定向進(jìn)化和噬菌體展示：生物方法開啟化學(xué)新時(shí)代
——2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)簡介

郭曉強(qiáng)

北京大學(xué) 深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036

2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予三位科學(xué)家，美國加州理工學(xué)院弗朗西絲?漢密爾頓?阿諾德(Frances Hamilton Arnold)由于“酶定向進(jìn)化”方面的貢獻(xiàn)分享1/2，美國密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校喬治?皮爾森?史密斯(George Pearson Smith)和英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)MRC實(shí)驗(yàn)室格雷戈里?保羅?溫特爵士(Sir Gregory Paul Winter)則由于“肽和抗體噬菌體展示”方面的貢獻(xiàn)而分享另外1/2(圖1)[1-2]。

1 進(jìn)化原理

今天，地球上千差萬別的物種都是上百萬年進(jìn)化的結(jié)果。進(jìn)化的實(shí)現(xiàn)需要兩個(gè)前提：一是變異(mutation)；二是選擇(selection)。變異是進(jìn)化的前提和基礎(chǔ)，它為選擇提供了盡可能多的材料；而選擇是進(jìn)化的動(dòng)力和保證，借助選擇才能實(shí)現(xiàn)“優(yōu)勝劣汰”。然而，自然界進(jìn)化往往是隨機(jī)過程，依據(jù)自然環(huán)境變化選擇或淘汰特定群體；而定向進(jìn)化則是人為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的選擇，在這里“定向”可理解為“設(shè)定方向”之意。定向進(jìn)化原理很早就被人類應(yīng)用于生產(chǎn)和生活，如動(dòng)植物馴化和育種等。這里試舉一例來理解定向進(jìn)化原理。

抗倒伏是評價(jià)小麥性能的一個(gè)重要指標(biāo)，而抗倒伏與植株高度相關(guān)。假定現(xiàn)有一小麥品種，植株高100 cm，其他方面都較為理想，但抗倒伏能力弱，因此想采用定向進(jìn)化策略將其改造為高80 cm的抗倒伏品種。首先采用紫外線或X射線照射誘導(dǎo)小麥DNA變異，然后對后代小麥高度進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)大部分小麥仍100 cm，但少部分出現(xiàn)高度變化，最高達(dá)到110 cm，最低90 cm，則根據(jù)定向標(biāo)準(zhǔn)(矮化)保留90 cm小麥，其他淘汰。由于仍未達(dá)到要求，需重復(fù)操作，對90 cm小麥進(jìn)一步誘發(fā)突變并對后代篩選。此時(shí)若有80 cm小麥出現(xiàn)，則意味著通過兩輪操作完成定向進(jìn)化任務(wù)；若沒有，最低只有85 cm，則繼續(xù)重復(fù)上述操作——對85 cm小麥采用誘變-篩選操作，直到出現(xiàn)80 cm小麥為止(圖2)。

圖1 2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者[2]

2 分子定向進(jìn)化

圖2 定向進(jìn)化

物種馴化是從宏觀層面實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化，這一策略是否在分子水平同樣適用尚未確定。20世紀(jì)80年代，德國化學(xué)家艾根(Manfred Eigen，1967年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者)開始從分子層面研究生命起源和進(jìn)化[3]。艾根認(rèn)為，生命產(chǎn)生(從非生命過渡到生命)是一個(gè)極為漫長的過程，盡管概率極低，但仍可實(shí)現(xiàn)，其原因和動(dòng)力就在于進(jìn)化。如將這一策略從自然界轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)化速度(變異加選擇)將大大加快，以前幾萬年才能實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)將有望在幾天內(nèi)達(dá)成(幸運(yùn)的話)。在艾根看來，相對于從一個(gè)足夠大樣本一次篩選到理想目標(biāo)，從一個(gè)小樣本采用多輪篩選、逐步逼近定向目標(biāo)的策略更可行，從而意味著多輪進(jìn)化方案更優(yōu)(圖2)。艾根只從理論上闡述了分子定向進(jìn)化原理，阿諾德則首次在實(shí)驗(yàn)室完成該過程。

