富馬酸替諾福韋二吡呋酯中6種有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜測定方法改進(jìn)

程 誠，楊智慧

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

富馬酸替諾福韋二吡呋酯是美國Gilead Sciences公司研制的新型核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，臨床主要用于治療人類免疫缺陷病毒（HIV）感染[1－4]；同時可通過干擾乙型病毒型肝炎（簡稱乙肝）病毒DNA聚合酶的功能而抑制乙肝病毒的復(fù)制[5]，降低血清及肝組織內(nèi)的病毒載量。目前關(guān)于該藥的質(zhì)量分析已有研究報道[6－12]，有關(guān)物質(zhì)一般采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行檢測[13－15]。本研究中對該藥生產(chǎn)工藝中可能存在的 6種有關(guān)物質(zhì)對照品進(jìn)行收集和分析[16－18]，同時建立了采用HPLC法梯度洗脫測定該藥原料藥中6種有關(guān)物質(zhì)的方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS105型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

1.2 試藥

富馬酸替諾福韋二吡呋酯對照品（批號為G0M335，USP，純 度 為 98.4% ）；雜 質(zhì) C（批 號 為R044C0，USP，純 度 為 100.0% ）；雜 質(zhì) D（批 號 為10M090，USP，純度為 99.9% ）；雜質(zhì) E（批號為 1937 －020A7，TLC，純度為 100.0% ）；雜質(zhì) F（批號為 1508 －099A3，TLC，純 度 為 100.0% ）；雜 質(zhì) G（批 號 為R038N0，USP，純度為 98.0% ）；富馬酸對照品（批號為111541－201102，中國食品藥品檢定研究院，純度為99.4%）；富馬酸替諾福韋二吡呋酯樣品（石家莊龍澤制藥股份有限公司，批號分別為180101，180102，280201，純度均為99.8%）；甲醇、叔丁醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmery C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國 Waters公司）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；流動相：以甲醇 －0.05 mol／L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 5.0）－叔丁醇（15 ∶22 ∶3）為流動相 A，以甲醇 －0.05 mol／L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 5.0）－叔丁醇（30 ∶7 ∶3）為流動相 B，按表1條件進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液制備

雜質(zhì)對照品溶液：稱取富馬酸、雜質(zhì) E、雜質(zhì) F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D對照品適量，精密稱定，加入流動相A溶解并稀釋成各成分質(zhì)量濃度約為75 μg／mL的溶液，作為雜質(zhì)對照品貯備液；取該貯備液適量，用流動相A稀釋成各成分質(zhì)量濃度約為0.75 μg／mL的溶液，作為雜質(zhì)對照品溶液。

供試品溶液：取富馬酸替諾福韋二吡呋酯樣品，精密稱定，加流動相A溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 g／L的溶液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：稱取富馬酸、雜質(zhì) E、雜質(zhì) F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D與富馬酸替諾福韋二吡呋酯對照品適量，精密稱定，加入流動相A溶解并稀釋成各成分質(zhì)量濃度約為 0.75 μg／mL的溶液，進(jìn)樣測定。系統(tǒng)適用性試驗色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

專屬性試驗：為考察本色譜條件下主峰與各雜質(zhì)峰的分離情況，對該制劑進(jìn)行了酸（加1 mol／L鹽酸溶液1 mL）、堿（加 1 mol／L 氫氧化鈉溶液 1 mL）、高溫（105℃）、氧化（加30%過氧化氫1 mL）與光照（置光照度為4 500 lx環(huán)境）破壞性試驗，分別放置6 h后，按供試品溶液制備方法配制降解產(chǎn)物溶液后進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖2）。結(jié)果表明，本品在高溫、光照條件下較穩(wěn)定，氧化、酸、堿條件下稍有降解，主成分峰能與降解產(chǎn)物峰良好分離，方法專屬性良好，可用于該制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測。

圖2 專屬性試驗色譜圖

線性關(guān)系考察：取各雜質(zhì)對照品適量，分別配制成質(zhì)量濃度為 0.375，0.750，3.750，7.500，20.000 μg ／mL的系列溶液，各精密量取 10 μL，按 2.1項下色譜條件檢測，記錄色譜圖，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表 2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝5）

