阿德福韋酯聯(lián)合干擾素 －2b對慢性乙型肝炎患者細(xì)胞免疫與趨化因子水平的影響

賀 旭，柴 進(jìn)，劉 巍

（1.中國人民解放軍第九五八醫(yī)院，重慶 400020； 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400038）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）為我國常見傳染病[1]，以肝細(xì)胞炎癥性壞死為主要病理特征，患者常出現(xiàn)乏力、納差、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，可進(jìn)展為肝硬化、肝癌、肝功能衰竭，也能引起全身多個(gè)臟器受損[2－3]。治療 CHB的關(guān)鍵在于抑制乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制和體內(nèi)對HBV的免疫反應(yīng)，從而控制病情進(jìn)展。阿德福韋酯（ADV）和干擾素是常用治療CHB的藥物，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者屬核苷（酸）類似物，其對HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率較高，但HBeAg的轉(zhuǎn)換率較低，而后者對HBeAg的轉(zhuǎn)換率較高，HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率較低，故臨床常將兩者聯(lián)用。以往的研究[4－5]主要關(guān)注這2種藥物的臨床療效，對其細(xì)胞免疫水平與趨化因子的表達(dá)水平影響研究較少。本研究中選取醫(yī)院2015年收治的CHB患者96例，進(jìn)行分組治療，觀察了治療前后的細(xì)胞免疫水平與各種趨化因子的變化。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；HBeAg陽性至少1 年，HBV DNA 載量 ＞1.0×105copies／mL，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平 80～400 U／L，血總膽紅素(TBil)＜正常值上限的2倍，血小板（PLT）計(jì)數(shù)＞80×109／L，凝血功能正常；治療前6個(gè)月未使用抗病毒藥物與免疫調(diào)節(jié)劑；能完成至少48周的療程，臨床資料完整、可靠；本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者自愿參加本研究，且簽署知情同意書。

表1 3組患者一般資料比較(n＝32)

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝硬化、肝性腦病、肝癌；合并甲型、丙型、丁型等其他肝炎病毒或EB病毒、巨細(xì)胞病毒等感染；合并嚴(yán)重的心、肺、腎、內(nèi)分泌、血液、神經(jīng)精神等系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤；妊娠期或哺乳期。

病例選擇與分組：選取醫(yī)院2015年1月至12月收治的CHB患者96例，其中男87例，女9例；年齡26～60 歲，平均（37.4±5.3）歲。按隨機(jī)數(shù)字表法將96 例患者分為ADV組、干擾素組和聯(lián)合組，各32例。3組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。

1.2 治療方法

全部患者均給予常規(guī)生活指導(dǎo)。ADV組患者應(yīng)用阿德福韋酯膠囊（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20060666，規(guī)格為每粒10 mg），口服，每日1次，每次10 mg；干擾素組患者應(yīng)用重組人干擾素α－2b注射液（安徽安科生物工程＜集團(tuán)＞股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20040010，規(guī)格為每支 600萬 U），隔日皮下注射1次，每次600萬U；聯(lián)合組患者同時(shí)應(yīng)用2種藥物，其用法、用量同其他兩組。3組患者療程均為48周，治療期間進(jìn)行隨訪，停藥后繼續(xù)隨訪24周，共72周。治療期間定期檢測患者血常規(guī)、血生化與凝血功能等指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

臨床療效與安全性：分別于治療后24周、48周、72周時(shí)評價(jià)臨床療效，包括血常規(guī)、肝腎功能、HBVDNA載量、HBV兩對半等，記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)有無HBV DNA 陰轉(zhuǎn)（＜5×102copies／mL）、HBeAg陰轉(zhuǎn)與 ALT復(fù)常（≤40 U／L），以及治療期間有無不良反應(yīng)發(fā)生，包括發(fā)熱、乏力、肌肉與關(guān)節(jié)酸痛、脫發(fā)、PLT降低、腎功能損害等。

細(xì)胞免疫水平：分別于治療前，治療后24周、48周、72 周時(shí)檢測 T 淋巴細(xì)胞亞群，包括 CD3＋，CD4＋，CD8＋的表達(dá)情況，具體操作為在 0.1 mL全血中加入 20 μL三色熒光抗體，室溫靜置0.5 h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。并檢測T淋巴細(xì)胞組織中核仁組織區(qū)嗜銀蛋白（AgNORs）含量，具體操作為采集外周靜脈血8 mL，全血分離出淋巴細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖與染色，檢測并對圖像進(jìn)行分析[7]。