3 酶定向進(jìn)化策略

定向進(jìn)化前提是變異，因此變異制備就成為該策略首要解決的難題。

3.1 DNA點(diǎn)突變

1956年7月15號(hào)，阿諾德出生于美國匹茲堡，父親是著名核物理學(xué)家威廉?阿諾德(William Howard Arnold，1974年當(dāng)選為美國工程院院士)。這樣的家庭背景對阿諾德的成長具有重要影響。1979年，阿諾德從普林斯頓大學(xué)獲得機(jī)械工程學(xué)位，此時(shí)她的遠(yuǎn)大理想是希望通過開發(fā)新技術(shù)造福人類。阿諾德最初想利用太陽能發(fā)電，因此在當(dāng)?shù)匾患姨柲苎芯克虝汗ぷ饕欢螘r(shí)間；后來又轉(zhuǎn)向生物能源，進(jìn)入加州大學(xué)伯克利分校化學(xué)工程系攻讀博士學(xué)位。意外的是，20世紀(jì)80年代初國際油價(jià)大跌，生物能源研究幾乎降到冰點(diǎn)，因此阿諾德不得不轉(zhuǎn)換方向，進(jìn)入到生物技術(shù)這一新興領(lǐng)域。她采用親和層析進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化，并于1985年獲得博士學(xué)位。經(jīng)歷短暫的博士后研究工作后，阿諾德于1986年加入加州理工學(xué)院并建立實(shí)驗(yàn)室，開啟獨(dú)立的科研生涯，研究聚焦于一類在工業(yè)或醫(yī)學(xué)具有廣泛應(yīng)用潛力的特殊蛋白質(zhì)——酶。

酶是一類重要的生物催化劑，也是眾多生命過程維持的基礎(chǔ)[4]。相對于工業(yè)常用小分子催化劑，酶具有催化效率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，因此得到工業(yè)界的極大青睞。然而，酶還存在穩(wěn)定性差(易降解)和反應(yīng)條件苛刻(工業(yè)環(huán)境下酶活性低)等諸多不足，從而大大限制了它的應(yīng)用，因此酶的改造就成為增加其應(yīng)用普適性的一個(gè)重要發(fā)展方向。

20世紀(jì)80年代末，科學(xué)界主要采用理性設(shè)計(jì)策略進(jìn)行蛋白質(zhì)改造。這一策略在新藥發(fā)明方面取得重要成功，其通過對藥物前導(dǎo)小分子官能團(tuán)的替換和修飾等操作而獲得療效更好的藥物。然而，這一策略應(yīng)用于蛋白質(zhì)改造時(shí)效果并不理想，原因在于蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，通常含有幾百甚至上千個(gè)氨基酸，影響活性的通常是結(jié)構(gòu)域(包含多個(gè)氨基酸)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類又有20種之多，因此理性設(shè)計(jì)極難實(shí)現(xiàn)目標(biāo)。在阿諾德看來，與自然界相比，人的智慧還十分渺小，畢竟天然酶都是進(jìn)化的結(jié)果，而非人為設(shè)計(jì)的產(chǎn)物[5]。因此，阿諾德決定轉(zhuǎn)換思路，采用定向進(jìn)化策略進(jìn)行酶的改造。那就是制造出盡可能多的酶變異體，然后從中篩選到理想的酶。為此她需要做上百萬次廉價(jià)、快速的實(shí)驗(yàn)，而其中只有一次成功機(jī)會(huì)，但她只關(guān)注那一次成功，不在乎999 999次的失敗。這一策略有點(diǎn)類似“大海撈針”，因此許多科學(xué)家并不看好，但阿諾德堅(jiān)信只要這個(gè)“針”理論上存在，總有可能“撈”到。

