZ是否有類似的作用機(jī)制，電壓鉗是一種有效的方式。事實(shí)上，CBZ對(duì)新突變(S241T)同樣能表現(xiàn)出類似的通道激活向去極化轉(zhuǎn)變，支持這些突變體可能的藥物反應(yīng)(圖2(c))。雖然電壓鉗分析在傳統(tǒng)上是一個(gè)耗時(shí)的方法，但這是一種高精度測(cè)定方法，可能有助于個(gè)性化醫(yī)學(xué)研究中突變通道的生物物理特性的研究。

圖2 體外結(jié)構(gòu)建模和電壓鉗測(cè)定預(yù)測(cè)S241T是CBZ-反應(yīng)性突變。(a)人Nav1.7通道S241T、V400M和F1449V突變拓?fù)鋵W(xué)的示意圖；(b)Nav1.7通道跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)模型的細(xì)胞質(zhì)視圖，右側(cè)放大的正方形區(qū)域包含S241、V400和F1449殘基；(c)繪制用二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組或卡馬西平(CBZ，30 μmol/L)處理的S241T突變通道依賴于電壓活化的平均數(shù)，并擬合Boltzmann方程。Nav1.7野生型通道的激活電壓依賴性用灰色顯示；縮寫VSD指的是電壓敏感區(qū)域

(4)電流鉗評(píng)估藥物對(duì)感覺神經(jīng)元放電特性的影響

電流鉗技術(shù)可了解不同致病突變對(duì)神經(jīng)元活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)Nav1.7-S241T突變降低了DRG感覺神經(jīng)元的電流閾值并引起神經(jīng)元放電頻率增加[23]。在CBZ存在下，DRG感覺神經(jīng)元(表達(dá)Nav1.7-S241T突變)電流閾值增加到接近WT的水平并且放電頻率減少[23](圖3(a)～(d))。電流鉗和電壓鉗一樣是一種相對(duì)低通量的分析方法，需要非常熟練的技術(shù)人員去操作完成。

(5)MEA記錄評(píng)估藥物引起完整神經(jīng)元的反應(yīng)

除電流鉗以外，MEA是一種很好的相對(duì)高通量的手段用于研究完整神經(jīng)元的放電特性[24]。MEA是一種胞外記錄方式，可在正常的神經(jīng)元培養(yǎng)液中記錄到神經(jīng)元的放電活動(dòng)，通過(guò)記錄溫度變化對(duì)神經(jīng)元放電的影響，準(zhǔn)確判斷出溫度對(duì)IEM患者疼痛神經(jīng)元放電的影響。研究發(fā)現(xiàn)，DRG感覺神經(jīng)元的Nav1.7-S241T突變放電頻率更高且隨溫度的升高電極活性更高。CBZ能夠顯著降低表達(dá)Nav1.7-S241T突變的神經(jīng)元放電頻率和放電的神經(jīng)元數(shù)量(圖3(e)～(h))。最近，研究發(fā)現(xiàn)另一個(gè)突變(I234T)導(dǎo)致神經(jīng)元的放電增加也可以被CBZ以類似的方式抑制其活性[33]。這表明本方法可以推廣到更多的突變體和患者中。因此，MEA測(cè)定方法可以用于研究DRG感覺神經(jīng)元的藥物反應(yīng)。并且，研究還發(fā)現(xiàn)CBZ的經(jīng)典依賴性抑制只出現(xiàn)在野生的Nav1.7中，而不是突變的Nav1.7通道(I234T突變)[33]，進(jìn)一步支持了CBZ是通過(guò)一種新的作用機(jī)制來(lái)影響突變體Nav1.7通道。

通過(guò)以上5個(gè)步驟可以建立相對(duì)穩(wěn)定的體外試驗(yàn)來(lái)研究不同Nav1.7突變對(duì)藥物的敏感性，并可作為發(fā)展臨床相關(guān)體外試驗(yàn)指導(dǎo)藥物選擇的平臺(tái)。不可否認(rèn)，在臨床前完成所有這5個(gè)步驟可能并不實(shí)際。根據(jù)最近的研究[33]，建議用簡(jiǎn)化的三步驗(yàn)證(結(jié)構(gòu)建模、生物物理驗(yàn)證和MEA試驗(yàn))，同樣能為不同突變的藥物反應(yīng)提供良好的指標(biāo)[33]。