趨化因子水平：分別于治療前，治療后24周、48周、72周時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測外周血趨化因子 CXCL9，CXCL11，CCL20水平，試劑盒由伊萊瑞特生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，行 t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，然后進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料以率表示，行 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表2至表4。ADV組未出現(xiàn)1例不良反應(yīng)；干擾素組共出現(xiàn)28例（87.50%）不良反應(yīng)，包括23例發(fā)熱、乏力與肌肉關(guān)節(jié)酸痛，5例脫發(fā)；聯(lián)合組共出現(xiàn)26例（81.25%）不良反應(yīng)，包括20例發(fā)熱、乏力與肌肉關(guān)節(jié)酸痛，5例脫發(fā)，1例PLT一過性減少。均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，未影響繼續(xù)治療，全部完成規(guī)定療程。ADV組的不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于另兩組（P＜0.05）。

表2 3組患者各時(shí)間點(diǎn)臨床療效比較[例（%），n＝32]

表3 3組患者T淋巴細(xì)胞亞群分布與AgNORs含量比較（s，n＝32）

表3 3組患者T淋巴細(xì)胞亞群分布與AgNORs含量比較（s，n＝32）

注：與本組治療前相比， P ＜0.05；與干擾素組相比，aP ＜0.05；與聯(lián)合組相比，bP ＜0.05。表 4 同。

時(shí)間治療前治療后24周治療后48周治療后72周組別ADV組干擾素組聯(lián)合組2／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組2／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組2／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組2／F 值P值CD3＋(%)64.30 ± 10.60 65.10 ± 9.80 66.00 ± 10.20 0.55 0.58 66.80 ± 6.50 68.00 ± 6.10 69.80 ± 5.80 2.39 0.09 68.00 ± 5.90b 70.70 ± 6.20 72.20 ± 5.50 4.00 0.02 67.30 ± 6.60b 69.50 ± 6.00 71.30 ± 5.90 3.56 0.03 CD4＋(%)33.30 ± 7.80 34.00 ± 7.20 34.30 ± 7.60 0.33 0.71 35.10 ± 7.90 37.10 ± 8.50 38.30 ± 8.90 1.68 0.19 36.30 ± 8.60b 39.20 ± 9.00 41.60 ± 9.20 3.90 0.02 35.80 ± 8.20b 38.50 ± 8.30 41.10 ± 9.00 3.52 0.03 CD8＋(%)32.50 ± 7.60 31.80 ± 7.80 31.30 ± 8.00 0.20 0.81 30.30 ± 7.90 29.30 ± 7.50 28.10 ± 8.20 1.77 0.17 27.80 ± 8.50 25.50 ± 8.30 23.70 ± 8.60 2.78 0.06 28.30 ± 7.90 26.70 ± 7.80 24.30 ± 8.50 2.55 0.08 CD4＋ ／CD8＋1.03 ± 0.22 1.07 ± 0.20 1.10 ± 0.19 1.28 0.28 1.16 ± 0.26b 1.27 ± 0.26 1.36 ± 0.27 4.22 0.01 1.31 ± 0.36 ab 1.54 ± 0.33 b 1.76 ± 0.35 5.07 0.00 1.27 ± 0.37b 1.44 ± 0.35b 1.69 ± 0.40 4.81 0.01 AgNORs含量(%)4.08 ± 1.22 4.17 ± 1.36 3.98 ± 1.30 0.29 0.74 5.51 ± 1.28 5.78 ± 1.35 6.01 ± 1.43 1.11 0.33 6.92 ± 1.35b 7.33 ± 1.39 7.72 ± 1.43 3.39 0.03 6.49 ± 1.30 6.99 ± 1.33 7.15 ± 1.38 2.80 0.06