阿諾德首先需要解決“海”的問題，即酶突變體制備。為此她采用了兩種策略[6]：第一種為定點(diǎn)突變(site-directed mutagenesis)，在引物設(shè)計(jì)過程中人為引入錯(cuò)配堿基，再借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)獲得特定堿基位點(diǎn)突變的DNA；第二種為隨機(jī)突變(random mutagenesis)，利用保真度較低DNA聚合酶進(jìn)行PCR，可產(chǎn)生堿基位點(diǎn)的隨機(jī)突變。通過這兩種策略，阿諾德獲得了積累多個(gè)點(diǎn)突變的酶變異體庫，為下一步的選擇奠定了基礎(chǔ)。阿諾德的策略產(chǎn)生的主要是DNA點(diǎn)突變，不久另一種大片段變異策略對此進(jìn)行了有益補(bǔ)充。

3.2 DNA改組

斯特默 (Willem Pim Stemmer，1957—2013)是一位荷蘭分子生物學(xué)家，在阿姆斯特丹大學(xué)就讀期間就對生物學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，因此1980年他獲得碩士學(xué)位后進(jìn)入美國威斯康星大學(xué)攻讀分子生物學(xué)的博士學(xué)位，主要研究病原體與宿主間的相互作用。斯特默不僅是一位科學(xué)家，也是一位實(shí)業(yè)家。畢業(yè)后他進(jìn)入企業(yè)任職，最初在Hybritech抗體公司工作，20世紀(jì)90年代加入位于加利福尼亞帕洛阿爾托的Affymax公司，并在這里發(fā)明了一種新的DNA突變方法。

斯特默首先收集了不同物種來源的同種酶DNA，然后借助DNA酶Ⅰ部分消化產(chǎn)生大量10～50個(gè)堿基對(base pair，bp)大小的DNA片段。復(fù)性過程(DNA單鏈形成雙鏈)中，這些具有同源性的單鏈DNA片段可隨機(jī)形成重組雙鏈，進(jìn)一步借助PCR可最終實(shí)現(xiàn)大量體外重組DNA(圖3)[7]，該方法被稱為D N A改組(D N A shuffling，“shuffling”本意是“重新洗牌”)。DNA改組由于模擬高等生物有性生殖減數(shù)分裂過程中等位基因DNA片段間互換，有時(shí)又稱有性PCR(sexual PCR)。DNA改組還有另一種實(shí)現(xiàn)方法，使用限制性內(nèi)切酶在相同位置將同源基因進(jìn)行剪切產(chǎn)生DNA片段，再用DNA連接酶將這些片段隨機(jī)連接成重組DNA分子，最終利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增[8]。

點(diǎn)突變和改組都是制造DNA變異的重要手段，實(shí)際應(yīng)用過程中往往聯(lián)合使用，成為定向進(jìn)化的基礎(chǔ)。遺憾的是，斯特默由于2013年去世而喪失分享諾貝爾獎(jiǎng)的資格[9]。

圖3 斯特默和DNA改組[8-9]

3.3 選擇

變異制備僅僅完成定向進(jìn)化的第一步，理想的篩選系統(tǒng)對最終的成功也至關(guān)重要。篩選步驟過于繁瑣將極大地消耗精力并增加工作負(fù)擔(dān)，造成目標(biāo)失敗的概率大增。

最常用的策略為細(xì)胞生存力。如果一個(gè)酶具有催化有毒物質(zhì)降解的能力，則可利用該有毒物質(zhì)進(jìn)行篩選。斯特默最初決定篩選到高活性β-內(nèi)酰胺酶，而該酶主要催化β-內(nèi)酰胺環(huán)裂解，因此可導(dǎo)致含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素如青霉素類和頭孢菌素類等的抗菌活性喪失。斯特默將不同β-內(nèi)酰胺酶變異體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在轉(zhuǎn)基因大腸桿菌培養(yǎng)基中加入高濃度頭孢噻肟作為篩選劑，凡可生存下來的細(xì)菌則意味著表達(dá)高活性β-內(nèi)酰胺酶。經(jīng)過多輪突變和篩選(逐漸增加頭孢噻肟濃度)，斯特默最終實(shí)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶定向進(jìn)化目標(biāo)[10]。