圖3 體外電流鉗和多電極陣列測(cè)定預(yù)測(cè)S241T為卡馬西平(CBZ)敏感性突變。(a、b)用二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組(a)或30 μmol/L CBZ(b)處理DRG神經(jīng)元表達(dá)S241T突變體通道的亞閾值和超閾值反應(yīng)。(c、d)注入400 pA電流，用DMSO(c)或CBZ(d)處理的表達(dá)S241T突變通道的代表性DRG神經(jīng)元對(duì)1 s去極化電流的反應(yīng)。(e～h)在33 ℃和40 ℃(e、f)CBZ處理前記錄表達(dá)Nav1.7S241T的DRG神經(jīng)元的多電極陣列的熱圖。每個(gè)電極的放電頻率為彩色編碼，黃色/紅色代表放電頻率高，藍(lán)/黑色代表放電頻率低。每個(gè)圓圈對(duì)應(yīng)于8×8電極陣列內(nèi)的電極。在30 μmol/L CBZ處理(g、h)后記錄相同多電極陣列的熱圖。在33℃和40 ℃時(shí)，活性電極的數(shù)量和神經(jīng)元的發(fā)射頻率均顯著降低。白色箭頭指CBZ治療后的沉默神經(jīng)元。在圖(e～h)中代表性神經(jīng)元用黃色箭頭表示

為了檢驗(yàn)體外預(yù)測(cè)是否能被應(yīng)用到臨床上，在美國(guó)范圍內(nèi)對(duì)攜帶有Nav1.7-S241T突變的IEM患者進(jìn)行了調(diào)查，并在一個(gè)家族(母子)中發(fā)現(xiàn)了兩名攜帶S241T突變的患者。為此設(shè)計(jì)一項(xiàng)安慰劑控制雙盲的隨機(jī)臨床試驗(yàn)，以評(píng)估他們對(duì)CBZ的藥物反應(yīng)。本試驗(yàn)中，在CBZ用藥期間每個(gè)病人的疼痛時(shí)間、發(fā)作持續(xù)時(shí)間和每夜疼痛覺醒次數(shù)都明顯減少[24]。值得注意的是，利用功能磁共振成像(fMRI)發(fā)現(xiàn)CBZ治療改變大腦從評(píng)估/情感決策的區(qū)域到軀體感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)的活動(dòng)[24]。持續(xù)的疼痛使大腦活動(dòng)從感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)移到情緒決策回路，而CBZ能將大腦活動(dòng)切換回介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)和感覺的區(qū)域，即一種持續(xù)疼痛狀態(tài)轉(zhuǎn)移成急性疼痛狀態(tài)的模式。這進(jìn)一步表明，CBZ對(duì)攜帶Nav1.7-S241T突變的IEM患者有明顯的疼痛緩解作用。

總之，開創(chuàng)性的研究證明，體外試驗(yàn)可以臨床轉(zhuǎn)化以治療攜帶特定Nav1.7突變的IEM患者。預(yù)測(cè)Nav1.7突變的藥物反應(yīng)性，使個(gè)性化疼痛治療可能成為現(xiàn)實(shí)。

4 Nav1.7特異性阻斷劑：通過(guò)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSCs)走向臨床

遺傳和功能性的研究表明Nav1.7具調(diào)節(jié)疼痛的作用，因此，很多制藥公司致力于開發(fā)特異性針對(duì)Nav1.7的藥物，而最小程度作用于心臟(Nav1.5)、肌肉(Nav1.4)以及大腦(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6)以減少副作用。據(jù)報(bào)道許多針對(duì)Nav1.7的小分子化合物[34-35]已經(jīng)快速向臨床方向研發(fā)，其中很多化合物被發(fā)現(xiàn)可以作用于Nav1.7通道的新位點(diǎn)。

據(jù)針對(duì)Nav1.7亞型選擇性的第一個(gè)新型小分子芳基-磺胺類化合物報(bào)告，在第四結(jié)構(gòu)域的殘基形成了輝瑞公司(Pfizer)研發(fā)的化合物特有的一個(gè)新的藥物結(jié)合位點(diǎn)[36]。最近，基因泰克(Genentech)公司利用hNav1.7的胞外電壓感受域IV的一半替換了細(xì)菌的鈉通道NavAb來(lái)構(gòu)建的嵌合鈉通道，成功地破解了與藥物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。在此結(jié)構(gòu)中，在hNav1.7的第四域結(jié)合了基因泰克公司的化合物，并進(jìn)行了分子對(duì)接模擬，確定了亞型選擇性結(jié)合的關(guān)鍵殘基[37]。