表 4 3組患者血趨化因子水平比較（s，pg／mL，n＝32）

表 4 3組患者血趨化因子水平比較（s，pg／mL，n＝32）

時(shí)間治療前治療后24周治療后48周治療后72周組別ADV組干擾素組聯(lián)合組t／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組t／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組t／F 值P值A(chǔ)DV組干擾素組聯(lián)合組t／F 值P值CXCL9 2 355.8 ± 92.6 2 365.8 ± 88.8 2 379.7 ± 95.6 1.01 0.36 1 619.0 ± 166.6 ab 1 516.8 ± 170.1 b 1 413.6 ± 155.8 6.81 0.00 1 173.3 ± 125.8 ab 1 086.8 ± 118.2 b 1 001.8 ± 109.7 9.55＜ 0.01 1 323.6 ± 131.8 ab 1 243.0 ± 120.8 b 1 166.9 ± 115.6 8.23＜ 0.01 CXCL11 218.9 ± 43.3 222.2 ± 45.6 232.6 ± 39.8 1.25 0.29 181.6 ± 33.9 b 170.3 ± 36.1 155.5 ± 32.3 3.65 0.03 155.0 ± 31.1 ab 136.9 ± 29.1 b 120.7 ± 25.5 7.00＜ 0.01 168.6 ± 33.9 ab 148.8 ± 30.6 b 131.3 ± 28.8 5.55＜ 0.01 CCL20 139.9 ±35.7 145.1 ± 38.2 142.0 ±40.1 0.66 0.51 111.8 ±36.7 b 99.7 ± 35.6 88.9 ±32.1 3.53 0.03 98.2 ±27.3 b 88.5 ± 28.1 b 72.9 ±26.7 4.33 0.01 101.6 ±32.1 b 91.8 ± 29.0 78.9 ± 27.8 3.99 0.02

3 討論

ADV聯(lián)合干擾素α－2b治療CHB是臨床常用治療方案，2種藥物各有優(yōu)缺點(diǎn)，有互補(bǔ)作用，療效顯著。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過48周完整的治療后，3組患者的整體療效較理想，ADV與干擾素 α－2b 2種藥物對CHB患者的生化學(xué)應(yīng)答效果均非常明顯，ALT復(fù)常率與兩者聯(lián)用后無明顯差異。ADV治療后患者的病毒學(xué)應(yīng)答效果顯著，但血清學(xué)應(yīng)答效果很差。與ADV相反，干擾素α－2b對CHB患者的血清學(xué)應(yīng)答效果較明顯，但病毒學(xué)應(yīng)答效果很差。兩者聯(lián)用后同時(shí)提高了病毒學(xué)與血清學(xué)應(yīng)答效果，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率、HBeAg陰轉(zhuǎn)率、HBeAb陽轉(zhuǎn)率均優(yōu)于單用藥物組患者，且停藥后能維持半年，三者的比例分別為93.8%，62.5%和53.1%，較停藥時(shí)無明顯降低，提示療效能在短期內(nèi)維持，不需要終身服藥，與以往研究結(jié)果[5]類似。但以往的研究并未觀察3個(gè)治療方案對CHB患者細(xì)胞免疫水平與趨化因子的表達(dá)差異。

人體內(nèi) T 細(xì)胞主要由 CD3＋，CD4＋，CD8＋3 個(gè)亞群組成，其亞群數(shù)量與比例是維護(hù)體內(nèi)細(xì)胞免疫穩(wěn)定的關(guān)鍵。目前認(rèn)為，乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)息息相關(guān)，其中T淋巴細(xì)胞起關(guān)鍵作用，具體表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群比例失調(diào)，是HBV在體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行復(fù)制的重要原因之一，在乙型肝炎慢性化過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體感染HBV后，體內(nèi)會出現(xiàn)特異性的T淋巴細(xì)胞，以此清除細(xì)胞內(nèi)病毒，當(dāng)發(fā)生急性自限性的HBV感染時(shí)，體內(nèi)有較強(qiáng)的特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。但對于CHB患者，其T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)較弱，甚至難以檢測到，故促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞免疫水平有助于控制疾病進(jìn)展，這也是當(dāng)前抗病毒藥物的藥理作用機(jī)制之一。ADV是核酸類似物，其通過抑制HBV DNA的多聚酶來抑制病毒繁殖，且能誘導(dǎo)體內(nèi)干擾素的合成，增加NK細(xì)胞活力，刺激體內(nèi)免疫反應(yīng)，從而起到較強(qiáng)的抗病毒作用。體外注射干擾素不僅能抑制病毒的復(fù)制及病毒相關(guān)蛋白的表達(dá)，還能誘導(dǎo)體內(nèi)多種抗病毒蛋白的細(xì)胞因子合成，在抗病毒的同時(shí)還能起到調(diào)節(jié)免疫的作用[8]。本研究結(jié)果表明，3 組患者治療后 CD3＋，CD4＋，CD4＋／CD8＋的比例逐漸升高，而CD8＋的比例逐漸降低。CD3＋T淋巴細(xì)胞代表總T淋巴細(xì)胞水平，CD4＋與 CD8＋T淋巴細(xì)胞代表了主要的T細(xì)胞亞群[9]，兩者直接參與了肝細(xì)胞的損傷，在乙型肝炎慢性化的過程中起到重要作用[10]。CD4＋／CD8＋比例也反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，本研究中經(jīng)過ADV、干擾素α－2b或兩者聯(lián)用治療后，該比值顯著升高，且聯(lián)用的效果顯著優(yōu)于單用。T細(xì)胞是一種免疫活性細(xì)胞，其細(xì)胞核的核仁由組成區(qū)構(gòu)成，早期研究已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中存在能被硝酸銀染色的物質(zhì)，不是RNA或DNA，而是一組酸性的嗜銀蛋白(AgNORs)，其作用是幫助DNA的轉(zhuǎn)錄，故其含量的高低能間接反映細(xì)胞內(nèi)核酸的活性，從而反映部分細(xì)胞的整體活性變化[11]。目前，臨床常通過檢測外周血的T淋巴細(xì)胞內(nèi)AgNORs的含量來判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組治療后外周血T淋巴細(xì)胞的AgNORs含量逐漸升高，且聯(lián)合組治療后48周的AgNORs含量顯著高于ADV組，而聯(lián)合組與干擾素組間無顯著差異。提示ADV與干擾素α－2b均能顯著提高CHB患者的細(xì)胞免疫水平，且干擾素α－2b的效果更強(qiáng)，兩者聯(lián)用效果最佳。