檢出限和定量限測定：取“線性關(guān)系考察”項下最低質(zhì)量濃度的對照品溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進(jìn)行檢測。信噪比（S／N）≥3時，富馬酸、雜質(zhì) D、雜質(zhì) E、雜質(zhì)F的檢出限為7.5 ng／mL，雜質(zhì)C和雜質(zhì)G的檢出限為0.15 μg／mL；S／N≥10 時，富馬酸、雜質(zhì)D、雜質(zhì) E、雜質(zhì)F的定量限為15 ng／mL，雜質(zhì)C和雜質(zhì)G的定量限為0.375 μg ／mL。

重復(fù)性試驗：依法配制供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件檢測，計算6份供試品溶液中富馬酸替諾福韋二吡呋酯主峰面積與稱樣量的比值（A／m），結(jié)果的RSD為0.79%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗：依法配制供試品溶液1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄富馬酸替諾福韋二吡呋酯主峰面積。結(jié)果的RSD為0.46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：依法配制供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果富馬酸替諾福韋二吡呋酯主峰面積的 RSD為0.63%（n＝5），同時沒有新雜質(zhì)產(chǎn)生，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗：依法配制供試品溶液，分別加入不同體積的雜質(zhì)對照品貯備液，配成含各雜質(zhì)質(zhì)量濃度分別為 0.75，1.00，1.50 μg／mL 的溶液，各平行配制 3 份，進(jìn)樣檢測，計算回收率。結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。試驗數(shù)據(jù)見表4?？梢?，3批樣品種富馬酸和雜質(zhì)E均有檢出，表明建立的檢測方法可有效控制富馬酸替諾福韋二吡呋酯的質(zhì)量。

3 討論

3.1 雜質(zhì)來源分析

分析富馬酸替諾福韋二吡呋酯合成生產(chǎn)工藝，確定了6種可能存在的有關(guān)物質(zhì)。富馬酸為成鹽過程的合成原料；雜質(zhì)C為替諾福韋，為合成中間體；雜質(zhì)D為腺嘌呤，為合成原料；雜質(zhì) E 為 9－[（R）－2－（羥基）（異丙氧基羰基）氧基]甲氧基]氧膦基]甲氧基]－丙基]腺嘌呤，是替諾福韋二吡呋酯脫去1個異丙氧基羰基氧基甲氧基的反應(yīng)副產(chǎn)物；雜質(zhì)F為替諾福韋二吡呋酯中的異丙氧基被乙氧基取代的副產(chǎn)物；雜質(zhì)G為替諾福韋二吡呋酯脫去一個甲氧基羰基氧基的副產(chǎn)物。可見，有必要對這6種雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。

表3 各雜質(zhì)回收率試驗結(jié)果（%，n＝9）

表4 3批樣品含量測定結(jié)果（%）

3.2 流動相及檢測波長選擇

富馬酸替諾福韋二吡呋酯和6種有關(guān)物質(zhì)在極性較大的有機(jī)溶劑中溶解度好，同時供試品中反應(yīng)起始物、中間體及副反應(yīng)產(chǎn)物共涉及6種成分，等度洗脫不易分離且檢測時間較長，最后采用反相色譜梯度洗脫進(jìn)行檢測，實現(xiàn)了良好的分離度和適當(dāng)?shù)臋z測時間。對富馬酸替諾福韋二吡呋酯供試品和6種有關(guān)物質(zhì)的溶液進(jìn)行全波長紫外掃描，結(jié)果顯示，檢測波長為260 nm時可采用外標(biāo)法有效地對該6種有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行限量檢測。

3.3 方法評價

本試驗中建立的測定富馬酸替諾福韋二吡呋酯中6種有關(guān)物質(zhì)的HPLC梯度洗脫法，操作簡單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可有效控制該制劑原料藥的質(zhì)量，同時也為該藥相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供了參考。