除了小分子抑制劑以外，天然產(chǎn)物的開發(fā)，可利用自然選擇的優(yōu)勢(shì)尋找到針對(duì)hNav1.7的特異性阻斷劑。據(jù)報(bào)道，來(lái)源于蜈蚣毒液、蜘蛛毒素和狼蛛的多肽[38]，以及ProTx-II、GpTx1[39]可以有效抑制hNav1.7。從天然產(chǎn)物渠道獲得毒素不僅數(shù)量充足，并且可以進(jìn)一步改造以改善生物特性。

另外，這些新開發(fā)的化合物也可以利用臨床前的模型進(jìn)行測(cè)試，進(jìn)一步研究Nav1.7在感覺神經(jīng)元興奮性以及熱痛模型中的作用。利用由輝瑞公司開發(fā)的針對(duì)嚙齒動(dòng)物DRG感覺神經(jīng)元和人DRG感覺神經(jīng)元的Nav1.7特異性化合物，發(fā)現(xiàn)了hNav1.7在調(diào)節(jié)閾值中的作用。最近，Xenon和基因泰克公司合作開發(fā)的化合物能夠減少福爾馬林誘導(dǎo)大鼠炎性痛模型以及CFA誘導(dǎo)的冷痛模型的疼痛[40]。這些研究都為臨床試驗(yàn)的Nav1.7特異性阻斷劑測(cè)試鋪平了道路。

5 iPSCs作為體外疾病建模工具

誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSC)由一系列轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生成，理論上具有分化成任何細(xì)胞類型(包括感覺神經(jīng)元)的能力。近期，在臨床研究中，分別從4例攜帶Nav1.7基因突變的遺傳性紅斑性肢痛癥(IEM)病人和4例健康個(gè)體中利用iPSC衍生感覺神經(jīng)元[41]。分化后的神經(jīng)元由感覺神經(jīng)元標(biāo)志物(圖4(a))和電生理表型檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明EM神經(jīng)元和非EM神經(jīng)元在興奮性上存在明顯差異(圖4(b))，兩者自發(fā)放電水平差異顯著。由于自發(fā)放電與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)的重要性被突顯出來(lái)。來(lái)自EM患者的iPSC衍生的感覺神經(jīng)元需要更少的刺激來(lái)激發(fā)動(dòng)作電位(APs(圖4(c))。如圖4(d)所示，EM神經(jīng)元去極化電流有產(chǎn)生更多動(dòng)作電位的趨勢(shì)。與Nav1.7突變轉(zhuǎn)染的嚙齒動(dòng)物DRG神經(jīng)元研究相比[42-43]，此研究進(jìn)一步支持放電頻率與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)[44]。在較低強(qiáng)度刺激下EM神經(jīng)元比非EM神經(jīng)元更傾向于激發(fā)動(dòng)作電位，并對(duì)潛在無(wú)害刺激敏感性更高，這與患有異常性疼痛和痛覺過(guò)敏的EM患者的報(bào)告情況類似[45]。

圖4 紅斑性肢痛(EM)和非EM受試者誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)感覺神經(jīng)元間興奮性差異。(a) iPSC衍生細(xì)胞表達(dá)的感覺神經(jīng)元標(biāo)記：Brn3a(藍(lán)色)，Islet1(紅色)和Peripherin(綠色)。比例尺：200 mm。(b)上圖：每個(gè)受試者iPSC衍生的感覺神經(jīng)元自發(fā)放電百分比的圖。捐助者D1～D4：非EM受試者；EM1(突變S241T)、EM2(突變I848T)、EM3(突變V400M)和EM5(突變F1449V)是EM受試者。發(fā)現(xiàn)EM神經(jīng)元顯著顯示出更高水平的自發(fā)活動(dòng)(n=19～98；P＜0.05，線性邏輯模型)。下圖：iPSC衍生的非EM D3和EM3受試者中自發(fā)性和誘發(fā)性放電的水平。(c)來(lái)自非EM和EM供體的iPSC衍生神經(jīng)元的Rheobase值(n=16～86；P＜0.05，非參數(shù)ANOVA)。(d)響應(yīng)于增加強(qiáng)度的500 ms遞增電流步驟(n=10～46)，動(dòng)作電位觸發(fā)的頻率