根據(jù)酶催化產(chǎn)物引起的顏色變化或表型差異，研究人員可借助視覺進(jìn)行篩選。為了獲得在高濃度二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中仍保留高活性的枯草桿菌蛋白酶，阿諾德將多種枯草桿菌蛋白酶變異DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌；將大腸桿菌放置在含有DMF和酪蛋白的培養(yǎng)基中，分泌出的蛋白酶可水解酪蛋白，因此產(chǎn)生肉眼可見的暈環(huán)(halos)結(jié)構(gòu)，而暈環(huán)大小與酶活性正相關(guān)，據(jù)此鑒定出高活性酶；對篩選到的酶對應(yīng)DNA進(jìn)一步突變，重新產(chǎn)生大量蛋白酶變異體，再根據(jù)暈環(huán)大小篩選更高活性酶；重復(fù)操作，直到找到符合預(yù)期活性的酶為止(圖4)。經(jīng)過三輪篩選，阿諾德最終得到一種包含10個(gè)點(diǎn)突變、比天然酶活性高256倍的蛋白酶[6]。

此外，還可根據(jù)產(chǎn)物特征利用分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀等方式進(jìn)行篩選。為了適應(yīng)工業(yè)需求，篩選過程中往往還需人為增加其他選擇壓力，如阿諾德使用的有機(jī)溶劑，以及高溫、高鹽等非天然環(huán)境。這些條件的選擇依據(jù)酶將來的應(yīng)用環(huán)境而定。

圖4 酶的定向進(jìn)化[1]

4 酶定向進(jìn)化的應(yīng)用

定向進(jìn)化為酶的改造提供了一種全新方案。經(jīng)過定向進(jìn)化獲得的酶具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如活性高、穩(wěn)定性好和適應(yīng)性廣等。此外，還進(jìn)化出許多催化新型化學(xué)反應(yīng)的酶，進(jìn)一步拓展了酶的應(yīng)用領(lǐng)域。今天，基于定向進(jìn)化得到的酶已在環(huán)境治理、生物能源、生物塑料等方面得到廣泛應(yīng)用[11]，這里試舉幾例。

4.1 生物能源

由于化石能源(如石油等)不可再生和造成環(huán)境污染等問題，大家開始尋找替代能源，而以異丁醇為代表的生物能源是目前的一個(gè)重要方向。在利用大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇過程中遇到一個(gè)重大挑戰(zhàn)——天然異丁醇合成相關(guān)酶以NADPH為輔因子，而大腸桿菌自身生成NADH，為此采用定向進(jìn)化的方法對異丁醇合成相關(guān)酶進(jìn)行改造，有效地解決了這一難題(利用NADH作輔因子)[12]，為將來生物能源的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

4.2 藥物生產(chǎn)

許多作為藥物的有機(jī)化合物都存在手性特征，著名的例子如沙利度胺(Thalidomide，又名反應(yīng)停)，其R型有鎮(zhèn)靜作用，而其手性異構(gòu)體S型則具有致畸作用，因此需要選擇性合成。傳統(tǒng)化學(xué)合成方法在這方面存在一定缺陷，而酶催化反應(yīng)本身具有手性選擇性，因此具有先天優(yōu)勢。借助定向進(jìn)化對酶進(jìn)行改造，將為許多手性藥物的生產(chǎn)提供新選擇[13]。

4.3 新化學(xué)反應(yīng)