趨化因子是指一組能吸引免疫細(xì)胞移行到感染部位的小分子蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量多較低（8～10 kD），因其具有定向細(xì)胞趨化作用而得名，其在炎性反應(yīng)中具有重要作用。外周血的炎癥細(xì)胞募集到炎癥部位的過程主要包括2個(gè)步驟，首先由選擇素與整合素介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮，然后由趨化因子結(jié)合炎癥細(xì)胞表面的受體，從而介導(dǎo)該細(xì)胞定向遷移到炎癥部位。HBV感染能通過上調(diào)外周血清中趨化因子的表達(dá)水平來促進(jìn)T細(xì)胞活化，活化后的T細(xì)胞經(jīng)特異受體識別遷移至肝臟，實(shí)現(xiàn)減輕肝臟組織因?qū)笻BV而引起的炎性反應(yīng)，同時(shí)清除進(jìn)入人體的HBV病毒。在急性病毒性肝炎中，淋巴細(xì)胞被趨化因子募集至肝臟，從而能輔助病毒的清除。但CHB患者淋巴細(xì)胞的募集卻是致病因素之一，因?yàn)槌掷m(xù)的慢性肝炎可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化。已有研究顯示，機(jī)體對HBV的免疫耐受與免疫應(yīng)答低下是導(dǎo)致CHB的重要機(jī)制之一[12]，如趨化因子及其受體直接參與了淋巴細(xì)胞在肝組織內(nèi)募集，并使其在其靶區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)增殖和活化，HBV感染細(xì)胞后，能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面相關(guān)的趨化因子受體表達(dá)使淋巴細(xì)胞無法對其識別與清除[13]。本研究中檢測了所有患者治療前后外周血CXCL9，CXCL11，CCL20 3種趨化因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其均參與了HBV慢性感染患者的炎性反應(yīng)[14－16]，其中CXCL9被認(rèn)為是CHB患者干擾素治療效果的重要影響因素。國內(nèi)已有研究表明，血CXCL9的基線水平可作為干擾素治療效果的預(yù)測指標(biāo)，其表達(dá)水平較高者經(jīng)過聚乙二醇干擾素治療后病毒學(xué)應(yīng)答率較高，可能有利于指導(dǎo)慢性乙型肝炎患者的個(gè)體化用藥[17－18]。孟凡凡等[19]的研究表明，CHB患者血清CCL20水平顯著升高，是獨(dú)立于血清其他生化指標(biāo)之外的病情評估指標(biāo)。Xin等[20]也發(fā)現(xiàn)，慢性重型肝炎引起的肝功能衰竭患者的血CCL20水平顯著高于CHB患者。故認(rèn)為血CCL20水平與CHB的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究中3組患者治療后外周血CXCL9，CXCL11，CCL20水平均逐漸降低，且干擾素α－2b的效果優(yōu)于ADV，兩者聯(lián)用的效果最明顯，并能持續(xù)到停藥后半年，尤其是血CXCL9水平，干擾素α－2b的抑制效果最明顯。

綜上所述，與單用ADV和單用干擾素α－2b相比，ADV聯(lián)合干擾素α－2b能顯著提高CHB的臨床療效，增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性，抑制外周血 CXCL9，CXCL11，CCL20的水平。