重要的是，在iPSC衍生的感覺神經(jīng)元上使用Nav1.7特異性阻斷劑可以直接研究Nav1.7突變對(duì)細(xì)胞興奮性的貢獻(xiàn)。特別是Nav1.7選擇性阻斷劑PF-05153462的抑制作用具濃度依賴性(受試者EM2和EM3，圖5(a)和(b))。該抑制劑還能增加EM和非EM來(lái)源的iPSC衍生感覺神經(jīng)元的規(guī)模的安慰劑對(duì)照雙盲臨床試驗(yàn)，使用加熱裝置引發(fā)疼痛，并讓患者用0～10來(lái)評(píng)估疼痛度，在單劑量服用Nav1.7阻斷劑或安慰劑后進(jìn)行評(píng)估。有趣的是，相比于安慰劑組，PF-05153462(PF-05089771)組熱誘導(dǎo)的疼痛度弱。本研究證明了Nav1.7阻斷劑作為有效鎮(zhèn)痛藥的治療潛力。然而，由于受試者對(duì)疼痛的反應(yīng)程度有差異，使得結(jié)果存在一定的異質(zhì)性。這進(jìn)一步表明，iPSC rheobase基強(qiáng)度(指足以引起刺激的最小電流強(qiáng)度)，對(duì)EM神經(jīng)元具更大影響(圖5(c))，從而使神經(jīng)元興奮性降低。Nav1.7阻斷劑對(duì)AP產(chǎn)生的阻礙作用符合Nav1.7作為閾值通道的作用[46]。

無(wú)害溫度引起的疼痛發(fā)作是EM特有的特征[47]。重要的是，Nav1.7阻斷劑也能夠逆轉(zhuǎn)來(lái)自EM受試者的iPSC感覺神經(jīng)元受溫度誘導(dǎo)的過(guò)度興奮(圖5(d))。這個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在EM5(實(shí)驗(yàn)對(duì)象)iPSC衍生感覺神經(jīng)元中，PF-05153462能夠逆轉(zhuǎn)熱引起的神經(jīng)元過(guò)度興奮。

圖5 Nav1.7特異性阻斷劑降低來(lái)自EM患者的iPSC衍生的感覺神經(jīng)元的興奮性。(a)Nav1.7特異性阻斷劑PF-05153462iPSC使受試者EM2和EM3衍生神經(jīng)元中自發(fā)放電依賴性濃度衰減；(b)通過(guò)增加PF-05153462的濃度來(lái)抑制iPSC衍生的神經(jīng)元(受試者EM3)中的自發(fā)放電；(c)PF-05153462對(duì)EM和非EM受試者的iPSC衍生的感覺神經(jīng)元rheobase的影響(n=6～10；P＜0.05，ANOVA；濃度大于10 nmol·L-1的比較)；(d)顯示熱刺激的促興奮作用和隨后PF-05153462逆轉(zhuǎn)由熱誘導(dǎo)的rheobase降低。來(lái)自EM5的iPSC感覺神經(jīng)元的記錄

把這些基礎(chǔ)研究應(yīng)用到臨床，設(shè)計(jì)一個(gè)小衍生的神經(jīng)元在神經(jīng)生理學(xué)的層面預(yù)測(cè)個(gè)體間藥物的反應(yīng)和個(gè)體藥理反應(yīng)及其臨床表型可能是有價(jià)值的。例如：Nav1.7阻斷劑沒有降低受試者EM1的iPSC衍生的感覺神經(jīng)元的熱敏感性，并且沒有導(dǎo)致Nav1.7受體介導(dǎo)的熱觸發(fā)疼痛的衰減。這與EM3和EM5在兩次臨床治療中對(duì)藥物的反應(yīng)形成鮮明對(duì)比：這些患者的iPSC衍生感覺神經(jīng)元表現(xiàn)出明顯的PF-05153462介導(dǎo)的熱敏性衰減。

在本研究中，雖受試者人數(shù)少，但強(qiáng)調(diào)在臨床疼痛研究中考慮對(duì)受試者非均質(zhì)性的潛在可能性。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則上可通過(guò)基因組編輯技術(shù)(如CRISPR)進(jìn)一步改善。在表型分析中，保留每個(gè)受試者的個(gè)體基因組背景，不僅有助于提高對(duì)疾病表型個(gè)體差異的理解，而且如果在受試者數(shù)量足夠多的研究中得到證實(shí)，也可用于精確預(yù)測(cè)疼痛治療藥物干預(yù)的有效性。