細(xì)胞色素P450(CYPs)是一個(gè)蛋白超家族，以血紅素作為輔因子，因最大吸收波長為450 nm，故得名。細(xì)胞色素P450家族對底物特異性要求低，因此為它們的改造提供了先天條件。阿諾德和同事采用定向策略使改造后的細(xì)胞色素P450可高效催化烯烴環(huán)丙烷化反應(yīng)，這種改造使酶的吸收波長從450 nm向411 nm偏移，因此進(jìn)化酶通常稱為細(xì)胞色素P411[14]。阿諾德采用酶定向進(jìn)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高效催化C—Si鍵的形成這一自然界罕見的化學(xué)反應(yīng)[15]，從而為有機(jī)硅生產(chǎn)提供了一種綠色方式。

5 噬菌體展示技術(shù)

1972年，美國斯坦福大學(xué)生物化學(xué)家伯格(Paul Berg)首次在體外將猿猴病毒SV40的DNA片段與λ噬菌體的DNA片段實(shí)現(xiàn)了連接，產(chǎn)生第一個(gè)人工重組DNA，他也由于這項(xiàng)奠基性貢獻(xiàn)而分享1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1973年，伯耶(Herbert Boyer)和科恩(Stanley Cohen)進(jìn)一步將攜帶抗藥基因的人工重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，首次完成基因工程，同時(shí)推動(dòng)了產(chǎn)業(yè)化的到來。1976年第一個(gè)基因工程公司基因泰克(Genentech)成立，并于1978年首次采用基因工程完成人類胰島素的合成。基因工程的巨大成功也使眾多科學(xué)家加入到這一研究行列。

1941年3月10日，史密斯出生于美國康涅狄格州諾沃克(Norwalk)，從哈弗福德學(xué)院(Haverford College)獲得生物學(xué)學(xué)士學(xué)位，并有一年時(shí)間在高中擔(dān)任老師和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員。他在哈佛大學(xué)獲得細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)博士學(xué)位后進(jìn)入威斯康星大學(xué)，跟隨著名生物學(xué)家奧利弗?史密斯(Oliver Smithies，2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者)進(jìn)行博士后研究，1975年加入密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校，工作至今。1983—1984年他來到杜克大學(xué)與韋伯斯特(Robert Webster)合作，從而開啟了他的噬菌體展示之路。20世紀(jì)80年代，史密斯很想解決一個(gè)技術(shù)難題，那就是如何從蛋白質(zhì)信息找到對應(yīng)的基因信息(DNA序列)。這一問題在今天看來很容易解決，在當(dāng)時(shí)卻非常棘手。大腸桿菌作為宿主存在一定缺陷，合成的外源蛋白或者定位于細(xì)胞內(nèi)，或者分泌到細(xì)胞外，從而很難將蛋白與大腸桿菌實(shí)現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系，史密斯因此將目光投向了更簡單的生物——噬菌體。

噬菌體，顧名思義，就是一類感染細(xì)菌的病毒。它們結(jié)構(gòu)簡單，培養(yǎng)方便，因此在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。早在1930年代末，加州理工學(xué)院德裔美國生物學(xué)家德爾布呂克(Max Ludwig Henning Delbrück，1906—1981)就開始關(guān)注細(xì)菌和噬菌體。1941年的一次學(xué)術(shù)會(huì)議上，德爾布呂克與印第安納大學(xué)魯里亞(Salvador Edward Luria，1912—1991)相識(shí)，從而開啟以噬菌體為模式生物的遺傳學(xué)研究。一系列開創(chuàng)性的實(shí)驗(yàn)為噬菌體成為分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)工具奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并吸引眾多科學(xué)家加入這一領(lǐng)域，形成著名的“噬菌體研究小組”。1943年，華盛頓大學(xué)赫爾希(Alfred Day Hershey，1908—1997)也加入噬菌體小組，并于1952年以噬菌體為模型采用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明DNA是遺傳物質(zhì)。1969年，德爾布呂克、魯里亞和赫爾希由于“病毒復(fù)制機(jī)制和遺傳結(jié)構(gòu)”的發(fā)現(xiàn)而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。此外，沃森(James Dewey Watson)是魯里亞的第一位研究生，正是沃森在噬菌體研究過程中發(fā)現(xiàn)了遺傳物質(zhì)的重要性而轉(zhuǎn)向DNA研究，并于1953年提出DNA雙螺旋模型，從而宣告分子生物學(xué)時(shí)代的到來。

噬菌體有許多類型，而史密斯選擇的是絲狀噬菌體(filamentous phage)。這是一類外形呈絲狀或線狀的噬菌體(圖5)，常見種類包括M13和f1等。它們通常含有單鏈DNA，主要感染革蘭氏陰性菌，著名的如大腸桿菌等。絲狀噬菌體的基因III編碼一種外殼蛋白，稱為蛋白III(pIII)。蛋白III定位于噬菌體末端，主要負(fù)責(zé)結(jié)合并感染細(xì)菌。史密斯發(fā)現(xiàn)，若在噬菌體基因III內(nèi)部插入一小段外源基因，并不影響噬菌體感染效率，但同時(shí)可將外源蛋白一同攜帶到噬菌體表面。1985年，史密斯首先實(shí)現(xiàn)了這一想法，稱為噬菌體展示技術(shù)[16]。

噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)勢一目了然，那就是為基因克隆和蛋白質(zhì)相互作用的研究提供了一個(gè)理想實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。假定我們分離到一種重要蛋白質(zhì)，并且制備出該蛋白的單克隆抗體，現(xiàn)在想知道該蛋白的編碼基因；此時(shí)可用蛋白抗體為誘餌(附著于固體支持物)，從表達(dá)不同外源蛋白的噬菌體中精確找到攜帶目標(biāo)蛋白的噬菌體(非攜帶目標(biāo)蛋白噬菌體通過洗脫被去除)，進(jìn)一步對此噬菌體中外源基因部分進(jìn)行測序就可確定DNA序列(圖5)。再比如，現(xiàn)已知一種蛋白或多肽，想研究它的相互作用蛋白，此時(shí)就可用該蛋白作為釣餌附著于固體表面，而將其他潛在蛋白片段對應(yīng)基因插入噬菌體基因III，采用相似策略可鑒定出相互作用蛋白及對應(yīng)基因。史密斯的研究小組采用這種方法鑒定出蛋白質(zhì)相互作用過程中關(guān)鍵氨基酸的信息[17]。真正使噬菌體展示技術(shù)發(fā)揚(yáng)光大的則是隨后在人抗體制備中的應(yīng)用。

圖5 噬菌體展示技術(shù)

6 抗體噬菌體展示

抗體(antibody，Ab)，又稱免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，是一類由免疫細(xì)胞分泌并特異性識(shí)別和結(jié)合細(xì)菌和病毒等病原體特定分子(稱為抗原，antigen)的蛋白質(zhì)。20世紀(jì)50年代末，科學(xué)家初步解析了抗體的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所有抗體基本結(jié)構(gòu)都是相同的，呈“Y”字型(圖6)。抗體由四條多肽鏈構(gòu)成，兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈，它們之間通過二硫鍵相連。重鏈一般含1個(gè)可變區(qū)和3個(gè)連續(xù)的恒定區(qū)；而輕鏈通常含1個(gè)可變區(qū)和1個(gè)恒定區(qū)。重鏈可變區(qū)和鄰近的恒定區(qū)與輕鏈構(gòu)成了抗原結(jié)合片段(antigen-binding fragment，F(xiàn)ab)區(qū)，是抗體發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(圖6)。