6 從罕見疾病到常見病

除了輝瑞公司[41]開發(fā)的Nav1.7阻斷劑外，其他具有Nav1.7選擇性阻斷作用的化合物也進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，研究其對(duì)更常見的疼痛疾病的療效。雖然最初的試驗(yàn)都是以具有罕見突變的患者作為一個(gè)基因識(shí)別組開始的，但預(yù)計(jì)更常見的疼痛綜合征也應(yīng)對(duì)Nav1.7發(fā)揮阻斷作用的化合物產(chǎn)生反應(yīng)。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的具有活性依賴的Nav1.7阻斷劑BIIB074，其特點(diǎn)在于鈉通道活性越高，BIIB074阻斷作用越強(qiáng)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，BIIB074能夠明顯降低三叉神經(jīng)每日疼痛次數(shù)以及疼痛程度。雖然這項(xiàng)研究的樣本數(shù)量較小，但是這些結(jié)果都將為日后的研究奠定基礎(chǔ)。

正如上一節(jié)所討論的，輝瑞化合物(PF-05089771)已經(jīng)完成了一項(xiàng)針對(duì)紅血球痛患者的小試驗(yàn)，并報(bào)告了研究結(jié)果[41]。輝瑞公司還測(cè)試了術(shù)后的牙痛和糖尿病神經(jīng)病變，包含了更多的參與者，但結(jié)果尚未完全披露(ClinicalTrials.gov)。

7 結(jié)論和觀點(diǎn)

追蹤病史登記，根據(jù)慢性疼痛患者的遺傳背景來(lái)識(shí)別可能的應(yīng)答者，這可能對(duì)進(jìn)一步區(qū)分慢性疼痛患者有很大的益處。一些低于預(yù)期的臨床結(jié)果也可能是由于次優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所致，因?yàn)槠錄]有精確捕捉到參與者疼痛的改善狀況。在PF-05089771輝瑞的試驗(yàn)中，患者單劑量口服藥物或安慰劑，并進(jìn)行24小時(shí)的數(shù)字疼痛評(píng)分量表的評(píng)估[41]。與安慰劑相比，由于IEM的慢性疼痛特征，在24小時(shí)內(nèi)未能降低某些IEM患者的最大疼痛評(píng)分，可能無(wú)法將藥物療效的全貌充分反映出來(lái)。如果測(cè)量周期延長(zhǎng)，劑量加大，可能有助于進(jìn)一步評(píng)價(jià)藥物的有效性。事實(shí)上，在另外一個(gè)試驗(yàn)中[24]，評(píng)估兩個(gè)攜帶S241T突變的IEM患者對(duì)CBZ的反應(yīng)時(shí)，患者在試驗(yàn)期間服用了CBZ或安慰劑兩周。通過(guò)測(cè)量包括腦功能成像(fMRI)、疼痛時(shí)間、疼痛發(fā)作持續(xù)時(shí)間和覺醒次數(shù)(多天)等參數(shù)，與安慰劑組相比，CBZ給藥組患者疼痛有明顯的改善[24]。研究表明對(duì)受測(cè)試患者更細(xì)致、更長(zhǎng)時(shí)間的觀察和分析可能對(duì)評(píng)價(jià)新型止痛藥物的效用有很大的作用。

另外，也有可能是這些早期的化合物對(duì)Nav1.7選擇性或者效力不強(qiáng)，或者無(wú)法穿透血腦屏障進(jìn)入中樞系統(tǒng)抑制Nav1.7的功能。事實(shí)上，Nav1.7功能缺失雜合子突變的攜帶者疼痛感是正常的，那么問(wèn)題自然就要考慮需要多少劑量才能減輕疼痛。另一種可能是人體中由于Nav1.7功能喪失而形成了補(bǔ)償。雖然對(duì)于給予Nav1.7抑制劑后的各種反應(yīng)類型尚不清楚，但服用Nav1.7阻斷劑的慢性疼痛患者可能會(huì)出現(xiàn)這種或者其他補(bǔ)償反應(yīng)。盡管所有這些問(wèn)題都需要進(jìn)一步研究闡明，Nav1.7通道仍然是下一代止痛藥和個(gè)性化疼痛治療的主要靶標(biāo)。

備注：此文是Yang Yang, et al, Nav1.7 as a pharmacogenomic target for pain: moving toward precision medicine, Trends in Pharmacological Sciences 2018 的中文刪節(jié)修改。

(2018年4月27日收稿)■