抗體由于和特定分子特異性結(jié)合的特性而使其在物質(zhì)檢測和純化、疾病診斷和治療等方面具有廣泛應(yīng)用。最初抗體制備采用抗原免疫動(dòng)物(如兔和羊等)策略，但往往得到多克隆抗體，因此限制了其應(yīng)用。1975年，劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Laboratory of Molecular Biology，LMB)科赫勒(Georges K?hler，1946—1995)和米爾斯坦(César Milstein，1927—2002)成功開發(fā)出小鼠雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體[18]，為抗體的應(yīng)用帶來一場革命，兩位科學(xué)家也因此分享1984年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

鼠源單克隆抗體應(yīng)用于人類疾病的治療時(shí)遭遇重大障礙。由于鼠和人的差異，鼠源單克隆抗體進(jìn)入人體后可激發(fā)免疫應(yīng)答，最終被破壞而使藥效難以發(fā)揮。為解決這一難題，研究人員采取了多項(xiàng)策略(圖6)[19]。最初用鼠抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)融合，產(chǎn)生嵌合型抗體(chimeric antibody)，這種方法可使抗體中人成分達(dá)到65 %，增加了抗體的治療效果。治療結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌的表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體——西妥昔單抗 (Cetuximab) (商品名愛必妥，Erbitux)就屬嵌合型抗體。后來，又開發(fā)出以人抗體為基礎(chǔ)，將抗體高度可變區(qū)替換為小鼠片段的人源化抗體(humanized antibody)，這種策略可使抗體中人成分占到95 %。治療乳腺癌的人表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)抗體——曲妥珠單抗(Trastuzumab)(商品名赫賽汀，Herceptin)、治療腎癌等的血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)抗體——貝伐單抗(Bevacizumab)(商品名阿瓦斯汀，Avastin)等都是人源化單抗。然而，這些抗體畢竟還保留小鼠的成分，具有潛在副作用，因此開發(fā)百分百人抗體就成為抗體公司的一個(gè)重要方向。溫特采用噬菌體展示技術(shù)巧妙地解決了這一問題。

圖6 抗體噬菌體展示制備人抗體

1951年4月10日，溫特出生于英國萊斯特。他在劍橋三一學(xué)院完成學(xué)業(yè)，并于1977年從LMB獲理學(xué)博士學(xué)位，在此期間見證了小鼠單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)明過程，因此對抗體產(chǎn)生濃厚興趣。1989年，溫特與同事建立劍橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology，CAT)，致力于對傳統(tǒng)小鼠單克隆抗體的改進(jìn)。

1990年，溫特對噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。他反其道而行之，不再利用抗體尋找蛋白，而是從蛋白出發(fā)篩選特異性抗體。由于噬菌體基因組較小，對外源基因容納能力有限，不適用于完整抗體的展示，溫特和同事用單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)進(jìn)行代替。所謂scFv，是指抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(識(shí)別抗原的最關(guān)鍵區(qū)域)用多肽進(jìn)行連接，亦可完成對抗原的特異性識(shí)別和結(jié)合。溫特和同事用雞蛋白溶菌酶免疫小鼠，然后收集小鼠B細(xì)胞，并把scFv基因插入絲狀噬菌體基因III，最終篩選到雞蛋白溶菌酶高親和力scFv。該scFv不與人和火雞溶菌酶發(fā)生交叉反應(yīng)，進(jìn)一步說明其高特異性[20]，從而意味著噬菌體展示技術(shù)在抗體篩選中的可行性。

第二年，溫特又對抗體噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行完善[21]。一方面建立了小鼠scFv基因庫，增加選擇機(jī)會(huì)；另一方面還加入定向進(jìn)化理念。由于抗體生成本身就是一個(gè)進(jìn)化過程(B細(xì)胞已產(chǎn)生盡可能多的基因變異抗體，而抗原只負(fù)責(zé)篩選過程)，定向進(jìn)化選擇也就順理成章。溫特首先利用噬菌體展示技術(shù)獲得高結(jié)合力的scFv片段，進(jìn)一步采用重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)DNA改組技術(shù)增加變異體容量(其中包含免疫后小鼠原本不存在的scFv)，經(jīng)過多輪篩選獲得更理想的scFv。同一年，溫特小組還首次建立人scFv庫[22]，并證明噬菌體展示技術(shù)同樣適用于人抗體的制備，從而為人抗體的生產(chǎn)提供了一個(gè)全新方式。多家公司紛紛加入這一領(lǐng)域，投入大量人力和物力，隨后一系列人抗體被制備并開始臨床試驗(yàn)。

7 抗體噬菌體展示應(yīng)用

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)是一種細(xì)胞因子，通過與其受體結(jié)合而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與諸多自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎性腸病、銀屑病和難治性哮喘等，因此抑制TNFα被看作治療這些疾病的重要手段。

1993年，包括劍橋抗體公司在內(nèi)的多家公司開始合作，利用噬菌體展示技術(shù)制備TNFα人抗體，最初獲得的抗體命名為D2E7[23]。2002年，TNFα人抗體D2E7被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療，后又陸續(xù)批準(zhǔn)應(yīng)用于銀屑病與炎癥性腸病等治療。D2E7也因此正式改名為阿達(dá)木單抗(adalimumab)，商品名修美樂(Humira)，意為“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎應(yīng)用的人單克隆抗體”(human monoclonal antibody in rheumatoid arthritis)。阿達(dá)木單抗成為第一個(gè)臨床應(yīng)用的人抗體。自2002年以來，已累計(jì)創(chuàng)造近1 000億美元價(jià)值，僅2016年就達(dá)160億美元，且一直引領(lǐng)暢銷藥物排行榜，創(chuàng)造了新藥銷售的一個(gè)奇跡。

阿達(dá)木單抗的成功激起醫(yī)藥界對人抗體的巨大熱情，從而使越來越多的人抗體應(yīng)用于臨床，如治療和預(yù)防炭疽桿菌感染疾病的拉克昔布單抗(Raxibacumab)、治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的貝利木單抗(Belimumab)、治療轉(zhuǎn)移性鱗狀非小細(xì)胞肺癌的耐昔妥珠單抗(Necitumumab)，以及治療胃癌、肺癌和結(jié)直腸癌等的雷莫蘆單抗(Ramucirumab)等[24]。因此，人抗體將來有望在解除毒素、抗擊免疫疾病和治療癌癥等多個(gè)方面發(fā)揮更大作用。

8 小結(jié)

蛋白質(zhì)作為一類重要的生物大分子具有廣泛應(yīng)用，而酶定向進(jìn)化和抗體噬菌體展示(可看作結(jié)合蛋白定向進(jìn)化)因此可看作蛋白質(zhì)改造工程。改造后的酶已在生物燃料、無機(jī)材料、精細(xì)化工、日用消費(fèi)、實(shí)驗(yàn)室試劑、藥物中間體以及臨床應(yīng)用藥物等生產(chǎn)方面得到廣泛應(yīng)用，特別是定向進(jìn)化酶的工業(yè)生產(chǎn)符合綠色化學(xué)要求，如減少無機(jī)催化劑的使用和不必要對映體的生成，降低能源消耗等?？贵w作為臨床最常用的藥物，其應(yīng)用范圍也越來越廣。2018年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)也是授予一類單克隆抗體在癌癥治療中的應(yīng)用，而噬菌體展示獲得人抗體最大程度地減少了抗體應(yīng)用過程中產(chǎn)生的副作用，具有重大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

繼去年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予冷凍電鏡后，今年 “不出意外”地又授予生物學(xué)領(lǐng)域，一方面凸顯生物學(xué)的快速發(fā)展和新進(jìn)展的層出不窮，另一方面也展示了化學(xué)的開放性和包容性。只要對推動(dòng)化學(xué)發(fā)展有益，并對改善人類生活有用的發(fā)現(xiàn)都值得授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

(2018年11月12日收稿)■